Name: Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a usar un morbidostat de bajo coste para estudiar la evolución de la resistencia bacteriana a antibióticos mediante ajustes dinámicos de concentración. Este método accesible facilita investigaciones microbiológicas escalables.

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Los autores desean agradecer al Prof. Sze-Bi Hsu y a la Sra. Zhenzhen por sus útiles discusiones y ayuda en el análisis teórico y la simulación numérica. Y. T. Y. desea agradecer el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia y Tecnología bajo los números de subvención MOST 103-2220-E-007-026 y MOST 104-2220-E-007-011, y de la Universidad Nacional Tsing Hua bajo los números de subvención 103N2042E1, 104N2042E1 y 105N518CE1.

1. Las pruebas preliminares de la Asamblea y del dispositivo Morbidostat <ol><li> Asamblea de la Morbidostat <ol><li> Perforar 3 agujeros en el tapón del vial de cultivo con una aguja de jeringuilla 18 G. Cortar tres piezas de tubo de polietileno ~ 7 cm de longitud. Insertar estas tres piezas de tubo de polietileno en la tapa. </li><li> Use cinta adhesiva para envolver el borde de la tapa para servir de molde para la mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS). Mezclar 5 g de un componente y 0,5 g del componente B de los PDMS en un recipiente de plástico 150 ml por agitación manual con un palillo de dientes. Cargar la mezcla en una jeringa de 10 ml. <ol><li> Verter la mezcla de PDMS en la tapa con la jeringa. Hornear toda la tapa para curar los PDMS durante 8 horas en el horno a 70 ° C. </li></ol></li><li> Soldar el ánodo del LED con el cable de calibre 24 y el cátodo del LED con la resistencia de carbono con un soldador. Soldar una resistencia de 680 Ω de carbono con un alambre G 24. Aislar la conexión de cables utilizando cinta aislante. </li><li> Asi quelder el colector del fotodetector con el alambre G 24 y el emisor del fotodetector con una resistencia de 100 kW de carbono. Aislar la conexión de cables utilizando cinta aislante. </li><li> Coloque el diodo emisor de luz en el soporte de vial de cultivo. Siguiendo el esquema de conexiones en la figura complementaria 2, conecte el diodo emisor de luz y el poder con una fuente de alimentación de 5 V. Asegúrese de que el LED funciona mediante el uso de una cámara digital que puede detectar IR (por ejemplo, una cámara de teléfono móvil). </li><li> Coloque el fotodetector en el soporte de vial de cultivo. Siguiendo el esquema de conexiones en la figura complementaria 2, conecte el fotodetector y la potencia con una fuente de alimentación de 5 V. Conectar el cable a ambos lados de las resistencias de fotodetectores para medir el voltaje a través del panel de control electrónico. </li><li> Pegar un imán en el eje del ventilador de refrigeración, que sirve como la unidad de agitador magnético. Tenga en cuenta que la alignment del eje del ventilador para el vial de cultivo, y la separación entre el vial de cultivo y el imán es muy crítica para el correcto funcionamiento de la unidad de agitación magnética. </li><li> Conectar cada trozo de tubo de polietileno de la cultura vial en la pieza correspondiente de tubos de silicona para las micro-bombas, botellas medianas y botella de residuos. A su vez en la bomba durante 1 hr y medir el volumen total que se bombea desde la botella medio en el vial de cultivo para determinar la velocidad de la bomba. Tenga en cuenta que la velocidad de bombeo típica debe ser ~ 4 ml / hora, lo que corresponde a la tasa de dilución D = 0,33 h-1 durante unos 12 ml de volumen del vial de cultivo de trabajo. </li><li> Colocar todo el conjunto en un incubador con agitación de tamaño mediano (34 cm x 34 cm x 43,5 cm). </li></ol></li><li> Pruebas preliminares del Morbidostat <ol><li> tensión de alimentación conjunto de ventilador fresco a 5 V para iniciar su motor para probar la barra de agitación magnética. Tenga en cuenta que la acción de agitación se puede inspeccionar visualmente. La tensión que impulsans del motor del ventilador de refrigeración se controla con precisión mediante modulación por ancho de pulso (PWM). </li><li> Preparar una serie de tipo salvaje E. muestras coli con densidades ópticas a 600 nm que típicamente varía 0,07-0,3 para la calibración. Coloque una prueba E. coli muestra en el vial de cultivo y registrar la tensión fotodetector. <ol><li> Place ~ 100 l de la misma muestra en el lector de placas y registrar la densidad óptica. Utilice la tensión fotodetector frente a los datos de densidad óptica para trazar la curva de calibración. Tenga en cuenta que por lo general, una unidad de cambio en la densidad óptica corresponde a ~ 7,6 V cambio en el fotodetector con el esquema de restricción utilizado aquí. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ejecutar el Morbidostat <ol><li> Preparación Antes de comenzar el experimento diario <ol><li> Preparar el vial de cultivo con tres tubos Tygon resistentes ultra-químicas con diámetro interior de 1/32 de pulgada y diámetro exterior 3/32 pulgadas para las entradas para formar el dispositivo como en la sección1.1 y en la Figura 1 complementario. </li><li> Preparar el medio M9 mínimo (0,2% de glucosa) y trimetoprim (TMP) de drogas medio que contiene. Esterilizar el medio, la botella de medio, la botella de medio con el fármaco, la botella de residuos, y el vial de cultivo en un autoclave a 121 ° C. NOTA: La TMP es una solución de reserva que se utiliza para lograr más tarde las concentraciones de la Tabla 1 y el fármaco TMP que contiene el medio no se trata en autoclave. </li></ol></li><li> La ejecución de la Morbidostat <ol><li> En el primer día del experimento, descongelar 1 ml de tipo salvaje congelado E. células de E. coli MG1655 de 5 min a temperatura ambiente y la transferencia de 120 l de las células a la vial de cultivo que contiene ~ 12 ml de medio de crecimiento M9. Después del primer día, descongelar 1 ml de E. congelado coli células del día anterior durante 5 min y la transferencia de 120 l de las células a un nuevo vial de cultivo que contiene ~ 12 ml de medio de crecimiento M9. </li><li> Encienda la incubadora agitador y ajuste la tempe<html> ratura de 30 ° C sin agitación. </li><li> Iniciar la operación de morbidostat activando la micro-bomba, la unidad de agitación magnética, y la medición de la densidad óptica. NOTA: Durante la operación, un algoritmo de umbral de realimentación se utiliza para controlar la inyección de drogas. Cuando la densidad óptica medida supera un umbral preestablecido, la bomba de inyección de drogas se enciende y la bomba del medio se apaga. De lo contrario, la bomba de inyección de drogas permanece apagado y la bomba está en medio. </li><li> Monitor de la tensión de vez en cuando para asegurar que no es el crecimiento microbiano. Nota: Debido al ciclo de congelación y descongelación, E. coli células presentan un retraso de ~ 4 horas durante el crecimiento de cada día. </li><li> Después de ~ 23 horas, detener la micro-bomba apagando su tensión de alimentación y sacar el tubo del cultivo. Añadir 15% de glicerol en el vial de cultivo y la congelación de la muestra a -80 ° C para el almacenamiento. </li><li> Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.5. </li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 3. susceptibilidad antibiótica de medición en 96 Bueno Formato NOTA: Realice la medición tasa de crecimiento en un lector de placas con un formato de 96 pocillos para determinar el nivel de resistencia a los antibióticos. <ol><li> Descongelar la muestra congelada diaria a temperatura ambiente durante 5 min y transferir 15 l de la célula para el vial de cultivo que contiene ~ 15 ml de medio M9. Permiten que crezcan hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanza ~ 0,1. Divida a los 15 ml en 1 ml botellas y añadir el fármaco TMP en este paso para obtener las concentraciones de fármaco deseadas como se muestra en la Tabla 1. </li><li> Tomar 200 l de la muestra a partir del paso 3.1 y lugar en cada pocillo en el lector de placas y les permiten crecer durante 12 horas 5. La densidad óptica a la longitud de onda 600 nm se registra automáticamente durante la medición. NOTA: Para cada punto de datos, mediciones por triplicado se registran y se promedió para asegurar la consistencia de los datos. Los datos sobre la densidad óptica en función del tiempo puede be utiliza para obtener la tasa de crecimiento. </li><li> Representar gráficamente los datos de la tasa de crecimiento frente a la concentración de fármaco para obtener IC50. Tenga en cuenta que IC 50 se define como la concentración de fármaco en el que la tasa de crecimiento es el cincuenta por ciento de la tasa de crecimiento máximo 5. </li></ol> 4. Single Cell Morfología y susceptibilidad antibiótica de medición en dispositivos de microfluidos <ol><li> Realizar la fabricación de los dispositivos de microfluidos mediante litografía blanda multicapa de PDMS como se describe en otra parte 15. <ol><li> Utilice la fotolitografía para hacer el molde fotorresistente para las capas de control y de flujo. Tenga en cuenta que para la capa de control, utilice fotoprotector negativo (~ 15 m de altura) y fotoprotector positivo (~ 8 m de altura) para producir un molde sobre una oblea de silicio al descubierto. </li><li> Preparar las mezclas de PDMS con relaciones de reticulación de 5: 1 y 20: 1 para la capa de control y la capa de flujo, respectivamente. Poner las mezclas en un desecador a vacío para eliminar las burbujas, Por 1 hr. </li><li> Exponer los moldes capa fotorresistente de control en la oblea de silicio para trimetilclorosilano vapor (TMCS). Hacer la capa de control de ~ 6 mm de espesor por colada la mezcla de PDMS (con una relación de reticulación 5: 1) en la oblea de silicio sobre el molde de control de capa fotorresistente. Hornear la capa de control durante 40 minutos a 80 ° C durante 1 hora en el horno. </li><li> Hacer la capa de flujo por giro el recubrimiento de una mezcla de PDMS (con una relación de reticulación 20: 1, velocidad de centrifugado 3000 rpm durante 60 segundos) en un molde de resina fotosensible capa de flujo. Hornear la capa de flujo durante 30 min a 80 ° C durante 1 hora en el horno. </li><li> Use una hoja de afeitar para cortar la capa de control en el chip de tamaño deseado (típicamente de 3 cm x 2 cm) y manualmente retire la capa de control. Coloque la capa de control en la parte superior de la capa de flujo y alinearlos bajo un estereomicroscopio. Curar el montaje alineado a 80 ° C durante la noche en el horno. Después, disfrute del conjunto en 250 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico durante 5 horas para disolver los PTM residual. </li><li> Posteriormente, perforar los agujeros de entrada con 20 agujas G y unir todo el elastómero a un portaobjetos de vidrio recubierto con una capa de PDMS en blanco (cruz PDMS que une relación de 5: 1, velocidad de centrifugado 2000 rpm durante 30 sec) por tratamiento con plasma de aire de 40 segundos a 1.2 Torr presión de aire. </li><li> Llevar a cabo una amplia hornear durante 36 horas a 80 ° C para reducir los efectos citotóxicos de PDMS. Tenga en cuenta que esta etapa de cocción es crítica para minimizar la toxicidad para las células bacterianas. </li></ol></li><li> El experimento de crecimiento de la viruta <ol><li> Antes de cargar en el dispositivo de microfluidos, lavarlo con agua desionizada durante 1 hora y medio M9 durante 1 hora. </li><li> Descongelar la muestra congelada diaria a temperatura ambiente durante 5 min y inocular un nuevo tubo de ensayo con medio M9 fresco. Colocar la muestra en un incubador con agitación a 37 ° C durante la noche. </li><li> Diluir la muestra microbiana 10 veces con medio M9 y cargarlo en el dispositivo de microfluidos al presionar al recipiente de la muestra microbiana a 5 psi. A continuación, cargue el medicamento TMPmedio en el chip presionando el recipiente medio con el fármaco a 5 psi. Ejecutar la mezcla entre el microbio y el fármaco por accionamiento de la válvula micromecánica entre las dos cámaras en el chip microfluídico para 15 min. </li><li> Coloque el chip de microfluidos en la incubadora microscopio montado en el microscopio invertido. Adquirir la imagen de células en la cámara de crecimiento cada hora durante 8 horas con la cámara CCD montada en el microscopio invertido. </li><li> Utilice la secuencia de programa personalizado para calcular el número de células a través de un algoritmo de umbral en los datos de imagen celular 18. Tenga en cuenta que los datos de número de células se promedian por lo general más de tres cámaras de microfluidos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un dispositivo morbidostat bajo la huella de componentes de bajo coste se demuestra. Los aumentos en el nivel de resistencia a los medicamentos registrados por el dispositivo son coherentes con los informes anteriores de 5. Diseñado para los estudios evolutivos de la resistencia a los medicamentos, el dispositivo es potencialmente aplicable a muchos otros experimentos. En primer lugar, una amplia base de datos de mutaciones inducidas por fármacos se puede establecer para un gran conjunto de antibióticos clíni...

Desde la introducción del primer fármaco antibiótico penicilina, la resistencia microbiana a los antibióticos se ha convertido en un problema de salud mundial 1. Aunque la adquisición de resistencia a los antibióticos puede ser estudiado retrospectivamente in vivo, las condiciones de estos experimentos a menudo no están controlados a lo largo de toda la evolución 2. Alternativamente, la evolución adaptativa de laboratorio puede revelar la evolución molecular de una especie microbiana menores de estrés ambiental o la presión de selección de un fármaco antibiótico 3. Recientemente, muchos experimentos evolutivos bien controlados de resistencia a los antibióticos han permitido comprender la aparición de resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el grupo de Austin demostró emergencia rápida en un entorno compartimentado microfluidos diseñado adecuadamente 4. El morbidostat recientemente desarrollado induce mutaciones sistemáticas bajo la presión de selección de drogas 5,6. El morbidostat, una selec microbianadispositivo de la que ajusta continuamente la concentración de antibiótico para mantener una población casi constante, es un avance importante en la prueba de fluctuación se utiliza en microbiología 7,8. En la prueba de fluctuación, un fármaco antibiótico se inyecta a alta concentración, y los mutantes supervivientes se tamizan y se contó. En cambio, los microbios en un morbidostat son constantemente desafiados y adquieren múltiples mutaciones. El morbidostat opera de manera similar a la quimiostato, un dispositivo inventado por la cultura y Novick Szliard en 1950 que mantiene una población constante mediante el suministro continuo de nutrientes, mientras que la dilución de la población microbiana 9. Desde su introducción, el quimiostato se ha avanzado y mejorado. quimiostatos microfluidos actuales han alcanzado las capacidades de nanolitros y unicelulares. Sin embargo, estos dispositivos no son adecuados para los experimentos de evolución adaptativa, que requieren una población de células grandes con muchos eventos de mutación 10,11. Recientemente, mini-quimiostatos con volúmenes de trabajo de ~ 10 ml también se han desarrollado para rellenar el hueco entre los biorreactores de escala en litros y el microfluidos quimiostato 12,13. Aquí se presenta el diseño y el uso de un bajo costo, morbidostat automatizado para un estudio de resistencia a los antibióticos. El módulo propuesto se puede emplear en un incubador agitador en un laboratorio de microbiología con el requisito mínimo de hardware. El firmware de código abierto también se adapta fácilmente a las aplicaciones específicas de la evolución de adaptación, como la ingeniería metabólica 3. Por último, el morbidostat está integrado en una plataforma de microfluidos multiplexado para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos 14.

<table><tbody><tr><td>Incubadora de agitador ambiental</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Placa Arduino Leonardo Resistencia</td> de carbono <td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Resistencia de polarización</td><td>Digikey</td><td></td><td>para LED</td></tr><tr><td>Resistencia de carbono de 100k ohmios Resistencia de polarización</td><td>Digikey</td><td></td><td>para fototransistor</td></tr><tr><td>Diodo emisor de luz de 940 nm</td><td>LED brillante electrónico</td><td>BIR-BM13E4G-2 Medición de</td><td>densidad óptica</td></tr><tr><td>fototransistor de 940 nm</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B Medición de</td><td>densidad óptica</td></tr><tr><td>Darlington par IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>este IC impulsa microbombas y unidad de agitación magnética</td></tr><tr><td>Ventilador sin escobillas de 5 V CC</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>especificación: voltaje de alimentación de 5 V y 80&nbsp; mamá; disponible www.jameco.com</td></tr><tr><td>Microbomba piezoeléctrica</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Presión > 3&nbsp; kPa; Caudal >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L:50'&nbsp;</td></tr><tr><td>Barra de agitación magnética</td><td>COWIE</td><td></td><td>forma cónica dim: 10&nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Centelleo de vidrio Frasco de 20 ml</td><td>DGS</td><td></td><td>Vidrio Pyrex 28 mm (diámetro) x 61 mm (altura)</td></tr><tr><td>Soporte</td><td></td><td></td> para viales <td>de cultivo Hecho a medida de poliformaldehído&nbsp;</td></tr><tr><td>Silicona</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>utilizada para sellar el vial de vidrio</td></tr><tr><td>Frasco mediano</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 sal mínima 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medio</td></tr><tr><td>Cadaminoácido</td><td>BD</td><td></td><td>Glucosa media</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr>Agar <td>Oxoide</td><td></td><td>bateriológico</td><td>para placa</td></tr> <tr><td>de agarLuria Bertani Medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>utilizado para la medición microfluídica Uso Objetivo 40X NA = 0,55</td></tr><tr><td>Microscopio Incubadora</td><td>Instrumento de célula viva</td><td>CU-109</td><td>utilizado para la medición microfluídica</td></tr><tr><td>Válvulas solenoidales</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalmente abierto 1,3 vatios 12 V CC</td></tr><tr><td>Tarjeta de interfaz USB</td><td>Módulo de E/S digitales USBIO24-R de Hobby Engineering&nbsp;</td><td></td><td>para la medición microfluídica</td></tr><tr><td>Compresor de aire</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Fuente de presión para microfluidos; Presión máx. 80 psi</td></tr><tr><td>Racores luer-lock macho de 1/8" de lengüeta</td><td>MTLL230 ValuePlastics.com-1</td><td>utilizados para el control microfluídico</td><td></td></tr><tr><td>Lengüeta de 1/8" a puerto roscado 10-32</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>utilizados para el control microfluídico</td></tr><tr><td>Accesorios Luer-lock hembra para puerto</td> <td>roscado 10-32ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>utilizado para el control microfluídico</td></tr><tr><td>NPN transistor darlington 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>utilizado para el control microfluídico</td></tr><tr><td>10 kOhm, resistencia de película de carbono, 0,25 W</td><td></td><td>DigiKey.com P10KBACT-ND</td><td>utilizado para el control microfluídico</td></tr><tr><td>Condensador de tantalio, 10&nbsp; &mu; F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>utilizado para el control microfluídico</td></tr><tr><td>Cámara CCD Andor</td><td></td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>utilizado para imágenes microfluídicas en chip</td></tr><tr>Lector <td></td><td></td><td></td>de<td>placas ELISA de</td></tr><tr><td>dos componentes Silicona&nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>utilizado para la fabricación de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>SU-8 fotorresistente</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>utilizado para la fabricación de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>AZ4620 fotorresistente</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>utilizado para la fabricación de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>utilizado para la fabricación de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Aguja de jeringa de calibre 20</td><td>BD</td><td></td><td>utilizado para la fabricación de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler PCR</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>Amplificación de PCR</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma Lector de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp;</td><td>Medición de resistencia antibiótica</td></tr></tbody></table>

diseño y uso de un bajo coste, automatizado morbidostat para adaptive evolución de las bacterias a los antibióticos en la selección de fármacos

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Describimos un bajo costo, morbidostat configurable para la caracterización de la vía evolutiva de resistencia a los antibióticos. El morbidostat es un dispositivo de cultivo bacteriano que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano y ajusta dinámicamente la concentración de fármaco para desafiar constantemente las bacterias a medida que evolucionan para adquirir resistencia a los medicamentos. El dispositivo cuenta con un volumen de trabajo de ~ 10 ml y es totalmente automatizado y equipado con medición de la densidad óptica y micro-bombas para el medio y la administración de fármacos. Para validar la plataforma, que mide la adquisición gradual de la resistencia a trimetoprima en Escherichia coli MG 1655, e integró el dispositivo con una plataforma de microfluidos multiplexado para investigar la morfología celular y la sensibilidad a los antibióticos. El enfoque puede ser de hasta a escala en los estudios de laboratorio de resistencia a los antibióticos, y es extensible a la evolución adaptativa para las mejoras de deformación en la ingeniería metabólica y otros experimentos con cultivos bacterianos.

El morbidostat anteriormente descrito se esquematiza en la Figura 1. Las operaciones morbidostat comunes, incluyendo la evolución experimental, prueba de susceptibilidad a los antibióticos y la comprobación de la morfología celular, fueron validados en una E. cultivo de E. coli MG1655 expuesto a trimetoprim (TMP), un fármaco antibiótico que se usa comúnmente 5,6. TMP induce muy distintivos incrementos escalonados en resistencia a los medicame...

Describimos un morbidostat configurable de bajo coste que permite la caracterización de la resistencia a los antibióticos mediante el ajuste dinámico de la concentración del fármaco. El dispositivo puede integrarse con una plataforma microfluídica multiplexada. El enfoque puede ampliarse para estudios de resistencia a antibióticos en laboratorio.

Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar la vía evolutiva de la resistencia a antibióticos utilizando un morbidostato que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano y ajusta dinámicamente la concentración de antibiótico conforme las bacterias adquieren resistencia al fármaco. La principal ventaja de esta técnica es que el montaje está compuesto por componentes electrónicos de bajo costo y fácil acceso, y puede reconfigurarse fácilmente para fines específicos. Los procedimientos serán demostrados por Po Cheng Liu y Yi Tai Lee, ambos estudiantes de posgrado de mi laboratorio.Para armar el morbidostato, comience utilizando una aguja de calibre 18 para perforar tres orificios en la tapa del vial de cultivo. Corte tres trozos de tubo de polietileno de aproximadamente siete centímetros de longitud e insértelos en los orificios de la tapa. Utilice cinta adhesiva para envolver el borde de la tapa y servir así como molde para la mezcla de polidimetilsiloxano, o PDMS.Luego, agregue cinco gramos del componente A y 0,5 gramos del componente B del PDMS en un recipiente plástico de 150 mililitros y utilice un palillo para mezclarlo manualmente. Cargue la mezcla en una jeringa de 10 mililitros. A continuación, con la jeringa, inyecte la mezcla de PDMS sobre la tapa.Hornee toda la tapa a 70 grados Celsius durante ocho horas para curar el PDMS. A continuación, utilizando un soldador, suelde el ánodo del LED con el cable de calibre 24 y el cátodo del LED con la resistencia de carbono. Luego suelde una resistencia de carbono de 680 ohmios con un cable de calibre 24.Utilice cinta aislante para aislar la conexión del cable. Solderice el colector del fotodetector con un cable de calibre 24 y el emisor del fotodetector con una resistencia de carbono de 100 ohmios. Luego, utilice cinta aislante para aislar la conexión del cable.Coloque el diodo emisor de luz en el soporte del vial de cultivo. Siguiendo el diagrama del circuito mostrado aquí, conecte el diodo emisor de luz y utilice una fuente de alimentación de cinco voltios para encenderlo. Asegúrese de que el LED funcione utilizando una cámara digital que pueda detectar infrarrojos. Ahora coloque el fotodetector en el soporte del vial de cultivo.Luego, siguiendo el diagrama, conecte el fotodetector y utilice una fuente de alimentación de cinco voltios para encenderlo. Conecte el cable a ambos lados de los resistores del fotodetector para medir el voltaje a través de la placa de control electrónico. Pegue un imán en el eje del ventilador de enfriamiento, el cual sirve como unidad de agitación magnética.Dado que la unidad de agitación magnética está formada por el imán y el ventilador de enfriamiento, es fundamental alinear la plataforma del ventilador con el vial de cultivo. Asimismo, la distancia entre el vial de cultivo y el imán es muy crítica para garantizar un funcionamiento estable. Conecte cada tramo de tubo de polietileno del vial de cultivo al tramo correspondiente de tubo de silicona de las microbombas, los frascos de medio y el frasco de desecho.Encienda la bomba durante una hora y mida el volumen total que se bombea desde el frasco medio al vial de cultivo para determinar la velocidad de bombeo. La velocidad de bombeo típica debe ser aproximadamente de cuatro mililitros por hora, lo que corresponde a una velocidad de dilución de D igual a 0,33 por hora para un volumen de trabajo de 12 mililitros en el vial de cultivo. Cuando la configuración esté completa, coloque todo el conjunto en un incubador agitador de tamaño medio.Para probar previamente el Morbidostato, configure el voltaje de la fuente de alimentación del ventilador de enfriamiento en cinco voltios para encender su motor y probar la barra de agitación magnética. Después de preparar una serie de muestras de E. coli y trazar una curva de calibración según el protocolo descrito, prepare el vial de cultivo con tres trozos de tubo Tygon ultrarresistente a productos químicos de siete centímetros de longitud, con un diámetro interno de 1/32 de pulgada y un diámetro externo de 3/32 de pulgada para las entradas, a fin de armar el dispositivo. Prepare medio mínimo M9 con glucosa al 0,2 % y medio M9 que contenga el fármaco trimetoprima o TMP.Luego, esterilice el medio, la botella del medio, la botella del medio con fármaco, la botella de desechos y el vial de cultivo en un autoclave a 121 grados Celsius. En el primer día del experimento, descongele un mililitro de células de E-coli MG1655 tipo silvestre congeladas a temperatura ambiente durante cinco minutos y transfiera 120 microlitros de las células a un vial de cultivo que contenga aproximadamente 12 mililitros de medio de crecimiento M9. Encienda el incubador con agitación y ajuste la temperatura a 30 grados Celsius sin agitación.Inicie la operación del morbidostato encendiendo la bomba microperistáltica, la unidad de agitación magnética y la medición de densidad óptica. Después de aproximadamente 23 horas, detenga la bomba microperistáltica apagando su voltaje de alimentación y retire el vial de cultivo. Añada glicerol al 15 % al vial de cultivo y congele las muestras a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento.Cambiar a un nuevo vial de cultivo al comienzo de cada uno de estos experimentos también es importante para evitar la formación de biotina. De lo contrario, la formación de biotina puede ocurrir dentro de dos o tres días. Después de descongelar la muestra congelada diariamente a temperatura ambiente durante cinco minutos, inocule un nuevo tubo de ensayo con medio M9 fresco.Coloque la muestra en un incubador con agitación a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use medio M9 para diluir la muestra microbiana diez veces y cárguela en el dispositivo microfluídico presurizando el recipiente de la muestra microbiana a cinco PSI. Luego, cargue el medio que contiene TMP en el chip presurizando el recipiente de M9 con TMP a cinco PSI.Realice la mezcla entre el microbio y el fármaco actuando la válvula micro-mecánica entre las dos cámaras en el chip microfluídico durante 15 minutos. Finalmente, coloque el chip microfluídico en el incubador del microscopio montado en el microscopio invertido. Con una cámara CCD, adquiera imágenes celulares en la cámara de crecimiento cada hora durante ocho horas.Calcule los datos del número de células según el protocolo descrito en el texto. Las operaciones comunes del morbidostato, incluyendo la evolución experimental, la prueba de susceptibilidad a antibióticos y la verificación de la morfología celular, se invalidaron utilizando un cultivo de E-coli MG1655 expuesto al antibiótico TMP, que induce un aumento distintivo por pasos en la resistencia al fármaco con mutaciones agrupadas alrededor del gen de la dihidrofolato reductasa, o DHFR. Cada día, se espera que el microbio crezca por encima del umbral preestablecido de densidad óptica y active la inyección del fármaco, como se muestra aquí.Se espera que la inyección del fármaco inhiba el crecimiento y, como resultado, disminuya la densidad óptica. Este gráfico muestra el aumento temporal de la resistencia a fármacos antibióticos en un experimento para determinar la CI50. La resistencia al fármaco aumentó aproximadamente 1500 veces, hasta 1 000 microgramos por mililitro, en aproximadamente 12 días.De acuerdo con hallazgos previos, las mutaciones puntuales en DHFR en el mutante del último día se midieron mediante secuenciación de Sanger y se enumeran en esta tabla. La adquisición de resistencia a fármacos con múltiples mutaciones demuestra la utilidad del Morbidostato.Dado que la selección en placas de agar que contienen fármacos tiende a conferir únicamente una sola mutación, esta figura muestra las curvas de crecimiento en el chip a diversas concentraciones de TMP. Las muestras mutantes muestran un aumento significativo en la resistencia al antibiótico.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudiaran la posición de la resistencia a los fármacos antibióticos en un entorno de laboratorio de control real. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones, como la medición microfluídica de células individuales, con el fin de responder preguntas adicionales, como si la morfología aún cambia debido a la exposición a fármacos antibióticos. Una vez dominado, este dispositivo puede reconfigurarse fácilmente para todo tipo de experimentos de cultivo bacteriano, como el cultivo de un signo de bacterias o el aumento del nivel de tolerancia al costo de una cepa bacteriana.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la adquisición de resistencia a fármacos antibióticos en un experimento evolutivo adaptativo de laboratorio con control real. No olvide manipular las bacterias resistentes a fármacos según las normas de seguridad biológica para la práctica microbiológica. Puede ser necesaria una autorización especial para un experimento que implique entrenamiento básico de bacterias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aquí se demuestra un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de una secuencia objetivo determinado. Se muestra cómo este método, que se realiza en vivo en Escherichia coli, se pueden acoplar con la selección funcional para desarrollar nuevas actividades enzimáticas.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

Fuente: Liu, P. C., et al. Diseño y uso de un morbidostat automatizado de bajo costo para la evolución adaptativa de bacterias bajo selección de antibióticos. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra el uso de un chip microfluídico para visualizar y comparar el crecimiento y la morfología de cepas de E. coli de tipo salvaje y resistentes a trimetoprima bajo estrés antibiótico trimetoprima.

Crecimiento bacteriano en un chip microfluídico para estudiar la resistencia a los antibióticos

Fuente: Jian, X., et al., Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa mediante el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el uso de un sistema de cultivo de microgotas microbianas para impulsar la evolución adaptativa de las bacterias hacia la tolerancia al metanol. Al mezclar cultivos bacterianos diseñados con un medio de alto estrés de metanol y segmentarlos en microgotas, el sistema selecciona mutantes que exhiben un crecimiento...

Evolución adaptativa de bacterias mediante un sistema de cultivo de microgotas microbianas

Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.

Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.

Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

Aquí presentamos un método experimental para probar el papel de multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos.

Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

El marco eVOLVER permite un cultivo microbiano continuo de alto rendimiento con alta resolución y control dinámico sobre parámetros experimentales. Este protocolo demuestra cómo aplicar el sistema para llevar a cabo un experimento de fitness complejo, guiar a los usuarios en la programación de control automatizado sobre muchas culturas individuales, midiendo, recopilando e interactuando con datos experimentales en tiempo real.

Diseño automatizado, de alto rendimiento, experimentos de crecimiento de células continuas utilizando eVOLVER

La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.

Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

Este protocolo proporciona un método para la optimización global sistemática de biosensores codificados genéticamente a través de la generación y evaluación de bibliotecas genéticas asistidas por automatización. Esto se combina con metodologías de diseño de experimentos para agilizar la experimentación y permitir la selección de componentes genéticos para ajustar los biosensores a resultados de diseño específicos.

Muestreo eficiente del espacio de diseño de biosensores codificados genéticamente habilitado con un diseño de experimentos y flujo de trabajo de automatización

Aprende a usar un morbidostat de bajo coste para estudiar la evolución de la resistencia bacteriana a antibióticos mediante ajustes dinámicos de concentración. Este método accesible facilita investigaciones microbiológicas escalables.

Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos (Video) | JoVE Journal

Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

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