El concepto Terroir interpretada a través de baya de la uva metabolómica y transcriptómica

El objetivo general de estos procedimientos experimentales es observar las diferentes firmas del terroir en el metaboloma y el transcriptoma de la baya del cultivar de vid Corvina. El estudio de caso descrito aquí involucró la recolección y análisis de muestras en tres etapas de maduración de siete viñedos en tres macrozonas durante tres temporadas de crecimiento. Las técnicas descritas revelan el efecto predominante de la maduración en la añada sobre el metaboloma de la baya.

También se identificaron firmas químicas específicas claras que representan las tres macrozonas en las bayas maduras. La firma del terroir a nivel de macro zona se reveló utilizando técnicas estadísticas adecuadas como el PCA, que es el análisis de componentes principales, y el auto BLSDA, que es la proyección ortogonal bidireccional a estructuras plomizas, análisis discreto, para analizar tanto la transcriptómica como la matriz de datos metabalomónica. Por otro lado, las diferencias entre los viñedos individuales son más sutiles y también requieren enfoques estadísticos más sofisticados y sensibles.

Comience el experimento desarrollando un plan de muestreo adecuado. Asegúrese de que el plan de muestreo indique los lugares de muestreo, las horas y el procedimiento de muestreo preciso. Después de cosechar 30 racimos desde diferentes posiciones a lo largo de dos hileras de vides, seleccione tres bayas al azar de cada racimo, evitando aquellas con daños visibles y/o signos de infección.

Repita este proceso para obtener tres piscinas independientes para cada etapa de maduración. Quite las semillas de las bayas y congele el pericarpio inmediatamente en nitrógeno líquido. Triture todas las bayas congeladas de cada piscina con un molinillo de molino automático.

Divida cada muestra en polvo en dos partes iguales, una para el análisis transcriptómico y otra para el análisis metabolómico. Luego, cierre y retire el duer, y almacene los polvos a menos 80 grados centígrados. Preparar los extractos metabólicos de las muestras de bayas a temperatura ambiente en tres volúmenes de metanol, acidificado con ácido fórmico al 0,1%, en un baño ultrasónico a 40 kilohercios durante 15 minutos.

Centrifugar los extractos a 16.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Diluir el sobrenadante en dos volúmenes de agua desionizada y pasarlo por un filtro de 0,2 micras. Configure la cromatografía líquida de alta resolución, acoplada a la espectrometría de masas, utilizando una fuente de ionización por electropulverización o un sistema HPLC-ESI-MS, como se describe en el protocolo de texto.

Ejecute la separación por HPLC con un gradiente lineal de disolventes A y B a un caudal constante de 0,2 mililitros por minuto, utilizando un volumen de inyección de muestra de 30 microlitros. Adquiera espectros de masas en modos alternos de ionización negativa y positiva, con los parámetros enumerados en el protocolo de texto. Para procesar los datos de LCMS, implemente los procedimientos de alineación de detección de picos, relleno de huecos y filtrado de picos utilizando un software adecuado, como el software de código abierto M Zeta Mine, versión 2.14.

Importe los archivos de texto resultantes en una hoja de cálculo. Esto produce una matriz de datos en la que todos los metabolitos detectados reconocidos por un número de identificación, un valor de relación masa-carga y un tiempo de retención se cuantifican en todas las muestras en términos de sus valores de área máxima. Preparar el ensamblaje de hibridación en base a especificaciones de formato de cuatro paquetes, colocando 1,65 microgramos de ARN complementario marcado con cianina, en un volumen final de 41,8 microlitros de agua libre de ARNasa desionizada.

Agregue 11 microlitros de agente bloqueador 10X y 2,2 microlitros de tampón de fragmentación 25X. Incubar a 60 grados centígrados durante 30 minutos en un baño termostático, para fragmentar el ARN. Después de 30 minutos, enfríe inmediatamente sobre hielo durante un minuto.

Por último, añadir 55 microlitros de tampón de hibridación 2X, y mezclar bien pipeteando. Después de girar durante un minuto a 15.500 veces g a temperatura ambiente, coloque rápidamente el tubo de microcentrífuga en hielo. Para cargar el micro-array personalizado, cargue una corredera de junta con la etiqueta hacia arriba, en la base de una cámara de hibridación.

Cargue lentamente 100 microlitros de muestra de hibridación en cada pocillo de junta, dispensando el líquido con la punta de una pipeta, evitando burbujas. Coloque lentamente el micro-array personalizado, boca abajo, asegurándose de que el código de barras numérico esté hacia arriba. Asegúrese de que el par de sándwiches esté alineado correctamente.

Finalmente, coloque la tapa de la cámara de hibridación en los portaobjetos intercalados y apriete a mano la abrazadera en la cámara. Gire la cámara ensamblada para evaluar la movilidad de las burbujas. Coloque la cámara de portaobjetos ensamblada en un asador equilibrado, en un horno de hibridación ajustado a 65 grados centígrados.

Configure el rotor para que gire a 10 RPM. Deje que la hibridación proceda durante 17 horas. Para proceder con el lavado de portaobjetos con microarrays, prepare tres platos para teñir portaobjetos y llénelos con los tampones de lavado adecuados.

Llene dos platos con el tampón de lavado uno, a temperatura ambiente, y un plato con el tampón de lavado precalentado dos. Desmonte la cámara de hibridación y retire el sándwich. Con el código de barras numérico del portaobjetos de micromatrices hacia arriba, sumerja el sándwich en el primer plato de tinción de portaobjetos lleno de tampón de lavado a temperatura ambiente y, con la ayuda de pinzas limpias, separe la junta del portaobjetos de micromatriz.

Transfiera rápidamente el portaobjetos de micro-array a una rejilla de portaobjetos y colóquelo en el segundo plato de tinción de portaobjetos lleno de tampón de lavado a temperatura ambiente. Coloque el plato para manchar el deslizamiento en un agitador magnético y lave durante un minuto con agitación moderada. Transfiera rápidamente la rejilla de portaobjetos al tercer plato para manchar portaobjetos, lleno de tampón de lavado precalentado dos, y lave durante un minuto con agitación moderada.

Retire lentamente la rejilla del plato que mancha el portaobjetos y retire con cuidado el portaobjetos de la rejilla, evitando las gotas. Coloque el portaobjetos de micromatriz en un escáner adecuado y escanee cada matriz utilizando la configuración de parámetros recomendada en el manual de instrucciones del fabricante de la matriz. Para preparar el software de análisis estadístico, primero importe los datos de metabolómica y transcriptómica.

Vaya a Archivo, Nuevo Proyecto Regular, Nuevo Proyecto Regular, para importar la matriz de datos obtenida. A continuación, haga clic en Editar. Transponga toda la matriz, inicio, y asigne el ID primario y secundario adecuado. Y finalice.

Para llevar a cabo el análisis estadístico multivariante, vaya a la ventana Conjunto de trabajo, seleccione PCAX como tipo de modelo y haga clic en Autoajuste. Seleccione Puntuaciones y, a continuación, Dispersión, para ver el gráfico que muestra la posible agrupación de las muestras. Inspeccione el gráfico de puntuación de PCA.

Si se obtiene un buen modelo, utilice las mismas clases de muestras para construir un modelo de análisis discriminante O2PLS. Para crear dos modelos de análisis discriminante O2PLS utilizando las muestras clasificadas por MacroZone, asigne las clases yendo a la ventana de inicio, Nuevo as, M1 y Observaciones. Establezca las clases deseadas.

A continuación, cambie el tipo de modelo de PCAX a análisis discriminante O2PLS. Presione Autofit. Proceda a Seleccionar M2 en la ventana Proyecto, y haga clic en Partituras, y luego en Dispersión, para ver el gráfico y la posición de las clases de muestra.

Vaya a Seleccionar tipo de datos y seleccione Observaciones y cargas. A continuación, haga clic en Agregar serie y seleccione los elementos PQ correlación uno y PQ correlación dos, o componentes adicionales cuando estén presentes. Con el botón derecho del ratón pulsado en la gráfica, vaya a Propiedad, seleccione Color y, a continuación, seleccione Por términos, para distinguir los símbolos de la gráfica entre moléculas y clases.

Vaya a Diseño, Formato de trazado, Acceso y/o Estilos, para modificar el trazado con las características deseadas. Para observar qué metabolitos caracterizan una o más clases específicas, vaya a Lista de gráficos y, a continuación, a Dispersión. El análisis exploratorio de toda la matriz de datos por PCA, mostró que las muestras se agruparon de acuerdo con la etapa de maduración, incluyendo envero, maduración media y madura, a lo largo del primer y segundo componente principal.

Las muestras se agruparon de acuerdo con la temporada de crecimiento a lo largo del tercer componente principal. El análisis discriminante O2PLS de bayas maduras permite la identificación de firmas específicas del terroir, que representan las tres macrozonas, Valpolicella, Garda Lake y Soave. Los gráficos de carga de estos modelos se expresan como correlación PQ, la correlación entre P, la clase de muestras, y Q, los metabolitos.

En los gráficos de carga, los cuadrados rojos representan la clase de muestras o macrozonas, y los triángulos de colores representan los metabolitos individuales. Los metabolitos están codificados por colores según su clase química, y la distancia entre los metabolitos y las muestras refleja sus relaciones. La macrozona del lago de Garda se caracterizó por estilbenos, mientras que Soave y Valpolicella se caracterizaron por flavonoides.

Dentro de las antocianinas, la peonidina y sus derivados fueron más prevalentes en la macrozona del lago de Garda, mientras que las otras antocianinas fueron más prevalentes en la macrozona de Valpolicella. Además, los tres O-glucósidos de antocianina fueron más prevalentes en la macrozona de Valpolicella, mientras que los derivados acilados y cumerados fueron más prevalentes en la macrozona de Soave. Los métodos de transcriptómica, RA y ARN permiten monitorear miles de transcripciones de vid simultáneamente.

Recientemente se ha diseñado un nuevo micro-array personalizado que representa un número aún mayor de sondas, que representan un género de vid adicional recientemente descubierto. Dada la rápida obsolescencia de las plataformas transcriptómicas, describimos un procedimiento alternativo utilizando una nueva plataforma que contiene más sondas que la anterior, incluyendo 249 transcripciones predichas de peno más, para 1392 genes de peno loci recientemente identificados y 179 genes de corvina prava. El análisis metabolómico por HPLC-ESI-MS, es lo suficientemente sensible como para detectar un gran número de metabolitos simultáneamente.

La capacidad de crear un plano de muestreo es fundamental. La elección de un solo clon para minimizar las diferencias genéticas, y la duración múltiple del muestreo, permitió identificar las diferencias reales entre los terruños. Sería interesante comparar el mismo cultivar cultivado en zonas menos óptimas, pero desafortunadamente, estos viñedos no estaban disponibles.