La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne

El objetivo general de este método es utilizar la espectrometría de masas de monitoreo de reacciones múltiples para identificar y cuantificar las especies presentes en las mezclas de carne cruda para su uso como herramienta para la detección de fraudes alimentarios. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la integridad alimentaria, como confirmar las especies presentes en productos como salchichas o hamburguesas. Nuestro enfoque se basa en la espectrometría de masas del componente proteico.

La principal ventaja de esta técnica es que puede dar un resultado rápido y cuantitativo. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que las proteínas conocidas con el mismo nombre y las diferentes especies son en realidad lo suficientemente diferentes como para identificar las especies, pero lo suficientemente similares como para permitir la cuantificación. Desnaturalización térmica de mioglobinas de referencia purificadas calentando la muestra en un bloque caliente a 95 grados centígrados durante 30 minutos.

Enfríe la muestra durante aproximadamente 15 minutos hasta que alcance la temperatura ambiente. Luego agregue 30 miligramos de urea para mejorar la digestión y mezcle. Agregue una solución de tripsina a la muestra en una proporción de uno a 30 de enzima a sustrato en peso.

Luego mezcle mediante un suave vórtice y deje que proteólice durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, desala la muestra posterior a la proteólisis diluyendo primero la muestra de uno a dos volumen con agua. Active un cartucho polimérico de fase reversa lleno de 30 miligramos de material de fase inversa agregando un mililitro de metanol.

A continuación, equilibre el cartucho añadiendo un mililitro de ácido fórmico al uno por ciento. Cargue la muestra en el cartucho por gravedad. Ahora lavar con un mililitro de metanol al cinco por ciento que contenga un uno por ciento de ácido fórmico.

Eluir los péptidos con un mililitro de agua acetonitrilo en tubos de microcentrífugo de dos mililitros precargados con cinco microlitros de DMSO. A continuación, retire el disolvente al vacío a 50 grados centígrados utilizando un evaporador centrífugo durante 120 minutos. A continuación, vuelva a disolver el residuo en 250 microlitros de agua acetonitrilo.

Transfiera la solución a un vial de muestreador automático de bajo volumen. Localice las secuencias de mioglobina para los diferentes encuentros en la base de datos UniProt. Introduzca las secuencias de mioglobina en el cuadro objetivo del software de predicción de péptidos y transiciones.

Si es necesario, coloque el cursor sobre un péptido para revelar su lista de fragmentos. Después de ingresar las preferencias como se describe en el protocolo de texto, haga clic en Exportar y seleccione Lista de transiciones para crear una hoja de cálculo que contenga las transiciones y parámetros MRM generados. Configure un sistema de cromatografía líquida o HPLC de alto rendimiento de un gradiente binario con un muestreador automático y una columna de HPLC de carcasa de núcleo C18 conectada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo operado en modo de electropulverización positiva con detección MRM.

En la sección de edición de parámetros del software de recopilación de datos de espectrometría de masas de cromatografía líquida, seleccione el tipo de escaneo como MRM y la polaridad como positiva. Introduzca los valores Q1, Q3, time, ID, DP y CE para las transiciones creadas en la hoja de cálculo y guarde el método de adquisición. Después de configurar los parámetros del método como se describe en el protocolo de texto, navegue hasta el software de recopilación de datos, haga clic en Adquirir y seleccione Equilibrar.

En el cuadro que se abre, seleccione el método de adquisición requerido para comenzar la ecuación del instrumento. A continuación, coloque los viales de muestra en una rejilla en el muestreador automático. Haga clic en Archivo y seleccione Nuevo, seguido de Lote de adquisición.

En el nombre de la muestra inserte la identidad de cada una de las muestras que se van a analizar. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre cómo visualizar los datos adquiridos. Use una carne que haya sido previamente congelada y luego molida hasta convertirla en polvo.

Prepare una variedad de mezclas de carne pesando las cantidades respectivas de carne en tubos de centrífuga de plástico de 15 mililitros. Agregue cuatro mililitros de tampón de extracción a la carne en polvo. Después de agitar el vórtice durante 30 segundos, extraiga en un agitador de laboratorio a temperatura ambiente durante dos horas a 250 ciclos por minuto.

Transfiera dos mililitros del extracto a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y centrifugue durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y 17.000 G. Transfiera 200 alícuotas de microlitros del sobrenadante a dos tubos de centrífuga de mililitros. Seque las muestras utilizando un evaporador centrífugo antes de determinar la concentración de proteínas de las muestras como se describe en el protocolo de texto. Para realizar la proteólisis de mezclas de carne, vuelva a disolver el residuo seco en un mililitro de solución de bicarbonato de amonio de 25 milimolares.

Mezclar bien por vórtice y realizar proteoloysis como antes. A continuación, configure y ejecute el LCMS de forma similar mediante MRM programado. Visualice el cromatograma completo en el software de visualización de datos.

Muestra los iones extraídos para cada conjunto de transición a su vez. Confirme visualmente que cada clúster contiene el número necesario de picos en forma de campana en el tiempo de retención esperado. Confirmando así la existencia del péptido seleccionado.

A continuación, haga doble clic en Asistente de cuantificación en la barra de navegación. En la ventana Seleccionar muestras, cree un conjunto de cuantificación seleccionando un único archivo de datos. A continuación, seleccione una o más muestras disponibles.

Seleccione Siguiente para mostrar la configuración de selección y el cuadro de consulta. Deje la configuración predeterminada y seleccione Siguiente para mostrar Seleccionar método. En el cuadro desplegable Método, seleccione el archivo de método de integración y, por último, seleccione Finalizar.

Guarde la tabla de resultados, expórtela como un archivo de texto y ábrala en una hoja de cálculo para revisar los datos tal y como se describe en el protocolo de texto. Esta figura muestra las transiciones MRM más intensas para el caballo obtenidas a partir de una mezcla de uno por ciento de peso para peso con carne de res. En contraste, la línea roja muestra la transición de la carne de res cuando no hay caballo presente.

Este es un gráfico de la cantidad medida frente a la cantidad preparada de caballo en carne de vacuno, expresada como proporciones. El gráfico muestra claramente cómo se puede utilizar el método para realizar mediciones cuantitativas. Una vez dominado y cuando se utiliza el procesamiento por lotes, el rendimiento por este método puede alcanzar hasta 20 muestras por 24 horas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar una proteína adecuada para el análisis de extracción. La mioglobina es un buen candidato para examinar las especies de carne roja porque es abundante, soluble en agua y estable al calor. Este procedimiento puede ampliarse para incluir otras especies que deben identificarse y cuantificarse simultáneamente.

El número máximo está limitado solo por la velocidad de escaneo de la espectrometría de masas. Esta técnica está allanando el camino para que los investigadores utilicen la huella digital de pepto en áreas como la protección del consumidor y la marca.