La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

En este trabajo detallamos la metodología seguida para comparar la eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar inducida por la inmunización intranasal y subcutánea con BCG en un modelo de ratón. Nuestros resultados muestran los beneficios de la vacunación pulmonar y sugieren un papel de la respuesta mediada por IL17 en la protección inducida por la vacuna.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las respuestas inmunitarias en los pulmones después de la inmunización contra la tuberculosis, incluida la eficacia protectora de la vacuna contra un desafío intranasal y la respuesta inmunitaria pulmonar local inducida por la vacuna. Esta metodología puede ayudar a responder a nuestras preguntas clave en la vacuna contra la tuberculosis, incluida la identificación de las respuestas inmunitarias pulmonares defensivas que generan las vacunas pulmonares para una protección inmunitaria pulmonar óptima. Un beneficio de esta metodología es que la respuesta inmune pulmonar de su animal se evalúa individualmente en paralelo con la eficacia protectora.

permitiendo la identificación de los parámetros inmunitarios específicos que se correlacionan con la protección. Para la administración subcutánea de la vacuna BCG, primero, llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 con un mililitro de la suspensión de la vacuna BCG y retire las burbujas de aire. A continuación, coloque un ratón anestesiado en posición prona dentro de una campana de flujo laminar e inocule subcutáneamente al animal con 100 microlitros de bacterias en un flanco trasero.

Para la administración intranasal, cargue una micropipeta con 20 microlitros de la suspensión BCG y coloque el ratón anestesiado en posición supina dentro de la capucha. Administre el inóculo gota a gota entre las dos fosas nasales hasta que se haya depositado todo el volumen de 20 microlitros, dejando tiempo entre las gotas para permitir que el ratón inhale la suspensión. A continuación, vuelva a cargar la micropipeta con otros 20 microlitros de bacterias y repita la administración.

Para la provocación intranasal con la cepa de microbacteria H37Rv tuberculosis, en el momento experimental apropiado después de la vacunación, inocular a los animales con la administración intranasal de 40 microlitros de la suspensión bacteriana H37Rv, como se acaba de demostrar. Para adquirir el lavado broncoalveolar o la muestra de bola, primero use pinzas estériles y tijeras para exponer la tráquea. A continuación, haga una pequeña incisión en la tráquea, teniendo cuidado de no extirpar el tejido por completo, e inserte una cánula conectada a una jeringa estéril de 1 ml, que contiene 800 microlitros de PBS helado.

Cuando la cánula esté en su lugar, llene cuidadosamente los pulmones con el PBS, luego tire lentamente del émbolo para recuperar al menos 500 a 600 microlitros de líquido de lavado. Dispense la bola en un tubo de 1,5 ml con hielo y confirme que la suspensión sea incolora, lo que indica una falta de contaminación sanguínea. Guarde las muestras en hielo hasta que la bola se procese.

Para determinar la carga bacteriana y la respuesta inmunitaria en los pulmones, fije el ratón con agujas en posición supina sobre una superficie plana y desinfectada dentro de la campana de flujo laminar, y haga una incisión en la piel superior sobre el tórax. Luego, retira la piel para exponer el área torácica y abre los pulmones. Use tijeras y fórceps estériles para extraer los pulmones y el corazón, y coloque los órganos sobre una superficie limpia.

Luego, extirpa el corazón, la tráquea y el tejido conectivo. Coloque cada pulmón en un tubo diferente de 1,5 mL con 1 mL de agua desionizada sobre hielo para determinar posteriormente la carga bacteriana y las respuestas inmunitarias celulares. En comparación con la vía subcutánea, la vía intranasal de vacunación confiere una eficacia protectora mucho mayor en los pulmones.

El análisis de un número representativo de colonias del grupo de vacunas intranasales BCG mediante PCR específica para la región del genoma RD9 demuestra que todas las colonias proporcionan un fragmento de 0,4 kilopares de bases que corresponden a H37Rv. La BCG intranasal desencadena una mayor IL17 e interfiere en la producción de gamma en los pulmones, revelando una correlación entre la eficacia protectora conferida por la vacunación intranasal con BCG y la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna en los pulmones antes del desafío con una mayor concentración de IgA específica del derivado de proteína purificada total y H37Rv en las muestras de lavado observadas para los receptores de la vacuna intranasal. Un análisis más detallado de las células productoras de citocinas en los pulmones después del desafío con tuberculosis reveló que, mientras que se detectaron interferencias en las células productoras de gamma en todos los grupos infectados, las células CD4+ productoras de IL17A solo se encontraron en el grupo de BCG intranasal, lo que demuestra una correlación significativa entre la presencia de IL17 y la reducción de la carga pulmonar bacteriana.

Siguiendo este procedimiento, es posible comparar las respuestas inmunológicas pulmonares locales en el uso de vacunas biodiversas contra la tuberculosis, así como diferentes vías de administración y puntos de tiempo después del desafío. Además, esta metodología se puede utilizar para evaluar la inmunitidad en el uso de la vacunación después de la provocación. Lo que podría permitir la identificación de las respuestas inmunitarias que se correlacionan con la protección.

Es importante destacar que trabajar con Mycobacterium tuberculosis requiere instalaciones de laboratorio libres de BCL, y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al realizar este procedimiento.