Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

El objetivo general de este experimento es caracterizar la vía evolutiva de la resistencia a antibióticos utilizando un morbidostato que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano y ajusta dinámicamente la concentración de antibiótico conforme las bacterias adquieren resistencia al fármaco. La principal ventaja de esta técnica es que el montaje está compuesto por componentes electrónicos de bajo costo y fácil acceso, y puede reconfigurarse fácilmente para fines específicos. Los procedimientos serán demostrados por Po Cheng Liu y Yi Tai Lee, ambos estudiantes de posgrado de mi laboratorio.

Para armar el morbidostato, comience utilizando una aguja de calibre 18 para perforar tres orificios en la tapa del vial de cultivo. Corte tres trozos de tubo de polietileno de aproximadamente siete centímetros de longitud e insértelos en los orificios de la tapa. Utilice cinta adhesiva para envolver el borde de la tapa y servir así como molde para la mezcla de polidimetilsiloxano, o PDMS.

Luego, agregue cinco gramos del componente A y 0,5 gramos del componente B del PDMS en un recipiente plástico de 150 mililitros y utilice un palillo para mezclarlo manualmente. Cargue la mezcla en una jeringa de 10 mililitros. A continuación, con la jeringa, inyecte la mezcla de PDMS sobre la tapa.

Hornee toda la tapa a 70 grados Celsius durante ocho horas para curar el PDMS. A continuación, utilizando un soldador, suelde el ánodo del LED con el cable de calibre 24 y el cátodo del LED con la resistencia de carbono. Luego suelde una resistencia de carbono de 680 ohmios con un cable de calibre 24.

Utilice cinta aislante para aislar la conexión del cable. Solderice el colector del fotodetector con un cable de calibre 24 y el emisor del fotodetector con una resistencia de carbono de 100 ohmios. Luego, utilice cinta aislante para aislar la conexión del cable.

Coloque el diodo emisor de luz en el soporte del vial de cultivo. Siguiendo el diagrama del circuito mostrado aquí, conecte el diodo emisor de luz y utilice una fuente de alimentación de cinco voltios para encenderlo. Asegúrese de que el LED funcione utilizando una cámara digital que pueda detectar infrarrojos. Ahora coloque el fotodetector en el soporte del vial de cultivo.

Luego, siguiendo el diagrama, conecte el fotodetector y utilice una fuente de alimentación de cinco voltios para encenderlo. Conecte el cable a ambos lados de los resistores del fotodetector para medir el voltaje a través de la placa de control electrónico. Pegue un imán en el eje del ventilador de enfriamiento, el cual sirve como unidad de agitación magnética.

Dado que la unidad de agitación magnética está formada por el imán y el ventilador de enfriamiento, es fundamental alinear la plataforma del ventilador con el vial de cultivo. Asimismo, la distancia entre el vial de cultivo y el imán es muy crítica para garantizar un funcionamiento estable. Conecte cada tramo de tubo de polietileno del vial de cultivo al tramo correspondiente de tubo de silicona de las microbombas, los frascos de medio y el frasco de desecho.

Encienda la bomba durante una hora y mida el volumen total que se bombea desde el frasco medio al vial de cultivo para determinar la velocidad de bombeo. La velocidad de bombeo típica debe ser aproximadamente de cuatro mililitros por hora, lo que corresponde a una velocidad de dilución de D igual a 0,33 por hora para un volumen de trabajo de 12 mililitros en el vial de cultivo. Cuando la configuración esté completa, coloque todo el conjunto en un incubador agitador de tamaño medio.

Para probar previamente el Morbidostato, configure el voltaje de la fuente de alimentación del ventilador de enfriamiento en cinco voltios para encender su motor y probar la barra de agitación magnética. Después de preparar una serie de muestras de E. coli y trazar una curva de calibración según el protocolo descrito, prepare el vial de cultivo con tres trozos de tubo Tygon ultrarresistente a productos químicos de siete centímetros de longitud, con un diámetro interno de 1/32 de pulgada y un diámetro externo de 3/32 de pulgada para las entradas, a fin de armar el dispositivo. Prepare medio mínimo M9 con glucosa al 0,2 % y medio M9 que contenga el fármaco trimetoprima o TMP.

Luego, esterilice el medio, la botella del medio, la botella del medio con fármaco, la botella de desechos y el vial de cultivo en un autoclave a 121 grados Celsius. En el primer día del experimento, descongele un mililitro de células de E-coli MG1655 tipo silvestre congeladas a temperatura ambiente durante cinco minutos y transfiera 120 microlitros de las células a un vial de cultivo que contenga aproximadamente 12 mililitros de medio de crecimiento M9. Encienda el incubador con agitación y ajuste la temperatura a 30 grados Celsius sin agitación.

Inicie la operación del morbidostato encendiendo la bomba microperistáltica, la unidad de agitación magnética y la medición de densidad óptica. Después de aproximadamente 23 horas, detenga la bomba microperistáltica apagando su voltaje de alimentación y retire el vial de cultivo. Añada glicerol al 15 % al vial de cultivo y congele las muestras a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento.

Cambiar a un nuevo vial de cultivo al comienzo de cada uno de estos experimentos también es importante para evitar la formación de biotina. De lo contrario, la formación de biotina puede ocurrir dentro de dos o tres días. Después de descongelar la muestra congelada diariamente a temperatura ambiente durante cinco minutos, inocule un nuevo tubo de ensayo con medio M9 fresco.

Coloque la muestra en un incubador con agitación a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use medio M9 para diluir la muestra microbiana diez veces y cárguela en el dispositivo microfluídico presurizando el recipiente de la muestra microbiana a cinco PSI. Luego, cargue el medio que contiene TMP en el chip presurizando el recipiente de M9 con TMP a cinco PSI.

Realice la mezcla entre el microbio y el fármaco actuando la válvula micro-mecánica entre las dos cámaras en el chip microfluídico durante 15 minutos. Finalmente, coloque el chip microfluídico en el incubador del microscopio montado en el microscopio invertido. Con una cámara CCD, adquiera imágenes celulares en la cámara de crecimiento cada hora durante ocho horas.

Calcule los datos del número de células según el protocolo descrito en el texto. Las operaciones comunes del morbidostato, incluyendo la evolución experimental, la prueba de susceptibilidad a antibióticos y la verificación de la morfología celular, se invalidaron utilizando un cultivo de E-coli MG1655 expuesto al antibiótico TMP, que induce un aumento distintivo por pasos en la resistencia al fármaco con mutaciones agrupadas alrededor del gen de la dihidrofolato reductasa, o DHFR. Cada día, se espera que el microbio crezca por encima del umbral preestablecido de densidad óptica y active la inyección del fármaco, como se muestra aquí.

Se espera que la inyección del fármaco inhiba el crecimiento y, como resultado, disminuya la densidad óptica. Este gráfico muestra el aumento temporal de la resistencia a fármacos antibióticos en un experimento para determinar la CI50. La resistencia al fármaco aumentó aproximadamente 1500 veces, hasta 1 000 microgramos por mililitro, en aproximadamente 12 días.

De acuerdo con hallazgos previos, las mutaciones puntuales en DHFR en el mutante del último día se midieron mediante secuenciación de Sanger y se enumeran en esta tabla. La adquisición de resistencia a fármacos con múltiples mutaciones demuestra la utilidad del Morbidostato.

Dado que la selección en placas de agar que contienen fármacos tiende a conferir únicamente una sola mutación, esta figura muestra las curvas de crecimiento en el chip a diversas concentraciones de TMP. Las muestras mutantes muestran un aumento significativo en la resistencia al antibiótico.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudiaran la posición de la resistencia a los fármacos antibióticos en un entorno de laboratorio de control real. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones, como la medición microfluídica de células individuales, con el fin de responder preguntas adicionales, como si la morfología aún cambia debido a la exposición a fármacos antibióticos. Una vez dominado, este dispositivo puede reconfigurarse fácilmente para todo tipo de experimentos de cultivo bacteriano, como el cultivo de un signo de bacterias o el aumento del nivel de tolerancia al costo de una cepa bacteriana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la adquisición de resistencia a fármacos antibióticos en un experimento evolutivo adaptativo de laboratorio con control real. No olvide manipular las bacterias resistentes a fármacos según las normas de seguridad biológica para la práctica microbiológica. Puede ser necesaria una autorización especial para un experimento que implique entrenamiento básico de bacterias.