El concepto Terroir interpretada a través de baya de la uva metabolómica y transcriptómica

El objetivo general de estos procedimientos experimentales es observar las diferentes firmas de terroir en el metaboloma y transcriptoma de la baya de la variedad de vid Corvina. El estudio de caso descrito aquí incluyó la recolección y el análisis de muestras en tres etapas de maduración procedentes de siete viñedos en tres zonas macroclimáticas durante tres campañas de cultivo. Las técnicas descritas revelan el efecto predominante de la cosecha sobre el metaboloma de la baya.

Asimismo, se identificaron firmas químicas específicas claras que representan las tres zonas macro en las bayas maduras. La firma de terroir a nivel de zona macro se reveló mediante técnicas estadísticas adecuadas, como el ACP, que es el análisis de componentes principales, y el auto BLSDA, que es la proyección ortogonal bidireccional a estructuras plomizas, análisis discreto, para analizar tanto la matriz de datos transcriptómicos como metabólómicos. Por otro lado, las diferencias entre viñedos individuales son más sutiles y también requieren enfoques estadísticos más sofisticados y sensibles.

Comience el experimento elaborando un plan de muestreo adecuado. Asegúrese de que el plan de muestreo indique los lugares y momentos de muestreo, así como el procedimiento de muestreo preciso. Después de recolectar 30 racimos de diferentes posiciones a lo largo de dos hileras de vid, seleccione tres bayas al azar de cada racimo, evitando aquellas con daño visible o signos de infección.

Repita este proceso para obtener tres grupos independientes para cada etapa de maduración. Elimine las semillas de las bayas y congele inmediatamente el pericarpio en nitrógeno líquido. Triture todas las bayas congeladas de cada grupo con un molino automático.

Divida cada muestra en polvo en dos partes iguales, una para análisis de transcriptómica y otra para análisis de metabolómica. Luego, cierre y retire el duer, y almacene los polvos a menos 80 grados Celsius. Prepare los extractos metabólicos de las muestras de bayas a temperatura ambiente en tres volúmenes de metanol, acidificados con ácido fórmico al 0,1%, en un baño ultrasónico a 40 kilohercios durante 15 minutos.

Centrifugar los extractos a 16.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Diluir el sobrenadante en dos volúmenes de agua desionizada y filtrar a través de un filtro de 0,2 micrones. Preparar la cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas, utilizando una fuente de ionización por spray eléctrico o un sistema HPLC-ESI-MS, como se describe en el protocolo del texto.

Realice la separación por HPLC con un gradiente lineal de los disolventes A y B a un flujo constante de 0,2 mililitros por minuto, utilizando un volumen de inyección de muestra de 30 microlitros. Adquiera espectros de masas en modos de ionización negativo y positivo alternos, con los parámetros indicados en el protocolo textual. Para procesar los datos de LC-MS, implemente los procedimientos de detección de picos, alineación, rellenado de brechas y filtrado de picos utilizando un software adecuado, como el software de código abierto M Zeta Mine, versión 2.14.

Importe los archivos de texto resultantes a una hoja de cálculo. Esto genera una matriz de datos en la que todos los metabolitos detectados, reconocidos por un número de identificación, un valor de relación masa/carga y un tiempo de retención, se cuantifican en todas las muestras en términos de sus valores de área del pico. Prepare el ensamblaje de hibridación según las especificaciones del formato de cuatro paquetes, colocando 1,65 microgramos de ARN complementario marcado con cianina en un volumen final de 41,8 microlitros de agua libre de ARNasas desionizada.

Añada 11 µL de agente bloqueante 10X y 2,2 µL de tampón de fragmentación 25X. Incube a 60 °C durante 30 minutos en un baño termostático para fragmentar el ARN. Transcurridos 30 minutos, enfríe inmediatamente en hielo durante un minuto.

Finalmente, agregue 55 microlitros de tampón de hibridación 2X y mezcle bien mediante pipeteo. Después de centrifugar durante un minuto a 15.500 ×g a temperatura ambiente, coloque inmediatamente el tubo de microcentrifugado sobre hielo. Para cargar el microarreglo personalizado, coloque una portaobjeto con junta, con la etiqueta hacia arriba, en la base de una cámara de hibridación.

Cargue lentamente 100 microlitros de la muestra de hibridación en cada pozo del sello, dispensando el líquido con la punta de una pipeta y evitando burbujas. Coloque lentamente el microarreglo personalizado hacia abajo, asegurándose de que el código de barras numérico quede orientado hacia arriba. Asegúrese de que el par en sándwich esté correctamente alineado.

Finalmente, coloque la tapa de la cámara de hibridación sobre los portaobjetos ensamblados y apriete manualmente la abrazadera en la cámara. Gire la cámara ensamblada para evaluar la movilidad de las burbujas. Coloque la cámara con los portaobjetos ensamblada en una rotisera equilibrada, dentro de un horno de hibridación ajustado a 65 grados celsius.

Configure el rotador para que gire a 10 RPM. Deje que la hibridación continúe durante 17 horas. Para continuar con el lavado del portaobjetos de microarreglo, prepare tres recipientes para tinción de portaobjetos y llénelos con los tampones de lavado adecuados.

Llene dos placas con tampón de lavado uno, a temperatura ambiente, y una placa con tampón de lavado dos precalentado. Desarme la cámara de hibridación y retire el sándwich. Con el código de barras numérico del portaobjetos de microarreglo hacia arriba, sumerja el sándwich en la primera placa de tinción llena con tampón de lavado uno a temperatura ambiente, y con la ayuda de pinzas limpias, separe la junta del portaobjetos de microarreglo.

Transfiera rápidamente la lámina de microarreglo a un porta-láminas y colóquela en el segundo recipiente para tinción lleno con tampón de lavado uno a temperatura ambiente. Coloque el recipiente para tinción sobre un agitador magnético y lave durante un minuto con agitación moderada. Transfiera rápidamente el porta-láminas al tercer recipiente para tinción, lleno con tampón de lavado dos precalentado, y lave durante un minuto con agitación moderada.

Retire lentamente la bandeja del recipiente para tinción de portaobjetos y extraiga cuidadosamente el portaobjetos de la bandeja, evitando gotas. Coloque el portaobjetos de microarreglo en un escáner adecuado y escanee cada matriz utilizando los ajustes de parámetros recomendados en el manual de instrucciones del fabricante del microarreglo. Para preparar el software de análisis estadístico, primero importe los datos de metabolómica y transcriptómica.

Vaya a Archivo, Nuevo Proyecto Regular, Nuevo Proyecto Regular, para importar la matriz de datos obtenida. Luego haga clic en Editar. Transponga toda la matriz, inicio, y asigne el ID primario y secundario adecuado. Y finalice.

Para realizar el análisis estadístico multivariado, acceda a la ventana del conjunto de trabajo, seleccione PCAX como tipo de modelo y haga clic en AutoFit. Seleccione Puntajes y luego Dispersión para ver el gráfico que muestra la posible agrupación de las muestras. Examine el gráfico de puntuaciones de PCA.

Si se obtiene un buen modelo, utilice las mismas clases de muestras para construir un modelo de análisis discriminante O2PLS. Para construir dos modelos de análisis discriminante O2PLS utilizando las muestras clasificadas por MacroZone, asigne las clases yendo a la ventana Inicio, Nuevo Como, M1 y Observaciones. Establezca las clases deseadas.

Luego, cambie el tipo de modelo de PCAX a análisis discriminante O2PLS. Pulse Ajuste automático. Continúe seleccionando M2 en la ventana del proyecto y haga clic en Puntuaciones y luego en Dispersión, para ver el gráfico y la posición de las clases de muestras.

Vaya a Seleccionar tipo de datos y seleccione Observaciones y Cargas. Luego haga clic en Agregar serie y seleccione los elementos correlación PQ uno y correlación PQ dos, u otros componentes si están presentes. Con el botón derecho del ratón presionado sobre el gráfico, vaya a Propiedades, seleccione Color y luego seleccione Por términos, para distinguir los símbolos del gráfico entre moléculas y clases.

Vaya a Diseño, Formato de gráfico, Acceso y/o Estilos para modificar el gráfico con las características deseadas. Para observar qué metabolitos caracterizan una o más clases específicas, vaya a Lista de gráficos y luego a Dispersión. El análisis exploratorio de toda la matriz de datos mediante ACP mostró que las muestras se agruparon según la etapa de maduración, incluyendo verasion, maduración media y maduro, a lo largo de los dos primeros componentes principales.

Las muestras se agruparon según la temporada de crecimiento a lo largo del tercer componente principal. El análisis discriminante O2PLS de bayas maduras permite la identificación de firmas específicas de terroir, representativas de las tres macrozonas: Valpolicella, Lago de Garda y Soave. Los gráficos de cargas de estos modelos se expresan como correlación PQ, la correlación entre P, la clase de muestras, y Q, los metabolitos.

En las gráficas de carga, los cuadrados rojos representan la clase de muestras o macrozonas, y los triángulos de colores representan los metabolitos individuales. Los metabolitos están codificados por colores según su clase química, y la distancia entre los metabolitos y las muestras refleja sus relaciones. La macrozona del lago Garda se caracterizó por estilbenos, mientras que Soave y Valpolicella se destacaron por flavonoides.

Dentro de las antocianinas, la peonidina y sus derivados fueron más prevalentes en la macrozona del lago Garda, mientras que las otras antocianinas fueron más prevalentes en la macrozona de Valpolicella. Además, las antocianinas tres-O-glucósidos fueron más prevalentes en la macrozona de Valpolicella, mientras que los derivados acilados y cumarilados fueron más prevalentes en la macrozona de Soave. La transcriptómica, el RA y los métodos de RNA sig permiten monitorear simultáneamente miles de transcritos de vid.

Recientemente se ha diseñado una nueva micromatriz personalizada que representa un número aún mayor de sondas, incluyendo especies adicionales recién descubiertas del género Vitis. Dada la rápida obsolescencia de las plataformas transcriptómicas, describimos un procedimiento alternativo que utiliza una nueva plataforma con más sondas que la anterior, incluyendo 249 transcritos predichos adicionales de peno, 1392 loci de peno recientemente identificados y 179 genes de corvina prava. El análisis metabolómico mediante HPLC-ESI-MS es lo suficientemente sensible como para detectar simultáneamente un gran número de metabolitos.

La capacidad de crear un plano de muestreo es fundamental. La elección de un único clon para minimizar las diferencias genéticas, junto con la duración múltiple del muestreo, permitió identificar las diferencias reales entre los terruños. Sería interesante comparar el mismo cultivar cultivado en zonas menos óptimas, pero desafortunadamente, estos viñedos no estaban disponibles.