Name: La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a identificar y cuantificar especies en mezclas de carne cruda mediante espectrometría de masas MRM. Este método detecta hasta el 1% de carne de caballo en productos bovinos para combatir el fraude alimentario.

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Agradecemos el apoyo financiero de los fondos de la Subvención Estratégica Central del BBSRC del Instituto de Investigación en Alimentos, del Proyecto BBSRC BB/J004545/1.

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<li>Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentication+of+processed+meat+products+by+peptidomic+analysis+using+rapid+ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry.</a> Food Chem. 187, 297-304 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La selección de una proteína diana adecuado es importante. Una buena proteína diana necesita tener formas correspondientes de las especies de interés, suficiente variación en la secuencia dependiente de la especie, la especificidad de especie, y existen en cantidades accesibles dentro de los organismos. Para la evaluación de las mezclas que han sido objeto de procesamiento (por ejemplo, tratamiento de calor), una proteína que tiene una secuencia relativamente inmune a que el procesamiento es deseable. La mioglobina es un buen candidato para carnes rojas, incluyendo carnes rojas cocidas, pero no es la única posibilidad. Una vez que se decide la proteína diana, la parte más crítica del protocolo es la proteólisis de proteínas. Una proteína diferente de la mioglobina también puede exigir un protocolo alternativo proteólisis. El protocolo que se describe incluye un segmento en función de la proteína purificada de referencia. Esta tiene como objetivo descubrir retención ventanas de tiempo y los iones precursores y fragmento adecuado. Este segmento es muy útil, pero no esencial. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque pares de péptidos correspondientes de dos especies de interés se pueden enumerar incluso sin experimento, a veces es el caso de que una diferencia en la secuencia tiene dramáticas consecuencias sobre el perfil de la digestión. Por ejemplo, el par de péptidos VLGFHG (carne) y ELGFQG (caballo) dan un resultado anómalo cuantificación (manifiesto como un gradiente inferior a uno en la Figura 2). Esto es debido a que el último péptido surge de una escisión KE relativamente suprimido, causando una sub-estimación del nivel de caballo en la mezcla. por lo tanto, mejor péptidos correspondientes empezando con diferentes aminoácidos se evitan. A menudo los fragmentos de dos péptidos correspondientes tienen secuencias de aminoácidos idénticas y tienen un buen comportamiento, pero esto no es siempre el caso y necesita ser comprobada durante el desarrollo del método. La identificación de especies es mucho menos sensible a estos temas que la cuantificación relativa. El protocolo se ha demostrado para cuatro carnes rojass 3. especies de carne adicionales pueden ser incluidos, aunque la calidad de la forma de pico de transición puede deteriorarse si demasiados péptidos marcadores co-eluyen, reduciendo efectivamente el tiempo de permanencia y, finalmente degradar estimaciones cuantificación relativa. Mejora de la instrumentación, ya disponible, va a mejorar esto. Un tema relacionado es que no todas las carnes tienen diferentes mioglobina. Por ejemplo, caballo, burro y cebra mioglobina son idénticos y por lo tanto estrictamente hablando, el método sólo es capaz de detectar caballo o burro o cebra en la carne de vacuno. En algunos casos, aunque la mioglobina no son idénticos, algunos péptidos clave puede ser. Por ejemplo, algunos de mioglobina derivados de péptidos marcadores de cordero también aparecen en cabra. Una complicación frente a este y cualquier otro método de cuantificación basada en proteínas es que el nivel de proteína debe suponerse constante a través de todas las especies de si los niveles de proteínas o péptidos son trivialmente equiparar a los niveles de las carnes en una mezcla. Para la mioglobina y los cuatro m rojacome esto no es una verdad universal. Los niveles en general son especies dependientes, con carne de cerdo que exhiben el nivel más bajo de los cuatro. Además, el nivel de mioglobina varía con el corte de carne y la edad del animal. Así, aunque las proporciones de áreas de los picos de transición mapa de forma fiable a las relaciones de la mioglobina, la asignación a la proporción de carnes reales es un dibujo de estimación en supuestos sobre posibles fuentes de las carnes en la mezcla. El enfoque descrito en este trabajo difiere en un número de maneras de otras contribuciones publicadas. Una ruta más típico es utilizar métodos proteómicos para identificar varios péptidos marcadores dependiente de especie dispares, en cuyo caso los marcadores de diferentes especies poseen ninguna relación particular entre sí 8-12,14,19. Por el contrario, hemos seleccionado las proteínas comunes a todas las especies de interés hasta las especies que dependen de variantes de secuencia 3. Además de ser el centro de nuestra estrategia de cuantificación relativa, esto tiene la ventaja de que la muestraestrategias de preparación se pueden optimizar. Además, podría esperarse que tales proteínas correspondientes a comportarse de manera similar, por ejemplo, en la extracción o en el procesamiento comercial de muestras tales como cocinar o enlatado. La identificación de especies luego procede normalmente a través de la detección de los péptidos marcadores dispares, mientras que en el enfoque de identificación de especies CPCP producto a través de la detección de péptidos estrechamente relacionados que poseen típicamente una o dos diferencias en la secuencia. Por último, la cuantificación de proteínas para estimar el porcentaje en peso de una especie en otra podría proceder de manera convencional a través de la cuantificación absoluta de cada proteína basada separado en estándares conocidos 7,14,15. Sin embargo, utilizando el método de CPCP no hay necesidad de métodos de calibración. En lugar de ello, los niveles relativos se calcularon mediante la comparación de intensidades de señal de dos péptidos correspondientes de las dos especies, sin pasar por la etapa de medición absoluta por completo. Dado que el objetivo último es un porcentaje en peso de una especie en AnoTher, una cuantificación relativa, entonces el CPCP es a la vez más directo y más simple que la comparación de dos mediciones de cuantificación absoluta. Estas características se traducen en tiempos cortos experimentales, previstos para ser aproximadamente dos horas a través de protocolos refinados, por lo que la técnica útil como herramienta de vigilancia rápida en el ámbito de la detección de fraudes alimentarios.

El escándalo de la carne de caballo en Europa de 2013, en el que se encontró carne de caballo no declarada en varios productos de carne de vacuno de supermercados1, pone de manifiesto la necesidad de métodos de prueba capaces de detectar y medir el fraude alimentario en la carne. Se han explorado varias tecnologías, especialmente el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y los métodos basados en el ADN2. Una ruta alternativa, basada en la espectrometría de masas, se dirige a péptidos específicos de una especie que, a su vez, surgen de proteínas específicas de la especie. Aquí describimos uno de estos enfoques basados en péptidos que ofrece tanto la identificación como la cuantificación relativa de las especies adulterantes en una mezcla de carne3. 
El protocolo se enmarca en el contexto de las carnes rojas y el deseo de determinar la presencia de una en otra al nivel del 1% en peso, el nivel considerado por algunos como una adulteración fraudulenta de alimentos en contraposición a la contaminación4. El método se basa, en primer lugar, en la identificación de una proteína que es nominalmente "la misma" en todas las carnes objetivo. La mioglobina, la proteína responsable del color rojo de la carne, es un buen candidato ya que es abundante, relativamente tolerante al calor y soluble en agua, y se ha utilizado previamente para la determinación de especies de carne5,6. Las mioglobinas de la carne de vacuno (Bos Taurus), del cerdo (Sus scrofa), del caballo (Equus caballus) y del cordero (Ovis aries)3, por ejemplo, son nominalmente las mismas, según sea necesario, pero sus secuencias no son idénticas. Tales grupos de proteínas "similares pero diferentes", como estas cuatro mioglobinas, pueden describirse convenientemente como "proteínas correspondientes". Las diferencias de secuencia en estas cuatro mioglobinas son específicas de cada especie: por ejemplo, las proteínas de mioglobina completas para la carne de vacuno y de caballo, P02192 y P68082 respectivamente, comprenden cada una 154 aminoácidos con 18 diferencias de secuencia entre las dos. Sujetas a proteólisis con tripsina, estas proteínas producen dos conjuntos de péptidos, algunos de los cuales son idénticos y otros que muestran una o más diferencias de aminoácidos específicos de la especie: por lo tanto, las proteínas correspondientes dan lugar a los péptidos correspondientes. 
El enfoque CPCP, por lo tanto, busca primero identificar proteínas de dos o más especies donde estas proteínas exhiben variantes de secuencia específicas de especie limitadas. Estas son las proteínas correspondientes. Después de la proteólisis, las proteínas correspondientes dan lugar a péptidos, algunos de los cuales también muestran variantes de secuencia específicas de la especie heredadas de la proteína original. Estos son los péptidos correspondientes. El enfoque CPCP se puede utilizar para comparar los niveles de dos proteínas correspondientes en una muestra de especies mixtas mediante el seguimiento de los niveles de los péptidos correspondientes.
La tecnología natural para la detección de péptidos conocidos es la espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples, o MRM-MS7. Los péptidos específicos de cada especie producen iones precursores, que junto con sus iones fragmentados de espectrometría de masas, se detallan fácilmente de antemano mediante herramientas de software. Estas listas se utilizan para instruir al espectrómetro de masas para que registre solo pares específicos de iones precursores más fragmentos, llamados transiciones. Por lo tanto, un péptido objetivo particular se identifica no solo por su tiempo de retención en la cromatografía que precede al espectrómetro de masas, sino también por un conjunto de transiciones que comparten un ion precursor común. Se trata de un medio altamente selectivo de detección de péptidos conocidos que hace un uso eficiente del recurso del espectrómetro de masas.
Otros autores han utilizado la espectrometría de masas para probar la adulteración de la carne a través de marcadores peptídicos, pero a partir de proteínas dispares8-14. Sin embargo, el uso de las proteínas correspondientes, el esquema de péptidos correspondientes (CPCP) significa que se pueden optimizar las condiciones experimentales, lo que ayuda a la identificación de las especies en la mezcla a partir de transiciones específicas de especies conocidas. Además, las proteínas y péptidos correspondientes generalmente se comportarán de manera similar en las etapas de extracción, proteólisis y detección. Dado que las áreas de pico de transición son cuantitativas y reproducibles, las proporciones de áreas pico que surgen de pares de péptidos correspondientes de diferentes especies proporcionan una estimación directa de las cantidades relativas de dos carnes en una mezcla. Por el contrario, las rutas de cuantificación más tradicionales explotan calibraciones basadas en materiales de referencia para establecer una cuantificación absoluta14,15.
Aunque el protocolo se describe en el contexto de la mioglobina y la carne, se podrían utilizar proteínas distintas de la mioglobina para la identificación y cuantificación relativa a través de la estrategia CPCP en mezclas de carne, aunque potencialmente con modificaciones en el protocolo. Además, la estrategia también es aplicable a mezclas binarias de otras especies que comparten una o más proteínas correspondientes.
El punto de partida para el protocolo es la mioglobina 'de referencia' purificada, que para algunas especies se puede comprar, pero que para otras debe prepararse mediante cromatografía convencional de exclusión por tamaño. El procedimiento para la preparación de la mioglobina de referencia no está incluido en el protocolo, pero se describe en otra parte3. Las herramientas de software16 se utilizan para enumerar los péptidos candidatos y las transiciones que surgen de las mioglobinas de interés. Cada mioglobina de referencia se somete a proteólisis y los péptidos resultantes se analizan mediante cromatografía líquida por espectrometría de masas en tándem de ionización por electrospray (LC-ESI-MS/MS) para descubrir cuáles de los iones precursores y transiciones candidatos son más útiles y determinar los tiempos de retención de péptidos correspondientes. El resultado de esta etapa es una lista revisada de péptidos objetivo con sus transiciones, adecuados para la determinación de especies, y una lista de pares de CPCP, adecuados para la cuantificación relativa. Para analizar carnes reales, se preparan extracciones de muestras y luego se someten a proteólisis para generar péptidos tanto a partir de mioglobina como de otras proteínas extrañas. A continuación, los péptidos basados en la mioglobina se controlan mediante LC-ESI-MS/MS en función de las transiciones enumeradas. Las especies presentes en una mezcla se identifican por los picos de transición asociados a los péptidos marcadores. Las estimaciones de las cantidades relativas de dos carnes en una mezcla binaria se calculan utilizando proporciones de áreas de pico de transición. Un conjunto de mezclas de prueba de pares de carnes permitirá comprobar y calibrar la proporción de áreas de pico para un par de transiciones dado con respecto a las mezclas reales.

<table><tbody><tr><td>Base de datos Uniprot</td><td><a href="http://www.uniprot.org/">www.uniprot.org</a></td><td></td><td>Base de datos de libre acceso de secuencias de proteínas</td></tr><tr><td>Skyline software</td><td><a href="http://www.skyline.gs.washington.edu/">www.skyline.gs.washington.edu</a></td><td></td><td>Software gratuito para descargar que permite la creación de métodos específicos para estudios proteómicos, péptidos y fragmentos predicción&nbsp;</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com</td><td>O9830</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, Reino Unido www. fisher.co.uk</td><td>10674922</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, Reino Unido www. fisher.co.uk</td><td>10010010</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (de páncreas bovino tratado con TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus Reactivo de ensayo de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com</td><td>1856210</td><td></td></tr><tr><td>estándar de proteínas</td><td>Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com</td><td>P0914</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Homogeneizador de Turrax T25</td><td>Fisher Scientific, Loughoborough, Reino Unido www. fisher.co.uk</td><td>13190693</td><td></td></tr><tr><td>Edmund and Bühler KS10 agitador</td><td></td><td></td><td></td>de laboratorio</tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com</td><td></td> 75002420 <td></td></tr><tr><td>Centrífuga de vacío RC 1022</td><td>Jouan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de placas Strata-X 33u Cartuchos poliméricos de fase reversa Tubos de 60 mg/3 ml</td><td>Phenomenex, Macclesfield, Reino Unido</td><td>8B-S100-UBJ</td><td></td></tr><tr><td>4000 QTrap espectrómetro de masas de triple cuadrupolo</td><td>AB Sciex, Warrington, Reino Unido www.sciex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1200 sistema LC de resolución rápida</td><td>Agilent, Stockport, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna capilar de fase reversa XB C18 (100 mm x 2,1 mm, 2,6 y micro; m tamaño de partícula)</td><td>Phenomenex, Macclesfield, Reino Unido www.phenomenex.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analista 1.6.2 software</td><td>AB Sciex, Warrington, Reino Unido www.sciex.com</td><td></td><td>Adquisición y análisis de datos QTrap, incluida la integración de área de pico</td></tr><tr><td>Viales de</td><td></td><td></td><td></td> muestreador automático</tr></tbody></table>

la determinación de las especies y cuantificación de mezclas uso de mrm espectrometría de masas de los péptidos aplicada a la autenticación de carne

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Describimos un protocolo simple para identificar y cuantificar los dos componentes en mezclas binarias de especies que poseen una o más proteínas similares. Un elemento central del método es la identificación de las "proteínas correspondientes" en las especies de interés, en otras palabras, proteínas que son nominalmente iguales pero que poseen diferencias de secuencia específicas de la especie. Cuando se someten a proteólisis, las proteínas correspondientes darán lugar a algunos péptidos que son igualmente similares pero con variantes específicas de la especie. Estos son los 'péptidos correspondientes'. Los péptidos específicos de cada especie pueden utilizarse como marcadores para la determinación de la especie, mientras que los pares de péptidos correspondientes permiten la cuantificación relativa de dos especies en una mezcla. Los péptidos se detectan mediante espectrometría de masas de monitorización de reacciones múltiples (MRM), una técnica muy específica que permite la determinación de especies basadas en péptidos incluso en sistemas complejos. Además, la proporción de áreas de pico de MRM derivadas de los péptidos correspondientes apoya la cuantificación relativa. Dado que las proteínas y los péptidos correspondientes se comportarán, en general, de manera similar tanto en el procesamiento como en la extracción experimental y la preparación de muestras, la cuantificación relativa debe seguir siendo comparativamente sólida. Además, este enfoque no necesita los estándares y calibraciones requeridos por los métodos de cuantificación absoluta. El protocolo se describe en el contexto de las carnes rojas, que tienen proteínas correspondientes convenientes en forma de sus respectivas mioglobinas. Esta aplicación es relevante para la detección de fraudes alimentarios: el método puede detectar el 1% en peso de la carne de caballo en la carne de vacuno. La cuantificación relativa de la proteína, el péptido correspondiente (CPCP) utilizando las proporciones de área máxima de MRM proporciona buenas estimaciones de la composición de peso para peso de una mezcla de caballo más carne.

En un solo experimento MRM-modo dinámico cada transición programada se registra por separado (como conteos del detector por segundo, cps) más de una ventana de tiempo de retención especificado. Por lo tanto, de todos los datos recogidos en un experimento, la intensidad del pico para cada transición se puede extraer individualmente. A continuación, la única señal finito es para la ventana de tiempo de retención fijado para esa transición. Fuera de la ventana, la señal es cero por definición. La señal para cualquier transición, por ejemplo, 752 → 1269 de caballo (péptido monoisotopic masa 1,501.66 daltons, ion precursor m / z 751.84 daltons, cargo Estado = 2, fragmento y de iones 13) por lo general tiene que competir solamente con ruido de medición y no de otros picos de transición que tal vez podrían ser de otras especies. Por tanto, la salida es un conjunto de picos limpias, una por transición, a un tiempo de retención común para esas transiciones que comparten un ion precursor común. Figura 1 muestra el resultado para el conjunto de cuatro transiciones 752 → (1269, 706, 248, 1366) para una mezcla de 1% w / w caballo en la carne de vacuno. Desde las cuatro transiciones mostradas están asociados con el caballo, y están ausentes en las muestras de carne pura, cordero o cerdo, estos picos significan la presencia de caballo. En función de los criterios de robustez, un conjunto de dos o más transiciones cada una superior a una cierta señal especificada al nivel de ruido establece la identificación. Por tanto, esta figura se establece la presencia de caballo en la mezcla de 1% w / w de caballos en carne de vacuno. De vez en cuando, se detecta una sola transición aislado. Esto indica un partido de probabilidad de ion precursor y un solo fragmento, posiblemente de una proteína extraña, con los esperados del sistema y programado en el espectrómetro de masas. La singularidad del pico, y su suceso en un tiempo de retención inesperado, es el SIgnature de una transición accidental que puede ser ignorada. El área bajo cada pico de transición puede ser calculado de forma individual. Sobre la base de un fragmento adecuado, la relación de caballo para áreas de los picos de transición carne de vaca, por ejemplo, 752 → 1269 (caballo) a 767 → 1299 (carne), será proporcional a la relación de carnes reales en la mezcla. La figura 2 muestra una parcela de porcentaje en el área del pico para estas dos transiciones frente al porcentaje en peso para el peso del caballo en una mezcla de caballo con carne de vacuno. Si las áreas de los picos de transición porcentaje coincide con el porcentaje en peso para el peso de la carne, entonces la pendiente es 1. La pendiente de esta parcela es de 1,03, lo que indica que, para estas transiciones y par CPCP, las áreas de los picos de transición dan una medida fiable de las cantidades relativas de los dos carnes en la mezcla. Si la carne de caballo en la muestra era dos veces más rica en mioglobina como la carne a continuación, con otros factores sin cambios, la pendiente de la<html> línea sería mayor que uno. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54420/54420fig1.jpg" /> Figura 1. Las intensidades de transición MRM en función del tiempo de retención de 1% w / w de caballos en la carne de vacuno. Las transiciones son 752 → (1269, 706, 248, 1366), que se muestra en naranja, negro, azul y verde, respectivamente. El péptido marcador es HPGDFGADAQGAMTK. Los cuatro fragmentos de transición pueden designarse y 13, y 7, y 2 e y 14, respectivamente, donde y n indica el recuento en los aminoácidos n desde el extremo de péptido C-terminal. La relación señal a ruido varía 23 y 53 sobre las cuatro transiciones. Una línea roja indica la transición adicional 752 → 1269 para el caballo 0%, 100% carne de vacuno para la comparación. Sólo se muestra la región que no sea cero del tiempo de retención. Esta cifra ha sido modificado a partir de Watson et al. 3.en / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54420/54420fig2.jpg" /> Figura 2. Parcela de caballo en la carne de vacuno, como porcentaje en peso para el peso, en comparación con el caballo en la carne de vacuno como área de pico por ciento de transición. La trama se utiliza el par de péptidos de ternera (767) y el caballo (752) y el fragmento de iones y 13 para ambos. Si A representa el área del pico y luego la ordenada es 100 A H / (A + H A B). La pendiente de la línea de mejor ajuste (R2 = 0.99) es de 1.03. Esta cifra ha sido modificado a partir de Watson et al. 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54420/54420fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un protocolo para identificar y cuantificar los componentes en mezclas de especies que poseen proteínas similares. La espectrometría de masas detecta péptidos para su identificación y proporciona una cuantificación relativa por proporciones de áreas de picos. Como alimento de herramienta para la detección de fraudes, el método puede detectar un 1% de caballo en la carne de vacuno.

La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

El objetivo general de este método es utilizar la espectrometría de masas con monitoreo de reacciones múltiples para identificar y cuantificar las especies presentes en mezclas de carne cruda, con el fin de utilizarlo como herramienta para la detección de fraude alimentario. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la integridad alimentaria, como confirmar las especies presentes en productos como salchichas o hamburguesas. Nuestro enfoque se basa en la espectrometría de masas del componente proteico.La principal ventaja de esta técnica es que puede proporcionar un resultado rápido y cuantitativo. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que las proteínas conocidas con el mismo nombre en diferentes especies son en realidad lo suficientemente distintas como para permitir la identificación de especies, pero lo suficientemente similares como para permitir la cuantificación. Desnaturalice térmicamente las mioglobinas de referencia purificadas calentando la muestra en un bloque térmico a 95 grados Celsius durante 30 minutos.Enfríe la muestra durante aproximadamente 15 minutos hasta que alcance la temperatura ambiente. Luego agregue 30 miligramos de urea para mejorar la digestión y mezcle. Añada una solución de tripsina a la muestra en una proporción de uno a 30 de enzima a sustrato en peso.Luego, mezcle mediante vortex suave y deje que se produzca la proteólisis durante la noche a 37 grados celsius. A continuación, desaline la muestra posterior a la proteólisis diluyendo primero la muestra de uno a dos volúmenes de agua. Active un cartucho de fase reversa polimérico relleno con 30 miligramos de material de fase reversa añadiendo un mililitro de metanol.Luego equilibre el cartucho añadiendo un mililitro de ácido fórmico al uno por ciento. Aplique la muestra sobre el cartucho por gravedad. Ahora lave con un mililitro de metanol al cinco por ciento que contenga ácido fórmico al uno por ciento.Eluir los péptidos con un mililitro de acetonitrilo-agua en tubos microcentrífugos de dos mililitros previamente llenados con cinco microlitros de DMSO. A continuación, eliminar el disolvente bajo vacío a 50 grados Celsius utilizando un evaporador centrífugo durante 120 minutos. Luego, redisolver el residuo en 250 microlitros de acetonitrilo-agua.Transfiera la solución a un vial de autosampler de bajo volumen. Localice las secuencias de mioglobina para las diferentes carnes en la base de datos UniProt. Introduzca las secuencias de mioglobina en el cuadro de destino del software de predicción de péptidos y transiciones.Si es necesario, coloque el cursor sobre un péptido para revelar su lista de fragmentos. Después de ingresar las preferencias según se describe en el protocolo escrito, haga clic en Exportar y seleccione Lista de transiciones para crear una hoja de cálculo que contenga las transiciones MRM generadas y sus parámetros. Configure un sistema de cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC con gradiente binario, equipado con un muestreador automático y una columna HPLC C18 de núcleo encapsulado conectada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo operado en modo de ionización por electrospray positivo con detección MRM.En la sección de edición de parámetros del software de adquisición de datos de espectrometría de masas con cromatografía líquida, seleccione el tipo de escaneo como MRM y la polaridad como positiva. Ingrese los valores de Q1, Q3, tiempo, ID, DP y CE para las transiciones creadas en la hoja de cálculo y guarde el método de adquisición. Después de configurar los parámetros del método según se describe en el protocolo del texto, acceda al software de adquisición de datos, haga clic en Adquirir y seleccione Equilibrar.En el cuadro que se abre, seleccione el método de adquisición requerido para comenzar la equilibración del instrumento. A continuación, coloque los viales de muestra en un portaviales dentro del muestreador automático. Haga clic en Archivo y seleccione Nuevo, seguido de Lote de adquisición.En el nombre de la muestra, inserte la identidad de cada una de las muestras que se analizarán. Consulte el protocolo escrito para obtener detalles sobre cómo visualizar los datos adquiridos. Utilice una carne que haya sido previamente congelada y luego molida hasta convertirla en polvo.Prepare una serie de mezclas de carne pesando las cantidades respectivas de carne en tubos plásticos de centrífuga de 15 mililitros. Añada cuatro mililitros de tampón de extracción al polvo de carne. Después de mezclar en vórtex durante 30 segundos, realice la extracción en un agitador de laboratorio a temperatura ambiente durante dos horas a 250 ciclos por minuto.Transfiera dos mililitros del extracto a un tubo microcentrífugo de dos mililitros y centrifugue durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y 17,000 G. Transfiera alícuotas de 200 microlitros del sobrenadante a tubos centrífugos de dos mililitros. Seque las muestras utilizando un evaporador centrífugo antes de determinar la concentración de proteína de las muestras según se describe en el protocolo del texto. Para realizar la proteólisis de mezclas de carne, redisuelva el residuo seco en un mililitro de solución de bicarbonato de amonio 25 milimolar.Mezcle bien mediante vortex y realice la proteólisis como antes. Luego prepare y ejecute el LCMS de manera similar utilizando MRM programado. Muestre el cromatograma completo en el software de visualización de datos.Muestre los iones extraídos para cada conjunto de transiciones sucesivamente. Confirme visualmente que cada agrupación contenga el número requerido de picos con forma de campana en el tiempo de retención esperado. De esta manera, confirme la existencia del péptido seleccionado.A continuación, haga doble clic en el Asistente de cuantificación en la barra de navegación. En la ventana Seleccionar muestras, cree un conjunto de cuantificación seleccionando un solo archivo de datos. Luego, seleccione una o más muestras disponibles.Seleccione Siguiente para mostrar la configuración seleccionada y el cuadro de consulta. Deje la configuración predeterminada y seleccione Siguiente para mostrar Seleccionar método. En el cuadro desplegable Método, seleccione el archivo del método de integración y finalmente seleccione Finalizar.Guarde la tabla de resultados, expórtela como un archivo de texto y ábrala en una hoja de cálculo para revisar los datos según se describe en el protocolo escrito. Esta figura muestra las transiciones MRM más intensas para el caballo obtenidas a partir de una mezcla al uno por ciento en peso con carne de res. En contraste, la línea roja muestra la transición de la carne de res cuando no hay presencia de caballo.Este es un gráfico de la cantidad medida frente a la cantidad preparada de caballo en carne de res, expresada como proporciones. El gráfico muestra claramente cómo se puede utilizar el método para realizar mediciones cuantitativas. Una vez dominado y al utilizar procesamiento por lotes, el rendimiento mediante este método puede alcanzar hasta 20 muestras por 24 horas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar una proteína adecuada para el análisis de extracción. La mioglobina es un buen candidato para examinar especies de carne roja porque es abundante, soluble en agua y estable al calor. Este procedimiento puede ampliarse para incluir más especies que se identificarán y cuantificarán simultáneamente.El número máximo solo está limitado por la velocidad de escaneo de la espectrometría de masas. Esta técnica está allanando el camino para que los investigadores utilicen la huella peptídica en áreas como la protección del consumidor y de marcas.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne

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