Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el rendimiento y la función muscular en el pez cebra utilizando la respuesta al tacto y ensayos de natación. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la investigación neuromuscular, como la identificación de deterioro del rendimiento muscular o defectos neurodegenerativos en modelos enfermos de pez cebra. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método automatizado de alto rendimiento para evaluar el rendimiento muscular en modelos enfermos de pez cebra.

Para realizar el ensayo, coloque una placa de Petri llena de aproximadamente 25 mililitros de medio embrionario en un escenario iluminado con temperatura controlada ajustado a aproximadamente 28 grados Celsius. Monta la cámara de alta velocidad sobre la antena. Inicie el software de grabación de video y configure la velocidad de captura en 1.000 cuadros por segundo para garantizar que se puedan capturar velocidades de natación rápidas.

Coloque el embrión en el centro de la placa de Petri claramente visible en el campo de visión. Presione Grabar y luego administre un estímulo mecanosensorial tocando suavemente el embrión con una aguja roma en la parte superior de la cabeza. Detenga la grabación una vez que el embrión haya nadado fuera del campo de visión o haya regresado al reposo.

Repetir la prueba de las mismas larvas principalmente para habituar o promover la debilidad muscular en algunos modelos enfermos, lo que resulta en una respuesta reducida al estímulo táctil, por lo tanto, cada embrión solo debe ser examinado una vez. Para cuantificar el comportamiento de natación, inicie el software y seleccione la locomoción de una sola larva con nuestro módulo de sustracción de fondo para abrir el archivo de video AVI. Seleccione la herramienta a mano alzada o polígono de la barra de menú y seleccione la región de la película que abarque tanto la posición original del pez como el área hacia la que nada, excluyendo la sonda utilizada para entregar el estímulo mecanosensorial.

Haga clic en Experimento en la barra de menú y seleccione Ejecutar. Cuando se le solicite, guarde el archivo de análisis de datos sin procesar en formato PHR en la ubicación deseada. A continuación, haga clic en Iniciar para comenzar el análisis.

Una vez que el pez haya nadado fuera del campo de visión o el videoclip haya terminado, concluya el análisis haciendo clic en Detener en el menú del experimento y aparecerá una ventana que muestra los resultados. Desplácese hacia la derecha de la ventana para obtener el valor máximo de aceleración. Exporte los datos haciendo clic en el botón Exportar resultados instantáneos en el menú desplegable Resultados.

Seleccione el archivo de análisis de datos sin procesar adecuado y haga clic para abrirlo. Esto guardará un archivo de texto en la carpeta de destino que se puede abrir en un programa de hoja de cálculo. Coloque las larvas de prueba en una placa de 48 pocillos, uno por pocillo.

A continuación, llene los pozos con agua hasta justo debajo de la parte superior del pozo asegurándose de que no haya burbujas. Guarde los platos a 28 grados centígrados durante una hora. Coloque la placa en una cámara de grabación equipada con una cámara digital infrarroja que pueda detectar larvas en la oscuridad.

Los ritmos circadianos y los estímulos ambientales externos pueden afectar significativamente el comportamiento de natación del pez cebra. La hora del día y las condiciones de iluminación deben estandarizarse y la temperatura del agua debe regularse estrictamente. Inicie el software y seleccione el módulo de seguimiento.

En Archivo, haga clic en Generar nuevo protocolo y edite el número de pozos utilizados para el experimento, que en este ejemplo es 48. A continuación, haga clic en Parámetros y seleccione Parámetros de protocolo y luego Tiempo para establecer la duración del experimento y el período de integración en 10 minutos. También en Parámetros de protocolo, haga clic en Opciones y asegúrese de que la casilla de verificación del numeroscopio esté activada.

Para establecer las áreas de grabación, resalte toda la cuadrícula y haga doble clic en uno de los pozos. Haga clic en el botón Dibujar áreas y dibuje alrededor de los pozos superior izquierdo, superior derecho e inferior izquierdo y haga clic en Construir. A continuación, el software determinará la posición de cada pozo.

En este punto, dibuja también en la barra de escala y haz clic en Aplicar al grupo. Una vez completado, haga clic en el botón Dibujar áreas. A continuación, seleccione el color del pez, que en este caso es negro, y deslice la barra del umbral de detección a un nivel en el que solo se resalten los movimientos del pez sin fondo.

Introduzca los umbrales de movimiento para la detección de inactividad y movimientos pequeños y ampliados. En este ejemplo, se utilizó un umbral de inactividad de seis milímetros por segundo y un umbral de ráfaga de actividad de 30 milímetros por segundo. Haga clic en el menú de parámetros, luego en la configuración de conducción ligera y configure la intensidad de luz de la cámara en 0%Cierre la puerta de la cámara de grabación y comience la grabación de video.

El experimento se completará en 10 minutos según lo indicado por el temporizador en la pantalla. Una vez completado, haga clic en el menú desplegable Experimento y seleccione Detener. Aparecerá un cuadro de diálogo con los resultados.

Para examinar los resultados usando Excel, haga clic en Abrir carpeta contenedora y abra el archivo que aparece en la carpeta resultante. Finalmente, el video se puede reproducir para revisar si los valores de locomoción registrados representan con precisión los movimientos de natación de los peces. Esto se puede lograr comparando el movimiento observado en el archivo de video con el perfil de locomoción generado por el software.

Las imágenes instantáneas de un embrión de pez cebra tomadas durante un ensayo evocado por el tacto muestran el movimiento típico de un individuo durante los primeros 0,2 segundos después de la aplicación del estímulo. Aquí, la figura muestra un perfil de aceleración durante los primeros 0,2 segundos de la respuesta de escape de natación en ráfaga en individuos de tipo salvaje frente a individuos miopáticos. Se observó que la aceleración alcanza su punto máximo en ambas deformaciones en esta ventana de tiempo y la aceleración máxima máxima es proporcional a la capacidad de generación de fuerza del músculo esquelético.

Se promediaron los valores máximos de aceleración para las cepas de tipo salvaje y miopáticas. Los peces miopáticos mostraron una disminución significativa en la aceleración máxima, lo que indica una función muscular reducida. Los ensayos de locomoción de 10 minutos de embriones registraron los patrones de movimiento y los tipos de embriones de tipo salvaje y miopáticos y generaron representaciones esquemáticas de los movimientos de natación.

Se mapearon los períodos de movimiento lento representados por líneas verdes y de movimiento rápido representado por líneas rojas, así como los períodos de inactividad representados por líneas negras. Los individuos de tipo salvaje mostraron altos niveles de actividad con relativamente ningún período de inactividad, en contraste con los individuos miopáticos, que fueron menos activos durante el período de prueba. Esto se reflejó en diferencias significativas en el número promedio de movimientos y la distancia recorrida por los peces de tipo salvaje en comparación con los peces miopáticos.

Una vez dominado, el ensayo de respuesta evocada por el tacto se puede realizar en 15 minutos para 15 peces y los ensayos de locomoción se pueden completar en aproximadamente 10 minutos para hasta 48 peces. Al intentar este procedimiento, es importante manipular cuidadosamente los embriones, ya que esto puede afectar su actividad. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas como el inmunomarcaje o la microscopía electrónica para responder a preguntas adicionales relacionadas con la patología muscular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el rendimiento muscular en el desarrollo temprano del pez cebra.