Preparación de las muestras MALDI homogéneo para aplicaciones cuantitativas

El objetivo general de este método de preparación de muestras para la MS MALDI es reducir la heterogeneidad espacial en las señales iónicas durante la MS MALDI. Se creó un entorno de secado bien controlado para optimizar el método convencional de gota seca, manipulando los flujos hidrodinámicos dentro de la gota de muestra durante el proceso de secado. La principal ventaja de esta técnica es que puede reducirse eficazmente la heterogeneidad espacial de las señales iónicas para la muestra preparada mediante el método de gota seca optimizado. Aunque este método puede proporcionar muestras homogéneas para el sistema métrico THAP.

También puede aplicarse a otros sistemas métricos, como el ácido alfa-ciano-4-hidroxiciánico. Por lo general, las personas nuevas en este método han tenido dificultades porque no es fácil controlar las condiciones de secado. Para comenzar este procedimiento, abra la puerta de una cámara de secado y coloque inmediatamente una placa de muestra previamente limpiada sobre el bloque de base de cobre.

Luego, cierre la puerta. Ajuste manualmente el medidor de flujo de gas para establecer el caudal de nitrógeno en 10 pies cúbicos estándar por hora. A continuación, ajuste finamente el medidor de flujo de gas para asegurar que la humedad relativa siempre esté por debajo del 25 % en la cámara de secado, según lo mide un higrómetro.

Utilizando termopares de tipo K para monitorear la temperatura, ajuste manualmente la temperatura del circulador de agua hasta que la placa de muestra alcance 5 grados Celsius para el experimento. Asegúrese de que se alcancen las temperaturas requeridas y la humedad relativa antes de la deposición de la muestra. Mezcle 0,25 microlitros de solución de THAP 0,1 Molar y 0,25 microlitros del analito deseado en un tubo de microcentrifugado.

Vortex la muestra durante tres segundos. Luego, centrifugue la muestra durante dos segundos para recoger la solución en el fondo del tubo de microcentrifugación. Tras la centrifugación, abra la puerta de la cámara de secado y deposite cuidadosamente 0.1 microlitros de la solución en la placa de muestra con una pipeta.

Cierre la puerta inmediatamente y espere a que la gota de muestra se seque por completo. Cuando se mantiene la temperatura de la placa de muestra más baja que la del entorno, la velocidad media de los flujos de recirculación dentro de la gota aumenta significativamente para redistribuir las moléculas. La deposición de la muestra es el paso más crítico que determina la calidad y la reproducibilidad de los datos.

La solución de muestra premezclada debe depositarse inmediatamente sobre la placa de muestra para garantizar que la muestra se cristalice bajo condiciones controladas. Después del secado, abra la puerta de la cámara de secado.

A continuación, ajuste la temperatura del circulador de agua a 25 grados Celsius. Una vez que la temperatura de la placa de muestra regrese a 25 grados Celsius, retire la placa de muestra de la cámara de secado. Examine la morfología de la muestra bajo un microscopio estereoscópico con cinco veces de aumento y tome una imagen de campo brillante.

En este momento, inserte la placa de muestras en un espectrómetro de masas MALDI. Luego, realice el análisis de espectrometría de masas por imágenes. Seleccione un pico de masa característico de la lista de masas mostrada en la ventana de resultados y haga clic en 2D para trazar una imagen iónica bidimensional.

A continuación, haga clic en los botones de ajuste de la ventana emergente para determinar los límites superior e inferior de la intensidad de la señal, aumentar la resolución de la imagen y haga clic en guardar una imagen. Observe y compare la imagen iónica con la imagen de campo brillante adquirida previamente para obtener la región esencial de la muestra. Ahora, haga clic en los puntos nulos y las regiones agrietadas en la imagen iónica mostrada en la ventana de resultados para ajustar finamente la región que se analizará.

Haga clic en el botón encontrar borde para identificar la capa más externa de la imagen iónica. A continuación, haga clic en deducir para guardar la información de abundancia iónica de la capa más externa en una base de datos y eliminar simultáneamente esta capa de la imagen iónica. Después de repetir los pasos anteriores hasta que se defina el centro de la imagen iónica, haga clic, seleccione todas las casillas de la lista de datos de salida y haga clic en exportar para exportar los datos.

Finalmente, abra los datos exportados utilizando software de hoja de cálculo para calcular la abundancia media de iones de cada capa y obtener la información de distribución espacial de los iones. En las imágenes de campo claro y MALDI de maltotriosa, la señal iónica de la forma sodiada se localiza principalmente en la periferia del área de la muestra cuando se prepara con una temperatura de la placa de muestra de 25 grados Celsius. Al disminuir la temperatura a cinco grados Celsius, la señal se distribuye homogéneamente en toda el área de la muestra, lo que sugiere que la preparación de muestras a una temperatura más baja de la placa de muestra puede redistribuir significativamente las moléculas y reducir la heterogeneidad.

La imagen del ion fragmento de bradicinina protonada muestra una tendencia similar a la de la maltotriosa sodiada. Los análisis estadísticos muestran que la heterogeneidad de las señales iónicas obtenidas con una temperatura de la placa de muestra de 5 grados Celsius se reduce entre un 60 y un 80 por ciento en comparación con la observada a 25 grados Celsius. En el caso de la maltotriosa sodiada, con una temperatura de la placa de muestra de 25 grados Celsius, las intensidades de señal en los centros son mucho más bajas que aquellas obtenidas con una temperatura de 5 grados Celsius.

El fragmento de bradiquinina protonado muestra menos variación al disminuir la temperatura de la placa de muestra de 25 a 5 grados Celsius. Al intentar este método de secado, es necesario controlar y monitorear cuidadosamente las temperaturas y la humedad relativa dentro de la cámara de secado. Una vez dominado, una muestra preparada mediante esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la MS con MALDI exploraran el análisis cuantitativo de muestras en gota seca. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras homogéneas en gota seca para el análisis mediante MS con MALDI.