Crecimiento diferida Ensayo de inhibición para cuantificar el efecto de antimicrobianos de bacterias derivadas de la Competencia

El objetivo general de este protocolo es examinar la competencia de un aislado bacteriano sobre otro, tanto de manera cuantitativa como cualitativa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con investigaciones sobre exclusión competitiva dentro de comunidades bacterianas. La principal ventaja de esta técnica es que refleja lo que ocurre en una comunidad bacteriana.

Los aislados invasores deben ser capaces de sobrevivir a los efectos inhibitorios de los aislados establecidos para que la invasión tenga éxito. El procedimiento será demostrado por Emma Crank, una estudiante de posgrado de biología hospitalaria. Para comenzar, prepare agar de infusión cerebral y cardíaca o BHI según las instrucciones del fabricante.

Somete el agar a autoclave a 121 grados Celsius y 15 psi durante 20 minutos para esterilizarlo. Vierta alícuotas de 15 mililitros de agar BHI esterilizado en placas de Petri estériles y deje que el agar solidifique. Prepare caldo BHI según las instrucciones del fabricante y transfiera alícuotas de 10 mililitros a frascos universales de vidrio de 28 mililitros.

Luego, esterilice el caldo BHI en autoclave durante 20 minutos. Para preparar las botellas del vaporizador, comience por desarmarlas. Rocíe un agente limpiador al 5% con actividad superficial a través del vaporizador para eliminar los contaminantes internos.

Luego, remoje la botella del vaporizador, la tapa y el vaporizador en el agente de limpieza durante toda la noche. Al día siguiente, seque el vaporizador, la tapa y las botellas bajo una campana de flujo laminar estéril. A continuación, use etanol al 70 % para llenar las botellas.

Posteriormente, vuelva a colocar el vaporizador y rocíe un poco del etanol a través del mismo. Coloque la tapa sobre el vaporizador y guárdelo con etanol en su interior hasta su uso. Antes de usarlo, utilice caldo BHI estéril para enjuagar asépticamente el frasco y rocíe el caldo a través del vaporizador.

Para preparar cultivos bacterianos nocturnos, realice un aislamiento por estrías de las cepas competidora e inhibidora en una placa de agar BHI estéril e incube a 37 grados Celsius de forma aeróbica durante aproximadamente 18 horas. En un frasco universal de 28 mililitros, inocule 10 mililitros de caldo BHI estéril con una única colonia de la cepa bacteriana competidora requerida. Incube el cultivo en un agitador orbital universal a 37 grados Celsius y 250 RPM durante la noche.

Al día siguiente, asegúrese de que las placas de agar estén completamente secas y no tengan condensación en la tapa, para evitar que la inoculación se extienda sobre la placa. Pipetee 25 microlitros de la cultura de crecimiento nocturno en el centro de las placas de agar, evitando presionar completamente el émbolo de la pipeta para prevenir burbujas de aire que puedan rociar la cultura sobre el agar. Deje secar la cultura a temperatura ambiente para limitar su dispersión.

A continuación, incubar las placas de agar a 37 grados Celsius de forma aeróbica durante la noche. Después de cultivar una cultura nocturna, y trabajando bajo una cabina de seguridad de nivel dos forrada con papel absorbente, utilizar caldo BHI para diluir la cultura diez veces, obteniendo aproximadamente cuatro por diez a la sexta UFC por mililitro. Luego, verter la cultura diluida en una botella estéril de vaporizador de perfume de plástico.

Para realizar un ensayo de inhibición del crecimiento diferido, rocíe el cultivo a través de cada una de las botellas del vaporizador para asegurar que el cultivo se cargue en el mecanismo de pulverización antes de rociarlo sobre el agar. Desde una distancia de aproximadamente 15 centímetros por encima del agar, aplique por pulverización aproximadamente 250 microlitros de cultivo diluido sobre toda la superficie del agar. Incube las placas a 37 grados Celsius de forma aeróbica durante la noche.

Para interpretar la inhibición diferida del crecimiento, mida la zona de inhibición del crecimiento de la cepa competidora rociada en milímetros, restando el diámetro del punto central de la cepa productora del inhibidor. Finalmente, registre la puntuación de claridad para las zonas de inhibición según el protocolo descrito en el texto. Como se muestra en esta figura, los resultados del ensayo deben observarse como una diferencia en la cepa competidora superpuesta cerca de la cepa productora del inhibidor ubicada en el centro.

Las diferencias pueden ser inhibición completa, inhibición parcial, ausencia de inhibición o asociación positiva. Este gráfico compara las zonas de inhibición entre aislamientos productores de inhibidores, lo cual puede deberse a la cantidad de antimicrobiano producido, la capacidad del inhibidor para difundirse a través del medio, el tipo de inhibidor producido o el nivel de resistencia de la cepa competidora frente a los inhibidores. Este ejemplo muestra que si la concentración de la cepa competidora de prueba es demasiado baja, la zona de inhibición parecerá más grande y con un borde menos definido de lo que normalmente se observa.

Si el punto de la cepa productora de inhibidor no se secó completamente antes de la incubación nocturna, la cepa inhibidora se extenderá y no formará un punto completamente definido. Alternativamente, si la cepa competidora no se rocía de manera uniforme, esto puede provocar una dispersión desigual de las bacterias. Finalmente, si la cepa competidora está demasiado concentrada, podría crecer encima de la cepa inhibidora y, en casos extremos, provocar una inversión de los papeles entre la cepa competidora y la inhibidora.

Una vez dominada, esta técnica tomará una hora distribuida en cuatro días por cada par de aislamientos analizados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar rociar de manera uniforme con buena replicación entre los ensayos. Tras seguir este procedimiento, los datos de inhibición pueden superponerse con datos taxonómicos sobre la presencia o ausencia de una especie bacteriana en una comunidad.

Luego es posible determinar si los efectos inhibitorios influyen en la capacidad de una especie para colonizar un ambiente. Tras su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores en el campo de los microbiomas comunitarios explorar los efectos de la varianza de rasgos, como la predicción de péptidos antimicrobianos, en la estructura comunitaria y en la exclusión competitiva. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo comparar la capacidad de un aislado bacteriano para inhibir competitivamente el crecimiento de otro, tanto de manera cualitativa como cuantitativa.

No olvide que trabajar con bacterias aerosolizadas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como trabajar dentro de una cabina de seguridad de nivel dos y usar equipo de protección personal (EPP) adecuado al realizar este procedimiento.