Name: Preparación de las muestras MALDI homogéneo para aplicaciones cuantitativas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a preparar muestras MALDI homogéneas controlando la temperatura del sustrato durante el secado. Este método reduce la heterogeneidad espacial de señales iónicas y mejora la fiabilidad de los resultados en espectrometría de masas.

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Este trabajo cuenta con el apoyo del Centro de Investigación Genómica, la Academia Sinica y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán, República de China (Contrato No. 104-2119-M-001-014).

NOTA: Este protocolo se ha desarrollado para la reducción de la heterogeneidad espacial de fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada con el método de la gota se seca. El protocolo consta de tres pasos principales, incluyendo la preparación y acondicionamiento previo, la deposición de la muestra y secado, y el análisis de los datos de espectrometría de masas. Los procedimientos se describen y se describen en más detalle a continuación: 1. Preparación y acondicionamiento previo <ol><li> Limpieza de la placa de muestras <ol><li> Use guantes de nitrilo y de la mano-lavar la placa de la muestra suavemente con detergente y agua destilada-desionizada (DDW). </li><li> Enjuague la placa de la muestra con metanol (MeOH) y DDW. </li><li> Inserte la placa de muestra en un vaso de 600 ml y se llenan de DDW. </li><li> Sonicar la placa de muestra en DDW durante 15 minutos en un baño de ultrasonidos (200 W, 40 kHz). </li><li> Retire DDW del vaso y llenar el vaso de precipitado con MeOH. </li><li> Sonicar la placa de muestra en MeOH durante 15 minutos en el baño de ultrasonidos (200 W, 40 kHz). </li><li> Soplar las gotas de disolvente en el plato con gas nitrógeno y mantener la placa de muestra seca antes de la deposición de la muestra. </li></ol></li><li> Regulación de la temperatura cámara de secado NOTA:. La cámara de secado se encuentra a 35 x 20 x 45 cm 3 (W x D x H) acrílico cámara de la figura 1 se muestra la imagen de este sistema de secado. La cámara se purga con gas nitrógeno temperatura ambiente a través de un medidor de flujo de gas a un caudal constante para mantener una condición de baja humedad relativa controlada por un higrómetro calibrado instalado dentro de la cámara de secado. Un bloque a base de cobre en la cámara de secado equipado con un dispositivo de circulación de agua a temperatura constante programada se utiliza para alojar placas de muestra de acero inoxidable. El bloque de base de cobre es capaz de regular la temperatura de la placa de muestra de 5 a 25 ° C. Las temperaturas del aire, bloque a base de cobre, y la placa de muestra son controlados por termopares de tipo K. <ol><li> Abra la puerta y rápidamente poner la placa de la muestra sobre el cobrebloque de base y cierre la puerta. </li><li> Para ajustar manualmente el medidor de flujo de gas para ajustar el caudal de nitrógeno a 10 pies cúbicos estándar por hora (SCFH). </li><li> Controlar la humedad relativa en la cámara de secado por el higrómetro y afinar el medidor de flujo de gas para asegurar la humedad relativa es siempre por debajo de 25%. </li><li> Controlar la temperatura de la placa de la muestra mediante termopares de tipo K y ajustar la temperatura de recirculación de agua manualmente hasta que la placa de la muestra alcanza los 5 ° C durante el experimento o la temperatura ambiente (25 ° C) para el control. NOTA: A fin de estabilizar la placa de muestra a una temperatura diseñado, la temperatura de recirculación de agua se fija típicamente 0-5 ° C más baja que la muestra diseñada. Por ejemplo, para mantener la 5 ° C en la placa de muestra, el ajuste de temperatura de la bomba de circulación de agua está en el intervalo de 0 a 2 ° C; para mantener la placa de muestra a 25 ° C, el ajuste de temperatura de la circulación de agua que se encuentra en el rango de 23 a 25 ° C. </li><li> Asegúrese de que las temperaturas requeridas y la humedad relativa se alcanzan (Tabla 1) antes de la deposición de la muestra. NOTA: Todos los parámetros, así como sus valores de ajuste para los procesos de secado con diferentes temperaturas de la placa de muestra se muestran en la Tabla 1. NOTA: A una temperatura baja placa de la muestra, la condensación de agua en el plato de la muestra puede ocurrir si la puerta de la cámara está abierta durante mucho tiempo. Si se produce condensación de agua, cierre la puerta y NO deposite cualquier muestra en ella hasta que la condensación de agua se seca. </li></ol></li><li> Preparación de la matriz y el analito Soluciones <ol><li> Preparación de las soluciones de la matriz <ol><li> Preparar una solución 0,1 M THAP con un 50% de acetonitrilo (ACN): DDW solución acuosa al 50%. </li></ol></li><li> Preparación de analitos <ol><li> Preparar 10 -4 M solución maltotriosa con DDW. </li><li> Preparar 10 -5 fragmento bradiquinina M (1-7) en solución de 50% de acetonitrilo(ACN): 50% de solución acuosa DDW. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Deposición de la muestra y de secado <ol><li> Premezcla de 0,25 l de solución THAP 0,1 M y 0,25 l de 10 -4 M maltotriosa o fragmento de la bradicinina 10 -5 M (1-7) soluciones en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Vortex la solución mixta durante 3 s. </li><li> Centrifugar la solución mixta de 2 seg (2.000 xg) para recoger la solución en la parte inferior del tubo de centrífuga. </li><li> Abra la puerta de la cámara de secado, cuidadosamente depositar 0,1 l de la solución en la placa de muestra con la pipeta y cerrar la puerta inmediatamente. </li><li> Espere a que la gota de muestra se seque. . NOTA: Los tiempos de secado normalmente observadas con diferentes temperaturas de placa de muestra se enumeran en la Tabla 1 para la temperatura del plato de muestra de 5 ° C, el tiempo medio de secado es de 800 a 1.000 seg; para la temperatura de la placa muestra de 25 ° C, el tiempo medio de secado es de 100 a 150 sCE. </li><li> Después del secado, abrir la puerta de la cámara de secado. </li><li> Ajuste la temperatura de recirculación de agua a temperatura ambiente (25 ° C). NOTA: Omita este paso si la placa de muestra se mantiene constante a temperatura ambiente (25 ° C) durante el proceso de secado. </li><li> Después de que las muestras que la temperatura de la placa a temperatura ambiente (25 ° C), retire la placa de la muestra de la cámara de secado. </li><li> Examinar la morfología de la muestra bajo un microscopio estereoscópico 5X y tomar la imagen de campo brillante de una instantánea. NOTA: Si no son los esperados las morfologías de cristal, es necesario preparar una nueva muestra con el mismo procedimiento. Morfologías cristalinas típicas se muestran en los paneles superior de la Figura 2. Nota: en los casos con temperaturas de placa de muestra bajas, tales como 5 ° C, es importante calentar la placa de la muestra a la temperatura ambiente antes de sacarlo de la cámara de secado. Al depositar las muestras, NO mantener el SOLUTIO premezcladon en la punta de la pipeta durante 10 s. NO use la solución premezclada de nuevo después de depositar las muestras. Los paneles superiores de la Figura 2 muestran imágenes de campo brillante de muestras preparadas con diferentes temperaturas de la placa de la muestra. </li></ol> Análisis de Datos 3. Espectrometría de Masas <ol><li> La espectrometría de masas Adquisición de Datos NOTA: Después de la preparación, la muestra puede analizarse mediante espectrometría de masas de imagen. En el estudio actual, los MS experimentos de imagen se llevan a cabo usando una transferencia sincronizada TOF-doble polaridad de laboratorio construido (DP-TOF) espectrómetro de masas de imágenes. 15 espectrómetros de masas MALDI-TOF comercial con capacidad de imagen también son adecuados para tales experimentos. El espectrómetro de masas se utiliza en la extracción lineal y modos de iones positivos con retrasos de extracción optimizado. La energía cinética de los iones es 20 kV. El tamaño del haz de láser es de 35 micras de diámetro en la superficie de la muestra, y el espectro de cada punto es el avela rabia de 5 disparos de láser. <ol><li> Inserte la placa de muestra en el espectrómetro de masas MALDI. </li><li> Realizar análisis de imagen espectrometría de masas para la muestra preparada en los pasos 2.1-2.9. </li><li> Seleccionar un pico de masa característicos de la lista de masas se muestra en la ventana de resultados y haga clic en &quot;2D&quot; para trazar una imagen de iones de dos dimensiones. NOTA: Para maltotriosa mezclado con THAP, los picos característicos son sodiated maltotriosa, THAP protonada, y sodiated THAP. Para fragmento de bradicinina (1-7) mezclado con THAP, los picos característicos incluyen el fragmento de la bradicinina (1-7), protonado THAP protonadas y sodiated THAP. </li><li> Haga clic en los botones de ajuste en la ventana emergente para determinar los límites superior e inferior de la intensidad de la señal y haga clic en &quot;guardar una imagen&quot;. Este ajuste define el contraste de las imágenes de iones. NOTA: En cada conjunto individual de datos, las regiones agrietados y los puntos nulos muestran bajo brillo se eliminan. </li><li> Observar y comparar el ionimagen de la imagen de campo brillante que fue tomada en el paso 2.9 con. NOTA: Imágenes espectrometría de masas y construcción de imágenes de iones particulares se puede lograr con instrumentos comerciales. Debido a la variedad de adquisición de datos y software de análisis, los usuarios deben seguir las instrucciones de software proporcionados por el proveedor de instrumento para obtener imágenes de alta calidad. </li></ol></li><li> Análisis de los datos NOTA: La heterogeneidad de las muestras se analizó cuantitativamente. En esta demostración, cada muestra se divide en varias zonas concéntricas de software de desarrollo propio para analizar la distribución espacial de los iones. El análisis también se puede realizar utilizando software de análisis de datos independiente. <ol><li> Haga clic en los puntos nulos y las regiones agrietados la imagen de iones se muestra en la ventana de resultados en extirpar las áreas sin importancia. NOTA: Este procedimiento define el área esencial de la imagen de iones. </li><li> Haga clic en el botón &quot;borde buscar&quot; para encontrar la mayor capa de la imagen de iones. </li><li> Haga clic en &quot;deducir&quot; para guardar la información de la abundancia de iones de la capa más externa de una base de datos y eliminar esta capa de la imagen de iones de forma simultánea. Una casilla de verificación que representa esta capa más externa aparecerá en la lista de &quot;datos de salida&quot; de la ventana de resultados. </li><li> Repita los pasos 3.2.2 y 3.2.3 hasta que se defina el centro de la imagen de iones. </li><li> Haga clic y seleccionar todas las casillas de verificación en la lista de &quot;datos de salida&quot; y haga clic en &quot;Exportar&quot; para exportar los datos. </li><li> Abra los datos exportados utilizando el software de hoja de cálculo para calcular el promedio de abundancia de iones de cada capa para obtener la información de la distribución espacial de los iones. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
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<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

En base a las predicciones teóricas anteriores, los flujos hidrodinámicos inducidos por la temperatura dentro de las gotitas hacia el exterior pueden superar los flujos capilares inducidas por evaporación del disolvente. La eficiencia de tales recirculación interna de las moléculas es mayor cuando la temperatura de los gradientes dentro de un aumento de las gotitas. De acuerdo con los resultados predichos, cuando manteniendo la temperatura de la placa muestra bajo 5 ° C mientras se mantiene el entorno a la temperatura a...

La espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas analíticas más importantes para analizar las composiciones moleculares de muestras complejas. Entre todos los métodos de ionización utilizados en la EM, la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) es el método más sensible y ampliamente utilizado en aplicaciones bioanalíticas. 1 En comparación con otras técnicas de ionización, MALDI tiene la mayor sensibilidad y alta tolerancia a los contaminantes salinos. Estas propiedades analíticas hacen de MALDI la primera opción para el análisis de carbohidratos y muchas aplicaciones proteómicas. Sin embargo, la preparación de la muestra es un paso crucial para obtener datos de alta calidad en MALDI-MS.
El método de preparación de muestras más utilizado para MALDI-MS es el método de gotas secas, en el que las gotas de muestra se depositan en una superficie y se secan en condiciones ambientales. Este método de secado es simple y generalmente efectivo. 2-5 Sin embargo, un problema común en el método de gotas secas es que los cristales de analito/matriz resultantes normalmente se distribuyen de manera irregular. En muchos casos, los cristales se agregan en la periferia de las áreas de la muestra, lo que da lugar a la llamada formación de tinción de anillo. 6-8 Las morfologías heterogéneas de los cristales afectan a la distribución espacial de las moléculas de analito, lo que da lugar a una grave fluctuación de la señal iónica en las áreas de la muestra. Estas fluctuaciones graves de la señal y la escasa reproducibilidad de los datos se conocen como el problema del "punto óptimo" en MALDI-MS. 9 Por lo tanto, existe una gran necesidad de reducir las heterogeneidades espaciales en las aplicaciones de gotas secas MALDI-MS.
Los flujos hidrodinámicos en la gota de muestra juegan un papel importante en la determinación de la distribución espacial de las muestras preparadas con el método de gota seca. 10-12 Se encontró que la evaporación del solvente induce flujos capilares hacia afuera dentro de las gotas, que son responsables de la formación de manchas en anillo. 7,10 Por el contrario, los flujos de recirculación inducidos por gradientes tangenciales de tensión superficial pueden contrarrestar los flujos capilares hacia el exterior. 13 Si las velocidades del flujo de recirculación son mayores que las de los flujos capilares hacia afuera, las muestras pueden redistribuirse de manera eficiente para reducir el problema de heterogeneidad. 14
En este trabajo, demostramos un protocolo detallado para preparar muestras con una cámara de secado simple para inducir flujos de recirculación eficientes durante los procesos de secado por gotas. Las condiciones de secado de las gotas se controlan con precisión, incluidas las temperaturas de la placa de muestra y sus alrededores, y la humedad relativa dentro de la cámara. Los analitos modelo incluyen maltotriosa y cadena de bradicinina (1-7). La matriz utilizada para la demostración es 2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP). Las muestras se examinan con MS de tiempo de vuelo (TOF) y los datos se analizan cuantitativamente para mostrar la reducción de la heterogeneidad.

<table><tbody><tr><td><reactivo fuerte>reactivo</detergente fuerte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>polvo Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de bradicinina (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotriosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q purificación de agua sistema</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo sin polvo</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 600 ml</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Higrómetro</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Caudalímetro de gas nitrógeno</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>Tipo K termopares</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de secado con temperatura controlable</td><td>este laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas de imágenes de tiempo de vuelo sincronizado de doble polaridad (DP-TOF IMS)</td> <td>este laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de muestra de acero inoxidable MALDI-TOF</td><td>este laboratorio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de las muestras maldi homogéneo para aplicaciones cuantitativas

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Este protocolo demuestra una preparación de muestra simple para reducir la heterogeneidad espacial en las señales de iones durante la espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). La heterogeneidad de las señales iónicas es un problema grave en MALDI, lo que da lugar a una escasa reproducibilidad de los datos y hace que MALDI sea inadecuado para el análisis cuantitativo. Al regular la temperatura de la placa de muestra durante la preparación de la muestra, los flujos hidrodinámicos inducidos térmicamente dentro de las gotas de solución de muestra pueden reducir el problema de heterogeneidad. Una cámara de preparación de muestras a temperatura ambiente equipada con un bloque base de cobre regulado por temperatura que sostiene placas de muestra MALDI facilita el control preciso de las condiciones de secado de la muestra. Después del secado de las gotas de muestra, la temperatura de las placas de muestra se devuelve a temperatura ambiente y se retira de la cámara para su posterior análisis por espectrometría de masas. Las áreas de las muestras se examinan con espectrometría de masas MALDI para obtener la distribución espacial de todos los componentes de la muestra. En comparación con el método convencional de gotas secas que prepara muestras en condiciones ambientales sin control de temperatura, las muestras preparadas con el método demostrado en este documento muestran una distribución espacial e intensidad de señal significativamente mejores. De acuerdo con las observaciones realizadas con muestras de carbohidratos y péptidos, la disminución de la temperatura del sustrato mientras se mantiene el entorno a temperatura ambiente durante el proceso de secado puede reducir eficazmente la heterogeneidad de las señales iónicas. Este método es generalmente aplicable a varias combinaciones de muestras y matrices.

Las imágenes de campo brillante, así como las imágenes de EM de fragmento de maltotriosa y bradiquinina (1-7) preparada con temperatura de la placa de muestra de 5 y 25 ° C se muestran en la Figura 1. En el caso de maltotriosa sodiated, la señal de ion principalmente puebla en la periferia de la zona de la muestra cuando se prepara con una temperatura de la placa de muestra de 25 ° C. Al disminuir la temperatura de la placa de la muestra a 5 ° C, la señal rellena de form...

Un protocolo para la reducción de las heterogeneidades espaciales de las señales de iones en la espectrometría de masas MALDI mediante la regulación de la temperatura del sustrato durante el proceso de secado de la muestra se demuestra.

Preparación de las muestras MALDI homogéneo para aplicaciones cuantitativas

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

El objetivo general de este método de preparación de muestras para la MS MALDI es reducir la heterogeneidad espacial en las señales iónicas durante la MS MALDI. Se creó un entorno de secado bien controlado para optimizar el método convencional de gota seca, manipulando los flujos hidrodinámicos dentro de la gota de muestra durante el proceso de secado. La principal ventaja de esta técnica es que puede reducirse eficazmente la heterogeneidad espacial de las señales iónicas para la muestra preparada mediante el método de gota seca optimizado. Aunque este método puede proporcionar muestras homogéneas para el sistema métrico THAP.También puede aplicarse a otros sistemas métricos, como el ácido alfa-ciano-4-hidroxiciánico. Por lo general, las personas nuevas en este método han tenido dificultades porque no es fácil controlar las condiciones de secado. Para comenzar este procedimiento, abra la puerta de una cámara de secado y coloque inmediatamente una placa de muestra previamente limpiada sobre el bloque de base de cobre.Luego, cierre la puerta. Ajuste manualmente el medidor de flujo de gas para establecer el caudal de nitrógeno en 10 pies cúbicos estándar por hora. A continuación, ajuste finamente el medidor de flujo de gas para asegurar que la humedad relativa siempre esté por debajo del 25 % en la cámara de secado, según lo mide un higrómetro.Utilizando termopares de tipo K para monitorear la temperatura, ajuste manualmente la temperatura del circulador de agua hasta que la placa de muestra alcance 5 grados Celsius para el experimento. Asegúrese de que se alcancen las temperaturas requeridas y la humedad relativa antes de la deposición de la muestra. Mezcle 0,25 microlitros de solución de THAP 0,1 Molar y 0,25 microlitros del analito deseado en un tubo de microcentrifugado.Vortex la muestra durante tres segundos. Luego, centrifugue la muestra durante dos segundos para recoger la solución en el fondo del tubo de microcentrifugación. Tras la centrifugación, abra la puerta de la cámara de secado y deposite cuidadosamente 0.1 microlitros de la solución en la placa de muestra con una pipeta.Cierre la puerta inmediatamente y espere a que la gota de muestra se seque por completo. Cuando se mantiene la temperatura de la placa de muestra más baja que la del entorno, la velocidad media de los flujos de recirculación dentro de la gota aumenta significativamente para redistribuir las moléculas. La deposición de la muestra es el paso más crítico que determina la calidad y la reproducibilidad de los datos.La solución de muestra premezclada debe depositarse inmediatamente sobre la placa de muestra para garantizar que la muestra se cristalice bajo condiciones controladas. Después del secado, abra la puerta de la cámara de secado.A continuación, ajuste la temperatura del circulador de agua a 25 grados Celsius. Una vez que la temperatura de la placa de muestra regrese a 25 grados Celsius, retire la placa de muestra de la cámara de secado. Examine la morfología de la muestra bajo un microscopio estereoscópico con cinco veces de aumento y tome una imagen de campo brillante.En este momento, inserte la placa de muestras en un espectrómetro de masas MALDI. Luego, realice el análisis de espectrometría de masas por imágenes. Seleccione un pico de masa característico de la lista de masas mostrada en la ventana de resultados y haga clic en 2D para trazar una imagen iónica bidimensional.A continuación, haga clic en los botones de ajuste de la ventana emergente para determinar los límites superior e inferior de la intensidad de la señal, aumentar la resolución de la imagen y haga clic en guardar una imagen. Observe y compare la imagen iónica con la imagen de campo brillante adquirida previamente para obtener la región esencial de la muestra. Ahora, haga clic en los puntos nulos y las regiones agrietadas en la imagen iónica mostrada en la ventana de resultados para ajustar finamente la región que se analizará.Haga clic en el botón encontrar borde para identificar la capa más externa de la imagen iónica. A continuación, haga clic en deducir para guardar la información de abundancia iónica de la capa más externa en una base de datos y eliminar simultáneamente esta capa de la imagen iónica. Después de repetir los pasos anteriores hasta que se defina el centro de la imagen iónica, haga clic, seleccione todas las casillas de la lista de datos de salida y haga clic en exportar para exportar los datos.Finalmente, abra los datos exportados utilizando software de hoja de cálculo para calcular la abundancia media de iones de cada capa y obtener la información de distribución espacial de los iones. En las imágenes de campo claro y MALDI de maltotriosa, la señal iónica de la forma sodiada se localiza principalmente en la periferia del área de la muestra cuando se prepara con una temperatura de la placa de muestra de 25 grados Celsius. Al disminuir la temperatura a cinco grados Celsius, la señal se distribuye homogéneamente en toda el área de la muestra, lo que sugiere que la preparación de muestras a una temperatura más baja de la placa de muestra puede redistribuir significativamente las moléculas y reducir la heterogeneidad.La imagen del ion fragmento de bradicinina protonada muestra una tendencia similar a la de la maltotriosa sodiada. Los análisis estadísticos muestran que la heterogeneidad de las señales iónicas obtenidas con una temperatura de la placa de muestra de 5 grados Celsius se reduce entre un 60 y un 80 por ciento en comparación con la observada a 25 grados Celsius. En el caso de la maltotriosa sodiada, con una temperatura de la placa de muestra de 25 grados Celsius, las intensidades de señal en los centros son mucho más bajas que aquellas obtenidas con una temperatura de 5 grados Celsius.El fragmento de bradiquinina protonado muestra menos variación al disminuir la temperatura de la placa de muestra de 25 a 5 grados Celsius. Al intentar este método de secado, es necesario controlar y monitorear cuidadosamente las temperaturas y la humedad relativa dentro de la cámara de secado. Una vez dominado, una muestra preparada mediante esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la MS con MALDI exploraran el análisis cuantitativo de muestras en gota seca. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras homogéneas en gota seca para el análisis mediante MS con MALDI.

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