Name: El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a desarrollar un inmunoensayo múltiplex basado en perlas para medir anticuerpos IgG salivales contra múltiples patógenos ambientales simultáneamente. Esta técnica permite identificar agentes causales de enfermedades de forma rápida y rentable.

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Clarissa Curioso fue apoyada a través de un nombramiento en el Programa de Participación en Investigación de la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de EE. UU. y la EPA de EE. UU.

Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 08 a 1844, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) para la recogida de muestras de saliva crevicular con hiperestimulación de los bañistas en la playa de Boquerón, Puerto Rico, como parte de los Estados Unidos Agencia de Protección ambiental (EPA) Epidemiológica Nacional y Evaluación ambiental del recreativas (neear) Estudio del agua 23 para evaluar las exposiciones y enfermedades asociadas natación. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado y fueron instruidos en el uso del dispositivo de recogida de saliva por la USEPA contratistas capacitados. Las muestras de saliva fueron enviadas en hielo y, a la recepción, se centrifugaron y se almacenaron a -80 ° C como se describe 4. 1. La activación del grano <ol><li> Volver a suspender las poblaciones conjunto de microesferas por agitación y sonicación durante 20 segundos y la transferencia de aproximadamente 5,0 x 10 6 de las cuentas de valores (400 l) a tubos de microcentrífuga. Nota: TLas cuentas se le suministra a una concentración de 12,5 x 10 6 perlas / ml. </li><li> Sedimentar las cuentas de valores por centrifugación a 10.000 xg durante 2 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas sedimentadas en 100 l de agua destilada (dH2O) por vortex y sonicación durante 20 segundos. Repita el paso 1.2. </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las perlas lavadas en 80 l de fosfato monobásico de sodio 100 mM, pH 6.2 por vortex y sonicación durante 20 seg. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, hacer una solución de 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mediante la adición de 200 l de dH2O de 10 mg de sulfo-NHS alícuota. Mezclar por vórtice. </li><li> Añadir 10 l de la 50 mg / ml de Sulfo-NHS a las perlas. Mezclar por vórtice. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, hacer una 50 mg / ml de 1-etil-[3dimethylaminopropyl] carbodiimida solución (EDC) mediante la adición de 200 l de agua destilada (dH2O) a la alícuota de 10 mg de EDC. Mezclar por vórtice. </li><li> Añadir 10 l de 50solución mg / ml EDC a las perlas. Mezclar por vórtice. Se incuban las perlas durante 20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad, con mezcla por vórtice a intervalos de 10 min. Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 250 l de ácido 2- mM 50 [N morfolino] etanosulfónico (MES), pH 5,0 por vortex y sonicación durante 20 seg. </li><li> Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min. </li><li> Repita los pasos 1.9 y 1.10. Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con MES 50 mM, pH 5,0. </li><li> Resuspender las perlas en 100 l de MES 50 mM, pH 5.0 por vortex y sonicación durante 20 seg. </li></ol> 2. El acoplamiento del grano <ol><li> Pareja los antígenos a los conjuntos de microesferas utilizando las concentraciones mostradas en la Tabla 1. </li><li> Añadir cada antígeno a las perlas activadas y llevar el volumen total a 500 l en MES 50 mM, pH 5,0. Mezclar los antígenos de unaperlas d por vórtice. </li><li> Incubar los antígenos y los granos para las 2 horas con mezcla por rotación (~ 15 rpm) a temperatura ambiente en la oscuridad. Sedimentar las perlas acopladas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) -bovine albúmina de suero (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sodio al azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vortex y sonicación. Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min y separar el sobrenadante. Precaución: La azida de sodio es un producto químico muy tóxico. Es fatal si se ingiere o entra en contacto con la piel. No respirar el polvo / el humo / el gas / la niebla / los vapores o el aerosol. Use equipo de protección personal adecuado (PPE) al manipular y desechar de acuerdo con las leyes apropiadas. </li><li> Resuspender las perlas en 1 ml de PBS-TBN por vortex y sonicación durante 20 seg. </li><li> Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min. </li><li>Repita los pasos 2.5 y 2.6. Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con PBS-TBN. </li><li> Resuspender las perlas acopladas y se lavaron en 1 ml de PBS, 1% de BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Almacenar las perlas acopladas en un refrigerador C 2-8 ° en la oscuridad. </li></ol> 3. Contador del grano <ol><li> Preparar una dilución 1:10 de las perlas acopladas en agua o tampón PBS. </li><li> Carga de 10 l de la dilución de la gota sobre un hemocitómetro en el punto de introducción de la muestra. </li><li> Contar las perlas visto en uno de los 4 x 4 rejillas de esquina. Calcular el número total de perlas acoplaron usando la siguiente fórmula: Count (1 esquina de 4 x 4 grid) x (1 x 10 4) x (factor de dilución) x resuspensión volumen en ml. </li></ol> 4. Confirmación de antígeno de acoplamiento <ol><li> Resuspender la mezcla social de perlas acopladas a antígenos de interés por vortex y sonicación durante 20 seg. </li><li> Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una finalconcentración de 100 cuentas / l de cada perla única establecido en tampón de PBS-1% de BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4). </li><li> Preparar al menos 7 dos veces diluciones en serie de IgG anti-especie de anticuerpo primario de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en placa de 96 pocillos de fondo redondo con tampón de PBS-1% BSA. </li><li> Pre-humedecer una columna de 8 pocillos separada (8 filas) de una placa de fondo de filtro de 96 pocillos para cada antígeno prueba de confirmación de acoplamiento con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Añadir 50 l de mezcla de glóbulos de trabajo (perlas de antígenos acoplados a) a los pocillos pre-mojado. </li><li> Añadir 50 l de diluciones de anticuerpos a las filas 1-7 de cada columna de la placa de filtro de 96 pocillos y 50 l de tampón BSA PBS-1% a la fila 8, en lugar de anticuerpo diluido para servir como pozos de fondo. Mezclar con una pipeta multicanal pipeteando arriba y abajo 5 veces. Realice el mismo procedimiento para cada conjunto de microesferas antígeno acoplado a confirmarse. </li><li> Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambienteratura durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío. </li><li> Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repita 1x. Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal. </li><li> Diluir con biotina anti-especie anticuerpo de detección secundario IgG específica de 16 g / ml en PBS-1% BSA. </li><li> Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo pipeteando arriba y abajo 5 veces. </li><li> Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x. </li><li> Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal. </li><li> Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA. </li><li> Añadir 50 l de reportero a cada pocillo y mezclar pipeteando arriba y abajo 5 veces. </li><li> dosobre la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x. </li><li> Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29. Nota: Los resultados del inmunoensayo multiplex basado en perlas se miden en la intensidad de fluorescencia media (MFI). Consulte siempre a la última versión del manual de software, si está disponible para evitar errores. </li></ol> 5. salival Multiplex Inmunoensayo <ol><li> Retire la saliva del congelador a -80ºC y permitir que se descongele a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el antígeno acoplado stocks de talón por vortex y sonicación durante 20 seg. </li><li> Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una concentración final de 100 granos / l de cada conjunto de microesferas único en PBS-BSA 1% de tampón. </li><li> Preparar una dilución 1: 4 de saliva wITH tampón PBS-BSA al 1% en un 96 pocillos, placa de pozo profundo. </li><li> placa de filtro pre-mojado con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. </li><li> Añadir 50 l de una mezcla de glóbulos de trabajo y un volumen igual de saliva diluida a 95 pocillos de las placas de filtro de 96 pocillos para un 1: dilución final 8. Mezclar reacciones con una pipeta multicanal. Para el control del pozo, se añaden 50 perlas de antígenos acoplados a más 50 l l de PBS-1% de BSA (tampón como un sustituto de la saliva). </li><li> Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x. </li><li> perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal. </li><li> Diluir anti-humano IgG anticuerpo de detección secundario de cabra biotinilado a 16 g / ml en PBS-1% BSA. </li><li> Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo y mezclar el contenido conuna pipeta multicanal. </li><li> Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x. </li><li> perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal. </li><li> Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA. </li><li> Añadir reportero 50 l a cada pocillo y mezclar con una pipeta multicanal. </li><li> Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x. </li><li> Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29. Nota: Los resultados del inmunoensayo múltiplex se miden en unidades de mediana intensidad de fluorescencia (IMF). Siempre consultela última versión del manual de software, si está disponible, para evitar errores. </li></ol>

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<li>Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-specific+binding+in+serological+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).</li>
</ol>

La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo de financiar y gestionar la investigación descrita aquí. Ha sido sometido a revisión administrativa del Organismo y aprobado para su publicación. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye una aprobación o recomendación para su uso.

Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o múltiples...

Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede aplicar a los estudios epidemiológicos para determinar la exposición humana a estos patógenos y definir mejor las infecciones immunoprevalence e incidentes. La saliva es muy prometedora como una alternativa al suero para la investigación de biomarcadores humanos. Entre las ventajas de usar saliva son la no invasividad y la facilidad de la recogida de muestras, bajo coste, y las muestras pueden ser fácilmente recogidos de los niños de 5-7 &lt;/ Sup&gt;. Las muestras de suero y saliva se han estudiado ampliamente para anticuerpos contra H. pylori 2,3,8, 9 Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus de la hepatitis A y C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus dengue 16, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 17, y Escherichia coli O157: H7 18. Un inmunoensayo multiplex permite el análisis de múltiples analitos simultáneamente dentro de un solo volumen de muestra y dentro de un solo ciclo o correr. Antígenos de C. multiplexados jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitis A virus, y dos norovirus se utilizaron para medir humano salival IgG e IgA 2-4 3,4 y respuestas de anticuerpos de IgG en plasma de 2,3 a estos patógenos utilizando unabasado en perlas inmunoensayo multiplexación. Cuando se utiliza en conjunción con estudios epidemiológicos de la exposición a microbios en el agua, el suelo y los alimentos, del tipo de ensayo descrito en este estudio puede proporcionar información valiosa para mejorar la comprensión de las infecciones causadas por patógenos ambientales. Además, los datos de anticuerpos salivales obtenidos de tales estudios se pueden usar para mejorar los modelos de evaluación de riesgos 19-22.

<table><tbody><tr><td>Equipment and Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>75002446</td><td>Se utiliza para centrifugar muestras</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>Se utiliza para mezclar muestras</td></tr><tr><td>Sonicator (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td><td>Se utiliza para separar perlas</td></tr><tr><td>Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. </td><td>Capp</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro (Bright Line)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>Se utiliza para contar perlas acopladas</td></tr><tr><td>Colector de vacío multipantalla</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Se utiliza en las etapas de lavado para eliminar el sobrenadante</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>Se utiliza para agitar las perlas durante las incubaciones Gradilla</td>de</tr><tr><td>tubos (1,5 ml y 0,5 ml) (surtido)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>Báscula de pesaje</td><td>Mettler u otra</td><td></td><td>Se utiliza para medir los reactivos de lavado para la fabricación de tampones</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>Se utiliza durante la etapa de incubación de acoplamiento</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos</td></tr><tr><td>Luminex Analyzer con el software xPonent 3.1</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>Instrumento y software utilizados para ejecutar</td></tr> ensayos <tr><td><Antígenos fuertes></GI></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fuerte.1 Virus de Norwalk: partícula p</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 Norovirus VA387: partícula p</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>Virus de la hepatitis A: concentrado de grado II de cultivo celular</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>Antígeno acoplado a 100 y micro; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: lisado</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>Antígeno acoplado a 25 &micro; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: p30 recombinante (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>Antígeno acoplado a 25 &micro; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: células enteras muertas por calor</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>Antígeno acoplado a 50 & micro; g</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos primarios</fuerte></td> anti-norovirus para conejillos de indias <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>Se utiliza para la confirmación del acoplamiento</td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis A de ratón IgG Meridian</td><td>Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Se utiliza para la confirmación del acoplamiento</td></tr><tr><td>Ratón anti-Hepatitis A</td><td>IgG Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Se utiliza para la confirmación del acoplamiento</td></tr><tr><td>Anticuerpo purificado BacTraceAffinity contra Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>Se utiliza para la confirmación del acoplamiento</td></tr><tr><td>de pAb de cabra a Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>Se utiliza para la confirmación del acoplamiento</td></tr><tr><td>BacTrace Cabra anti-Campylobacter especie</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>Se utiliza para la confirmación</td></tr> <tr><td>del acoplamiento<fuerte>Secundario"... Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina-SP-Conjugado AffiniPure Donkey anti-Cabra IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>Utilizado para la confirmación</td></tr> del <tr><td>acoplamiento Biotinilado Conejo anti-Cabra IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>Utilizado para la confirmación del acoplamiento</td></tr><tr><td>Biotinilado Cabra anti-Ratón IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>Se utiliza para la confirmación</td></tr> <tr><td>del acoplamientoAnticuerpo purificado de afinidad Biotina marcada con cabra anti-conejo IgG (H + L)</td> <td>KPL</td><td>176-1506</td><td>Utilizado para la confirmación de acoplamiento</td></tr><tr><td><fuerte>Consumibles< / fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml de tubos de microcentrífuga de copolímero USA</td><td>Scientific</td><td>1415-2500</td><td>Utilizados como tubos de microcentrífuga de baja unión</td></tr><tr><td>10 y micro; l recambios de punta de pipeta</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 y micro; l recambios de punta de pipeta</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1,000 y micro; l recambios de punta de pipeta</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Varios proveedores</td><td></td><td>utilizados Mantenga las perlas en la oscuridad durante las incubaciones</td></tr><tr><td>Placas de pozos profundos</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>Se utiliza para diluir muestras de saliva</td></tr><tr><td>Placas de filtro multipantalla</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>Se utiliza para realizar ensayos</td></tr><tr><td>Sistema de recolección de saliva Oracol</td><td>Malvern Medical Desarrollos Limitado</td><td></td><td>Se utiliza para la recolección</td></tr> <tr><td>de saliva<reactivos fuertes> <</td> microesferas (perlas)Luminex Corporation Depende del conjunto >de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>perlas</td><td>Los antígenos se acoplan a las microesferas</td></tr><tr><td>EDC (clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]Pierce</td><td></td> <td>77149 o 22980</td><td>Utilizado en la activación</td></tr> <tr><td>de perlasSulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>Utilizado en la activación de perlas</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml)</td><td>Sondas moleculares</td><td>S-866</td><td>Utilizado como MES reportero</td></tr><tr><td>(ácido 2-[N-Morpholino]etanosulfónico)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>Utilizado para el acoplamiento</td></tr><tr><td>Tween-20 (Polioxietilenosorbitán monolaurato)</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>Se utiliza en el tampón de lavado para eliminar</td></tr> <tr><td>tampones de proteínas < fuerte > no específicos< / tampón ></td> almacenamiento <> <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fuertePBS-TBN (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)</fuerte>*</td><td></td><td></td><td>*Filtro Esterilizar y almacenar a 4 grados; C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl, 2.7 mM KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7888</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>0.2% (v/v)</td></tr><tr><td>Azida de sodio (0.05% azida)**</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td>**<fuerte>Precaución</fuerte>: La azida de sodio es extremadamente tóxica. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use EPP apropiados. Deséchelo de acuerdo con las leyes aplicables.</td></tr><tr><td><fuerte>MES/Tampón de acoplamiento (0,05 M MES, pH 5,0)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (ácido etansulfónico 2-[N-morfolino]</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td><tampón >ensayo fuerte (PBS, 1% BSA, pH 7,4)&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td>Filtro Esterilizar y almacenar a 4 &°; C</td></tr><tr><td>PBS, 1% BSA, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA</td></tr><tr><td><tampón >activación fuerte (0.1 M NaH</fuerte><fuerte>2</fuerte><fuerte>PO</fuerte><fuerte>4</fuerte><fuerte>, pH 6.2)</fuerte></td><td></td><td></td><td>Filtro Esterilizar y almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (Fosfato de sodio, monobásico anhidro)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0.1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td><tampón > lavado fuerte (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)</fuerte></td><td></td><td></td><td>Filtro Esterilizar y almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P-3563</td><td>138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN</td></tr></tbody></table>

el desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.

Un conjunto de microesferas único se utilizó como control para medir la unión no específica y una muestra a la variabilidad. Estas perlas se trataron de forma idéntica a las perlas de antígeno junto con la excepción de que no se incubaron con cualquier antígeno en la etapa de acoplamiento. valores de MFI&gt; 500 obtenidos a partir de las bolas de control incubadas con todas las muestras de saliva fueron retirados de los nuevos análisis debido a la sospecha de una contaminación a partir d...

En el clima actual de escasez de recursos, están surgiendo nuevas tecnologías que permiten a los investigadores realizar estudios más baratos, más rápidos y con más precisión. En este trabajo describimos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales basado en perlas para medir la exposición humana a múltiples patógenos ambientales simultáneamente.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

El objetivo general de este inmunoensayo múltiple basado en microperlas para anticuerpos salivales es identificar los agentes etiológicos responsables de enfermedades sintomáticas y asintomáticas asociadas al ambiente, mediante la medición simultánea de las respuestas de anticuerpos IGG frente a múltiples patógenos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ciencia de la exposición. Por ejemplo, qué patógenos son responsables de causar enfermedades en poblaciones específicas.La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para medir rápidamente y de forma rentable anticuerpos frente a múltiples analitos al mismo tiempo, usando volúmenes de muestra muy pequeños. Este método puede proporcionar información sobre los agentes etiológicos y sus fuentes de exposición, incluyendo vías transmitidas por alimentos, agua y aire. La demostración oficial de este procedimiento es fundamental porque, si no se configura adecuadamente, los resultados pueden ser poco confiables.Comience por vórtex y sonicar las mezclas stock de perlas acopladas a los antígenos de interés durante 20 segundos a la vez para generar suspensiones homogéneas de perlas. Luego, diluya los stocks de perlas acopladas hasta una concentración final de 100 perlas por microlitro de cada conjunto único de perlas en PBS, suplementado con 1 % de BSA. A continuación, prepare al menos siete diluciones seriadas de dos veces del anticuerpo primario anti-especie de IgG, en PBS más BSA en una placa de fondo redondo de 96 pocillos según las recomendaciones del fabricante.Precaliente una columna separada de ocho filas de 12 en una placa de filtro de 96 pocillos para cada prueba de confirmación de acoplamiento de antígeno con 100 microlitros de tampón de lavado y elimine el sobrenadante mediante vacío. A continuación, añada 50 microlitros de las perlas acopladas al antígeno a los pocillos precargados, junto con 50 microlitros del anticuerpo diluido en serie a las filas uno a siete de la placa de filtro de 96 pocillos, y añada 50 microlitros de PBS más BSA a la fila ocho como control de fondo del anticuerpo diluido. Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de cada pocillo arriba y abajo cinco veces.Luego, cubra la placa e incube los anticuerpos con las perlas acopladas al antígeno en la oscuridad, a temperatura ambiente, en un agitador de microplacas a 500 rpm. Después de una hora, aspire el sobrenadante y lave los pocillos con dos alícuotas de 100 microlitros de tampón de lavado. Tras el segundo lavado, reemplace el tampón con 50 microlitros de PBS más BSA.Ahora diluya el anticuerpo secundario de detección anti-IgG específico para la especie a 16 microgramos por mililitro en PBS más BSA y agregue 50 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo. Incube las perlas y los anticuerpos a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 minutos en un agitador de placas. Al final de la incubación, aspire el sobrenadante y lave las perlas con dos alícuotas de 100 microlitros de tampón de lavado.Después del segundo lavado, volver a suspender los microperlas en 50 microlitros de PBS más BSA y diluir el reportero estreptavidina r-ficoeritrina a 24 microgramos por mililitro en PBS más BSA. Añadir 50 microlitros del reportero a cada pocillo y mezclar mediante pipeteo. Incubar la placa en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitación, seguido de dos lavados de 100 microlitros con tampón de lavado, como se muestra.Luego, volver a suspender las perlas en 100 microlitros de PBS más BSA y evaluar las perlas acopladas al antígeno en el analizador. Después de resuspender los stocks de perlas acopladas mediante vortex y sonicación durante 20 segundos, diluir los stocks de perlas acopladas a una concentración final de 100 perlas por microlitro de cada conjunto único de perlas en PBS más BSA. A continuación, preparar una dilución de uno a cuatro de saliva a temperatura ambiente en PBS más BSA en una placa de 96 pocillos de fondo profundo.Precaliente una placa de filtro con 100 microlitros de tampón de lavado y aspire el sobrenadante. A continuación, agregue 50 microlitros de perlas conjugadas con antígeno y un volumen igual de saliva diluida a 95 pozos de la placa de filtro de 96 pozos para una a ocho diluciones finales. Al mismo tiempo, agregue 50 microlitros de perlas conjugadas con antígeno, más 50 microlitros de PBS más BSA solo, al pozo de control.Incube las perlas a oscuras a temperatura ambiente durante una hora en el agitador de microplacas a 500 rpm. Luego aspire el sobrenadante y lave los pocillos dos veces con 100 microlitros de tampón de lavado. Después del segundo lavado, re-suspenda las perlas en 50 microlitros de PBS con BSA.Diluya el anticuerpo secundario y agregue 50 microlitros del mismo a cada pocillo. Después de mezclar el contenido de los pocillos con una pipeta multicanal, incube la placa en agitador a oscuras durante 30 minutos a temperatura ambiente; luego lave los pocillos dos veces con 100 microlitros de tampón de lavado y re-suspenda los microesferas en 50 microlitros de PBS fresco más BSA. Ahora diluya el marcador y agregue 50 microlitros a cada pocillo.Mezcle bien con una pipeta multicanal. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en agitador y en oscuridad, lave los pocillos dos veces como se muestra, luego re-suspenda las perlas en 100 microlitros de PBS más BSA y evalúe las muestras en el analizador. Para asegurar que las perlas acopladas al antígeno sean capaces de alcanzar el rango dinámico del ensayo, se define un acoplamiento adecuado como una intensidad media de fluorescencia mayor o igual a 18.000.Como se demostró en estas confirmaciones representativas de acoplamiento de los antígenos en el ensayo para C.jejuni y T.gondii. Basándose en el punto de corte establecido, las tasas de inmunoprevalencia para las muestras oscilaron desde aproximadamente el 2% para T.gondii hasta casi el 50% para el genogrupo 1.1 de Norovirus, lo que indica que la tasa de inmunoprevalencia fue más alta para los Norovirus, seguida por la Hepatitis A y H. pylori. Mientras que el 32% de las muestras resultó inmunonegativo para todos los patógenos en el ensayo, el 68% resultó inmunopositivo para uno o más patógenos.Una vez dominado, este procedimiento puede completarse en aproximadamente cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las perlas en la oscuridad para evitar el blanqueo fotográfico. Después de seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como ELISA y transferencia Western para responder preguntas adicionales sobre sensibilidad y especificidad.Así como la reactividad cruzada de los anticuerpos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en los campos de la epidemiología, la ciencia de la exposición y la microbiología clínica exploraran los riesgos humanos derivados de exposiciones ambientales. Después de ver este video, debería tener una comprensión muy clara de cómo desarrollar, analizar e interpretar los resultados de un inmunoensayo múltiple, que mide anticuerpos frente a múltiples patógenos simultáneamente.No olvide que trabajar con fluidos corporales y azida de sodio puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar equipo de protección personal adecuado y desechar correctamente los reactivos al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

Este video muestra una técnica de inmunoensayo multiplex basada en perlas para detectar simultáneamente anticuerpos contra múltiples patógenos ambientales en la saliva humana. Las perlas fluorescentes se acoplaron a antígenos de diferentes patógenos, que se capturaron utilizando anticuerpos en la muestra de saliva humana. Al marcar los anticuerpos con un indicador fluorescente, las perlas se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la presencia de diferentes anticuerpos específicos...

Un inmunoensayo multiplex basado en perlas para identificar anticuerpos específicos de patógenos en la saliva

Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados ​​en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

Aquí presentamos un protocolo para describir el desarrollo y validación de un sola molécula matriz digital ensayo ELISA, que permite la detección ultrasensible de todos los subtipos de IFN-α en muestras humanas.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

Este papel presenta un protocolo para la detección específica de suero, inmunoglobulina E, con un sistema de quimioluminiscencia basado en cartucho de microfluidos y la evaluación de su utilidad en diagnósticos de alergia.

Aplicación de la tecnología de microfluidos Biochip para detectar suero alergénico-específicos de la inmunoglobulina E (sIgE)

Presentamos un protocolo para el uso de un microarray proteico construido mediante la impresión de antígenos de la gripe en diapositivas recubiertas de nitrocelulosa para sondear simultáneamente el suero de múltiples anótipos de anticuerpos contra más de 250 antígenos de diferentes cepas de virus, por lo tanto permitiendo la medición de la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus.

Uso de un microarreglo antigonagen antigripal para medir la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus

Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

Este artículo describe un método conveniente para monitorear los cambios dinámicos en los títulos de anticuerpos para dos isotipos de inmunoglobulina simultáneamente (ya sea IgA, IgM o IgG) como resultado de una respuesta inmune a la infección por SARS-CoV-2 o la vacunación. Este 'Panel de Respuesta Inmune Covid-19 Multianalito' emplea tres inmunoensayos indirectos construidos sobre microesferas codificadas que se leen utilizando un lector multiplex basado en flujo con capacidad de 'doble...

Monitoreo dinámico de la seroconversión mediante un ensayo de inmunodaxia multianalto para Covid-19

Se utilizó un sistema de análisis de flujo de fluorescencia de doble reportero de tres canales para desarrollar un inmunoensayo múltiple basado en perlas que evalúa simultáneamente muestras de suero para IgG e IgM provocadas contra múltiples antígenos de diferentes especies de Borrelia que causan borreliosis de Lyme en Europa y América del Norte.

Detección simultánea de diferentes clases de anticuerpos en una prueba serológica multiplexada

Los inmunoensayos de fluorescencia multiplex se están convirtiendo en una referencia para las pruebas serológicas. Sin embargo, su aplicación está limitada por la complejidad y los procesos de acoplamiento de perlas-analitos que requieren mucho tiempo. Este informe presenta un protocolo de acoplamiento de microesferas multiplex semiautomatizado y reproducible que es comparable al método estándar y reduce considerablemente el tiempo de obtención de resultados.

Un ensayo serológico multiplex para la detección de respuestas de anticuerpos a arbovirus

Aprende a desarrollar un inmunoensayo múltiplex basado en perlas para medir anticuerpos IgG salivales contra múltiples patógenos ambientales simultáneamente. Esta técnica permite identificar agentes causales de enfermedades de forma rápida y rentable.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

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