Name: La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprende a evaluar la eficacia protectora de la vacuna BCG administrada por vía intranasal y subcutánea en ratones. Este método permite analizar las respuestas inmunes pulmonares y el papel de IL17 en la protección contra la tuberculosis.

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Este trabajo fue apoyado por el "Ministerio de Economía y Competitividad de España" [subvención número BIO2014-5258P], la "Comisión Europea" por los programas H2020 [números de subvención TBVAC2020 643381].

Todos los ratones se mantuvieron bajo condiciones controladas y se observó ningún signo de enfermedad. El trabajo experimental se llevó a cabo de acuerdo con las directivas europeas y nacionales para la protección de los animales de experimentación y con la aprobación de los comités de ética locales competentes. 1. Preparación de las poblaciones cuantificado de glicerol de BCG danesa y Mycobacterium tuberculosis H37Rv NOTA: Todos los protocolos descritos se realizaron en condiciones BSL3. <ol><li> Descongelar las existencias de glicerol congeladas de BCG danés o cepas H37Rv e inocular 100 l en 10 ml de medio 7H9 10 suplementado con Tween-80 0,05% (v / v) y ADC (albúmina, dextrosa, catalasa) 10% (v / v). </li><li> Incubar en condiciones estáticas durante una semana a 37 ° C hasta que el cultivo está en crecimiento en fase logarítmica. </li><li> Ampliar la escala de cultivo bacteriano mediante la transferencia del cultivo de 10 ml a 200 ml de medio fresco. Incubar durante 20 adicionaldías bajo condiciones estáticas. </li><li> Transferir a tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugar durante 15 minutos a 2500 x g. </li><li> Desechar los sobrenadantes y resuspender sedimento bacteriano en el volumen residual. Añadir a cada tubo de perlas de vidrio de 3 mm de diámetro estériles (10 - 15) por tubo. </li><li> Vortex vigorosamente durante 1 min con el fin de disociar grupos bacterianas. Resuspender cada sedimento en 10 ml de PBS con Tween-80 0,05% (v / v). </li><li> Deja tubos durante 10 minutos permitiendo que los grandes agregados bacterianos y perlas de vidrio para establecerse. </li><li> Recuperar 9,5 ml de sobrenadante de cada uno de los 4 tubos que contenían pequeños grupos y bacterias individuales y volúmenes de transferencia a un solo tubo de centrífuga de 50 ml nuevo (volumen final recuperado 38 ml). Centrifugar durante 10 min a 400 x g. </li><li> Recuperar 35 ml de sobrenadante (que contienen bacterias principalmente individuales) en un solo tubo de centrífuga de 50 ml fresco y añadir 15 ml de PBS con glicerol 50% (v / v), obteniéndose una concentración final de glicerol de 15% (v / v). </li><li> mezclar suavementey distribuir en alícuotas de 1 ml en tubos adecuados para la congelación. Almacenar a -80 ° C (un lote proporciona aproximadamente 50 alícuotas de glicerol). </li><li> Para cuantificar las existencias de glicerol, descongelar un glicerol el día después de la congelación y realizar siete diluciones en serie de diez veces en los tubos de 1,5 ml separados que contienen 900 l de PBS. </li><li> Plate 100 l de cada dilución en medio sólido 7H10 agar-10 suplementado con ADC 10% (v / v) preparado en el diámetro platos 55 mm de Petri. </li><li> Añadir con cuidado 3 perlas de vidrio mm de diámetro (aprox. 10 por plato) y agitar suavemente la placa para distribuir por igual volumen sobre la placa de agar. Desechar los granos y sellar placa de agar con parafilm. </li><li> Incubar durante 21 días a 37 ° C y determinar la concentración bacteriana mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en la dilución donde las colonias individuales se pueden distinguir con precisión. </li></ol> 2. Ratón Vacunación <ol><li> Descongelar un pre-glicerol cuantificado BCG y diluirlo en PBS para la preparación deson dos suspensiones. Calcular volumen final teniendo en cuenta la dosis por animal es de 100 l para la administración subcutánea (10 7 UFC por ml para la vacunación subcutánea) y 40 l para la administración intranasal (2,5 x 10 7 UFC para la vacunación intranasal). </li><li> Utilice una estación de trabajo de anestesia especializado para roedores para anestesiar a los ratones con una mezcla de isoflurano y oxígeno. Utilice isoflurano 5% para inducir la anestesia y 2% para mantener los ratones en la cámara de anestesia. (Otro método de anestesia aceptada se puede utilizar). </li><li> Para la administración subcutánea de la vacuna llenar una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G con 1 ml de suspensión bacteriana (10 7 CFU / ml). Eliminar las burbujas de aire. </li><li> Colocar un ratón anestesiado en una superficie plana en la posición propensa dentro de una campana de flujo laminar y inocular por vía subcutánea 100 l (10 6 UFC / dosis) de vacuna en un costado de la ratón de nuevo. Vuelva a colocar el puntero del ratón a la jaula y su seguimiento para asegurarse de que properly se recupera de la anestesia. </li><li> Cambiar la aguja de la jeringa entre cada administración ratón. Eliminado las burbujas de aire como se describió anteriormente. </li><li> Para la administración intranasal, colocar un ratón anestesiado en posición supina interior de la campana. </li><li> Con una micropipeta tomar 20 l de la suspensión con 2,5 x 10 7 UFC / ml. Coloque la gota a gota inóculo entre las dos ventanas de la nariz hasta que todo el volumen se ha depositado, dejando tiempo entre gotas para permitir el ratón respirar el volumen. Nota: los ratones pueden sufrir de dificultad respiratoria durante este procedimiento por lo que debe dejarse en manos de asimilar cada gota antes de administrar la siguiente para evitar que tanto como sea posible. </li><li> Volver a llenar la micropipeta con otro 20 l y repetir la operación. Si el ratón comienza a despertar de la anestesia después de la primera inoculación, colocarlo en la cámara de la anestesia antes de la segunda. Vuelva a colocar el puntero del ratón a la caja y asegúrese de que se recupere correctamentede la anestesia. </li></ol> 3. Ratón Desafío intranasal con la cepa H37Rv <ol><li> Descongelar un glicerol pre-cuantificado H37Rv y diluir en PBS para preparar una suspensión bacteriana de 2.500 CFU por ml. Calcular volumen final teniendo en cuenta la dosis por animal es de 40 l. </li><li> H37Rv se inocula por vía intranasal como se describe en 2.5 a 2.7. Dosis desafío final por ratón es 10 2 UFC / 40 l. </li></ol> 4. Análisis de Inducida Respuesta Inmune en los pulmones <ol><li> Suspensión celular de pulmón NOTA: Evaluación de la respuesta inmune adaptativa inducida por la vacuna en los pulmones requiere la generación de suspensión de células individuales. Para este fin, se utiliza un disociador de tejido, tal como gentleMACS. <ol><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical (u otra metodología aceptada humana) y asegúrese de ratón está muerto tocar el globo ocular para confirmar la ausencia de reflejo de parpadeo. </li><li> Dentro de una campana de flujo laminar, extraer el lUNGS usando tijeras y pinzas estériles y colocarlos sobre una superficie limpia. pulmones limpias eliminación de la tráquea y el tejido conectivo, y la transferencia de los pulmones a un tubo de 1,5 ml con PBS (mantener en hielo hasta el procesamiento). </li><li> Para generar una suspensión celular, colocar los pulmones en un tubo adecuado para la disociación de órganos (tubo C-disociador) que contiene 5 ml de 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2 y 1,8 mM CaCl 2 buffer. </li><li> Añadir 100 ml de colagenasa D 100 mg / ml (2 mg / ml de concentración final), y 40 l de DNasa I 20.000 UI / ml (160 IU / ml de concentración final. NOTA: Las soluciones madre de colagenasa D o ADNasa I se preparan disolviendo enzimas liofilizadas en PBS o glicerol 50% (v / v), Tris-HCl 20 mM pH 7,5 y MgCl 2 1 mM, respectivamente. </li><li> Se coloca el tubo en el disociador de tejidos y utilizar el m_lung_01 programa predefinido para la fragmentación de pulmón. Incubar el tubo a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos. </li><li> º lugartubo de correo en el disociador y utilizar el m_lung_02 programa predefinido para la homogeneización de pulmón completa en la suspensión celular única. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de nylon de 70 micras instalado en un tubo de centrífuga de 50 ml. Lavar el filtro con 10 ml de RPMI 1640 medio. </li><li> Centrifugar las células durante 5 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de lisis de eritrocitos, mezclar mediante agitación y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 10 ml de RPMI 1640 células medianas y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Resuspender las células en 0,5 ml de medio completo RPMI 1640 suplementado con inactivado por calor 10% suero de ternero fetal (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 mg / ml de estreptomicina, 100 UI / ml de penicilina y 50 mM 2-mercaptoetanol. NOTA: FCS se inactiva por incubación a 56 ° C durante 30 minutos. </li><li> Recuento de células y añadir completo RPMI 1640 medio para llegar a la densidad celular final de 10 7 células / ml. NOTA: Para el recuento de células, se utiliza el contador de células automatizado. </li><li> Distribuir 100 l de suspensión celular en fondo en U placa de 96 pocillos estériles (10 6 células / pocillo). </li><li> Añadir 50 l / pocillo de medio completo RPMI 1640 con 15 g / ml de H37Rv comercial derivado proteínico purificado (PPD) (5 mg / ml de concentración final). </li></ol></li><li> Colección sobrenadante para la determinación de citoquinas por ELISA <ol><li> Incubar la placa a partir 4.1.14 durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> placa Centrifugar durante 5 min a 400 xg y recuperar 100 l de sobrenadante. </li><li> Almacenar a -80 ° C. </li><li> Diluir sobrenadantes 1/10 y 1/2 en tampón de ensayo para IFN y determinación IL17A, respectivamente. Determinar las concentraciones de citoquinas con kits ELISA comerciales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kits de desarrollo de ELISA). </li></ol></li><li> Tinción intracelular para la determinación de citoquinas-producir células CD4 + por citometría de flujo <ol><li> Incubar la placa a partir 4.1.14 durante 18 horas a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Añadir 1,5 l de Brefeldina A 1 mg / ml (Stock disuelto en DMSO) a cada (concentración final 10 mg / ml) bien e incubar durante seis horas adicionales. </li><li> Se centrifuga la placa de 4.3.2 durante 1 minuto a 3200 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 50 l de anti-ratón CD4-FITC diluidas en RPMI 1640 con 10% de FCS (1/500) y se incuba durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Se centrifuga la placa de 4.3.4 durante 1 min a 3.200 xg, desechar el sobrenadante y añadir solución de 100 l / pocillo de fijación. Se incuba a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Lavar las células dos veces con 150 l / lavado de solución de permeabilización. NOTA: 10x concentrado se diluye en agua desionizada para preparar la solución de trabajo 1x. </li><li> Resuspender las células en 50 l de anti-ratón IFN-APC y anti-ratón-IL17A APC.Cy7 diluyeron en permeabilsolución zación (1/250 ambos anticuerpos). </li><li> Incubar durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar las células dos veces con 150 l / lavado de solución de permeabilización. </li><li> Resuspender las células en 200 l de PBS para la adquisición de citometría de flujo. </li></ol></li></ol> 5. Análisis de inmunoglobulinas en lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li> Obtención de muestras de BAL <ol><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical (u otra metodología aceptada humana) y asegúrese de ratón está muerto tocar el globo ocular para confirmar la ausencia de reflejo de parpadeo. </li><li> Exponer la tráquea utilizando adecuada precisión pinzas y tijeras estériles y realizar una pequeña incisión en la tráquea, asegurándose de no extirpar por completo. Tenga cuidado de no causar una hemorragia que podría contaminar la muestra BAL. </li><li> Introducir en la tráquea una cánula conectada a una jeringa de 1 ml estéril con 800 l de PBS enfriado en hielo. </li><li> Inocular lentamente el PBS en los pulmones y entonces rEcover volumen BAL tirando hacia atrás del pistón de la jeringa muy lentamente con el fin de evitar el colapso pulmonar. NOTA: Recuperación de 500 a 600 l es satisfactoria. </li><li> Transferir el volumen BAL en un tubo de 1,5 ml y confirmar BAL permanece incolora, lo que indica que no está contaminada con sangre (mantener en hielo hasta su procesamiento). </li><li> Centrifugar las muestras de BAL para 5 min a 400 xg, y la transferencia de sobrenadante a un nuevo tubo. </li><li> sobrenadantes almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Determinación de IgA en BAL sobrenadantes NOTA: Todos los reactivos utilizados son a TA. <ol><li> Poliestireno de unión de alta proteína de la cubierta de fondo plano de placas de 96 pocillos con 100 l de PPD diluido en PBS (10 mg / ml) para M. la tuberculosis determinación de IgA específicos de, o con 100 l de sobrenadante BAL diluidas 10 veces en PBS para la determinación de IgA total. </li><li> Incubar toda la noche a 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante y toque la placa sobre una toalla de papel para dry. Se lava con 200 l / pocillo de PBS. </li><li> Bloquear con 200 l / pocillo de una albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (w / v) en PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampón de bloqueo). </li><li> Incubar 1 hora a RT. </li><li> Lavar una vez con 200 l / pocillo de (v / v) (tampón de lavado) PBS-Tween-80 0,05%. </li><li> Añadir 100 ml de sobrenadante de BAL sin diluir en los pocillos recubiertos con PPD. Incubar dos horas a temperatura ambiente. NOTA: Si la determinación de IgA total se realiza en paralelo con el PPD-IgA específica, deje pozos totales de IgA con tampón de lavado 100 l durante esta incubación. </li><li> Lavar tres veces con 200 l / pocillo de lavado buffer.0170004 </li><li> Añadir 100 l de peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anti-ratón de IgA diluido en tampón de bloqueo (1 / 10.000). </li><li> Incubar 1 hr RT. </li><li> Lavar cinco veces con 200 l / pocillo de tampón de lavado. </li><li> Añadir 100 l / pocillo de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 20 min a temperatura ambiente en tque oscuro. </li><li> Añadir 100 l / pocillo de H 2 SO 4 0,5 N. Leer la placa en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. determinación de carga bacteriana en los pulmones <ol><li> Homogeneización de pulmón y de las planchas <ol><li> Cuatro semanas después de la exposición, sacrificar el ratón por dislocación cervical (u otra metodología aceptada humana) y asegúrese de ratón está muerto tocar el globo ocular para confirmar la ausencia de reflejo de parpadeo. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina fija en una superficie plana y desinfectada dentro de una campana de flujo laminar. </li><li> Hacer una incisión y quitar la piel de la región del pecho para dejar visible la zona torácica. </li><li> Cortar las costillas y la cosecha de los pulmones y el corazón con unas tijeras y pinzas estériles. Colocar los órganos en una superficie limpia. </li><li> Limpiar los pulmones mediante la eliminación del corazón, la tráquea y el tejido conectivo y la transferencia de los pulmones a un tubo de 1,5 ml con 1 ml de agua desionizada(Mantener en hielo hasta su procesamiento). </li><li> El uso de fórceps estériles para transferir los pulmones de cada ratón en un tubo adecuado para la homogeneización de órganos (M - tubo disociador), que contiene 1 ml de agua desionizada. </li><li> Colocar el tubo en el disociador de tejido y usar el RNA_1 programa predefinido para homogeneizar los pulmones. </li><li> Hacer cinco diluciones seriadas de diez veces en tubos de 1,5 ml, comenzando con 100 l de homogeneizado de pulmón diluidos en 900 l. </li><li> diluciones placa como se describe en 1.11 a 1.14. </li></ol></li><li> La diferenciación entre BCG y H37Rv por PCR NOTA: En las placas de 6.1.6 correspondientes al grupo vacunado con BCG por vía intranasal, se analizó un número representativo de colonias por una PCR discernir entre BCG y H37Rv para asegurar que la CFU considerado para evaluar la eficacia protectora de la vacuna confiere correspondió única para H37Rv. Este objetivos amplificación por PCR de RD9, una región genómica diferente en BCG y M. tuberculosis, dando un fragmento de 2618 pb para H37Rv, y 465 pb para la BCG 11. <ol><li> Preparar una mezcla maestra de stock para todas las muestras con volúmenes por ejemplo como se indica, y luego distribuir en tubos de PCR (9 l / muestra). NOTA: tampón 5x: 2 l. Cebador directo 25 M (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 l, cebador inverso 25 M (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 l, Taq polimerasa 5 unidades / l: 0,04 l, desionizada H2O: 6,32 l. </li><li> Toca una colonia con un palillo estéril y sumergir el palillo de dientes con la muestra en un tubo de PCR que contiene la mezcla maestra. </li><li> Ejecutar la PCR con el siguiente programa: 10 min 95 ° C (este paso es para disparar la interrupción bacteriana), 10 min 95 ° C (este paso es para disparar la interrupción bacteriana), 35 ciclos (30 segundos a 95 ° C, 1 min a 58 ° C y 4 min a 72 ° C). </li><li> Cargar las muestras de PCR en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio y muestras de ejecución para visualizar los fragmentos. </li&gt; </ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la vacuna actual contra la tuberculosis, BCG, es la vacuna más administrada en la historia, la tuberculosis sigue siendo una de las principales causas de muerte y morbilidad por enfermedades infecciosas en todo el mundo. Esta paradoja se explica por la falta de protección de esta vacuna contra la tuberculosis pulmonar, la forma responsable de transmisión. Se necesitan urgentemente nuevos enfoques de vacunación eficaces contra las formas pulmonares de la enfermedad, ya que tendrían el mayor impacto en la transmisió...

La tuberculosis (TB) es una de las principales enfermedades infecciosas que causan más muertes asociadas que el VIH en el mundo y unida a la creciente aumento de cepas resistentes a múltiples fármacos TB hace un problema de salud mundial alarmante 1. Las nuevas herramientas de diagnóstico, medicamentos más eficaces y menos tóxicos, y nuevas vacunas contra la tuberculosis seguros y eficaces son una necesidad urgente, especialmente en el mundo en desarrollo. En vivo atenuado bacilo de Calmette-Guerin (BCG) es actualmente la única vacuna autorizada contra la tuberculosis, que ha sido administrada por vía intradérmica en el nacimiento desde 1970 en todo el mundo. BCG se considera eficaz en la prevención de las formas graves de la enfermedad (meningitis y tuberculosis miliar) en niños, pero ha demostrado eficacia contra la TB pulmonar incompatible responsable de la transmisión de la enfermedad 2. la vacunación pulmonar, que imita ruta natural de la infección tuberculosa, representa un enfoque atractivo para la imprimación de la respuesta inmune anfitrión locals. En este sentido, varios trabajos preclínicos en diferentes modelos animales pertinentes TB han demostrado una mayor eficacia de la vacuna después de la inmunización pulmonar en comparación con la vía subcutánea o intradérmica 3-6. Sin embargo, los mecanismos de protección provocados por la vacunación pulmonar no se conocen bien. En los últimos años, varios trabajos han señalado hacia respuesta mediada por IL17 como un factor importante de la respuesta inmune de la mucosa-TB específica, como en modelos de ratones deficientes para IL17 eficacia protectora inducida por la vacuna de la mucosa se ​​vea obstaculizada 7,8. Recientemente hemos demostrado por primera vez que la administración intranasal BCG protege ratones DBA / 2, una cepa de ratones que se caracteriza por la falta de protección después de la vacunación con BCG subcutáneo 9. Estos resultados sugieren que la vacunación contra la tuberculosis respiratoria podría ser más eficaz en la reducción de la tasa de tuberculosis en los países endémicos, donde se considera ineficaz contra pulmon BCG intradérmicaTB aria.

<table><tbody><tr><td>Caldo Middlebrook 7H9</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enriquecimiento</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio de 3 mm de diámetro</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml 26GA 0,45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Disociador GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td><td>C Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro; m Filtro de células</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisado de glóbulos rojos</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x solución concentrada</td></tr><tr><td>de penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrado</td></tr><tr><td>Suero de ternera fetal</td><td>biológico Industrias</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Contador de células automatizado de mano</td><td>Millipore PHCC20040</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scepter Sensores de contador de células, 40 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis - Tuberculina PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IFN-&gamma; Kit de desarrollo ELISA&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL17A Kit de desarrollo ELISA&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rata Anti-Ratón CD4</td><td>BD 553047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Kit Cytoperm</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rata Anti-ratón IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Ratón Anti-ratón IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4"</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Utilizada como cánula de tráquea para</td></tr><tr><td>placas de poliestireno de alta unión a proteínas BAL de 96 pocillos MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina, de suero bovino</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>IgA anti-ratón de cabra (&alfa;-cadena específica)&menos; Anticuerpo peroxidasa</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetrametilbencidina (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq ADN Polimerasa</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>El kit incluye tampón 5x</td></tr></tbody></table>

la eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal bcg en ratones

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

A pesar de la cobertura mundial de la vacunación intradérmica con BCG, la tuberculosis sigue siendo una de las enfermedades infecciosas más prevalentes en el mundo. Los datos preclínicos han alentado las vacunas contra la tuberculosis pulmonar como una estrategia prometedora para prevenir la enfermedad pulmonar, que es responsable de la transmisión. En este trabajo describimos la metodología utilizada para demostrar en el modelo de ratón los beneficios de la vacunación intranasal con BCG en comparación con la subcutánea. Nuestros datos revelaron una mayor eficacia protectora tras la administración intranasal de BCG. Además, nuestros resultados indican que la vacunación pulmonar desencadena una mayor respuesta inmunitaria en los pulmones, incluyendo respuestas Th1 y Th17, así como un aumento de la concentración de inmunoglobulina A (IgA) en las vías respiratorias. Nuestros datos muestran una correlación entre la eficacia protectora y la presencia de células productoras de IL17 en los pulmones después de la provocación con Mycobacterium tuberculosis, lo que sugiere un papel de esta citocina en la respuesta protectora conferida por la vacunación pulmonar. Por último, detallamos el flujo de trabajo global que hemos desarrollado para estudiar la vacunación respiratoria en el modelo de ratón, que podría extrapolarse a otras vacunas contra la tuberculosis, aparte de la BCG, dirigidas a la respuesta mucosa u otras vías pulmonares de administración como la intratraqueal o el aerosol.

Este trabajo describe la comparación de las dos vías de administración de BCG: subcutánea e intranasal. Vía subcutánea es comparable a la intradérmica, que es la ruta clínica actual para BCG en todo el mundo. Vía intranasal de la vacuna pretende imitar la ruta natural de la infección de M. la tuberculosis, con el objetivo de inducir la respuesta inmune directamente en los pulmones, el principal órgano afectado por este patógeno. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

En este trabajo detallamos la metodología seguida para comparar la eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar inducida por la inmunización intranasal y subcutánea con BCG en un modelo de ratón. Nuestros resultados muestran los beneficios de la vacunación pulmonar y sugieren un papel de la respuesta mediada por IL17 en la protección inducida por la vacuna.

La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las respuestas inmunitarias en los pulmones tras la inmunización contra la tuberculosis, incluyendo la eficacia protectora de la vacuna frente a un desafío intranasal y la respuesta inmunitaria pulmonar inducida por la vacuna. Esta metodología puede ayudar a responder nuestras preguntas clave en el campo de las vacunas contra la tuberculosis, incluyendo la identificación de las respuestas inmunitarias pulmonares defensivas activadas por vacunas pulmonares para lograr una protección inmunitaria óptima en los pulmones. Una ventaja de esta metodología es que la respuesta inmunitaria pulmonar de cada animal se evalúa individualmente en paralelo con la eficacia protectora.lo que permite la identificación de los parámetros inmunitarios específicos que se correlacionan con la protección. Para la administración subcutánea de la vacuna BCG, primero llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 con un mililitro de la suspensión de la vacuna BCG, y elimine las burbujas de aire. Luego, coloque un ratón anestesiado en posición prona dentro de una cabina de flujo laminar, e inocule al animal subcutáneamente con 100 microlitros de bacterias en el flanco trasero.Para la administración intranasal, cargue una micropipeta con 20 microlitros de la suspensión de BCG y coloque el ratón anestesiado en posición supina dentro de la campana. Administre el inóculo gota a gota entre las dos fosas nasales hasta que se haya depositado todo el volumen de 20 microlitros, dejando tiempo entre las gotas para permitir que el ratón inhale la suspensión. Luego, recargue la micropipeta con otros 20 microlitros de bacterias y repita la administración.Para la inoculación intranasal con la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis, en el momento experimental adecuado posterior a la vacunación, inocule a los animales mediante administración intranasal de 40 microlitros de la suspensión bacteriana H37Rv tal como se acaba de demostrar. Para obtener la muestra de lavado broncoalveolar o muestra BAL, primero use pinzas y tijeras estériles para exponer la tráquea. Luego realice una pequeña incisión en la tráquea, teniendo cuidado de no extirpar completamente el tejido, e inserte una cánula conectada a una jeringa estéril de 1 mL que contenga 800 microlitros de PBS frío con hielo.Una vez colocada la cánula, llenar cuidadosamente los pulmones con el PBS y luego retirar lentamente el émbolo para recuperar al menos 500 a 600 microlitros de líquido de lavado. Depositar la muestra en un tubo de 1,5 mL sobre hielo y confirmar que la suspensión sea incolora, lo que indica ausencia de contaminación sanguínea. Almacenar las muestras sobre hielo hasta el procesamiento de la muestra.Para determinar la carga bacteriana y la respuesta inmune en los pulmones, sujete el ratón con agujas en posición supina sobre una superficie plana y desinfectada dentro de la cabina de flujo laminar, y realice una incisión en la piel superior del tórax. Luego, retire la piel para exponer la zona torácica y abra los pulmones. Utilice tijeras y pinzas estériles para extraer los pulmones y el corazón, y coloque los órganos sobre una superficie limpia.Luego, retire el corazón, la tráquea y el tejido conectivo. Coloque cada pulmón en un tubo diferente de 1,5 mL con 1 mL de agua desionizada sobre hielo para la determinación posterior de la carga bacteriana y las respuestas inmunitarias celulares. En comparación con la vía subcutánea, la vía de vacunación intranasal confiere una eficacia protectora mucho mayor en los pulmones.El análisis de un número representativo de colonias del grupo vacunado con BCG intranasal mediante PCR específica para la región genómica RD9 demuestra que todas las colonias proporcionan un fragmento de 0,4 kilo pares de bases que corresponde a H37Rv. El BCG intranasal induce una mayor producción de IL-17 e interferón gamma en los pulmones, lo que revela una correlación entre la eficacia protectora conferida por la vacunación con BCG intranasal y la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna en los pulmones antes del desafío, junto con una concentración más elevada tanto de IgA total como de IgA específica frente al derivado proteico purificado de H37Rv en las muestras de lavado observada en los receptores de la vacuna intranasal. Un análisis adicional de las células productoras de citoquinas en los pulmones tras el desafío con tuberculosis reveló que, aunque se detectaron células productoras de interferón gamma en todos los grupos infectados, las células CD4+ productoras de IL-17A se encontraron únicamente en el grupo vacunado con BCG intranasal, demostrando una correlación significativa entre la presencia de IL-17 y la reducción de la carga bacteriana pulmonar.Tras seguir este procedimiento, es posible comparar las respuestas inmunitarias locales en el pulmón frente al uso de vacunas biodiversas contra la tuberculosis, así como diferentes vías de administración y puntos temporales tras el desafío. Además, esta metodología puede utilizarse para evaluar la inmunidad inducida por la vacunación tras el desafío, lo que podría permitir la identificación de las respuestas inmunitarias que se correlacionan con la protección.Es importante destacar que trabajar con Mycobacterium tuberculosis requiere instalaciones de laboratorio libres de BCL, y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, describimos un protocolo para probar la eficacia de una vacuna acelular contra la tos ferina contra la infección por Bordetella pertussis en ratones. Después de la vacunación, los ratones se sometieron a la infección y su homogeneizado de tejido se cultivó para analizar las colonias bacterianas como una lectura de la inmunidad protectora inducida por la vacuna.

Evaluación de la inmunidad inducida por vacunas contra la infección bacteriana en un modelo de ratón

Este video muestra la inmunización intranasal con BCG en ratones, activando tanto las respuestas inmunitarias innatas como las adaptativas, lo que lleva al desarrollo de células T de memoria residentes en el pulmón y células B efectoras, mejorando así la protección contra las infecciones por Mycobacterium.

Inmunización intranasal con BCG en un modelo de ratón

La vacunación profiláctica y terapéutica a menudo falla para estimular respuestas inmunes fuertes debido a la semana de drenaje de la vacuna a los ganglios linfáticos y en consecuencia pobres implicación de células inmunes. Por inyección directa de la vacuna a los ganglios linfáticos, así llamada inyección intralinfática, eficacia de la vacuna puede ser fuertemente mejorada y dosis de la vacuna se puede reducir.

Intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones

El presente trabajo ilustra la conveniencia de utilizar la inmunoterapia sublingual para estimular la respuesta inmune innata en los pulmones y conferir protección contra la neumonía neumocócica aguda en ratones.

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

Cultivaron interferón-γ ensayo inmunospot ligado a enzimas a largo plazo se utiliza como una medida de respuestas de memoria centrales y se correlaciona con respuestas a la vacuna anti-micobacterianas protectoras. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica son estimulados con antígenos de micobacterias y la interleucina-2 durante 14 días, permitiendo la diferenciación y expansión de las células T de memoria centrales.

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.

Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina

El desarrollo de la prueba de interferón-gamma ELISpot para conejillo de Indias PBMCs permite la caracterización de las respuestas de células T en este modelo altamente relevante para el estudio de las enfermedades infecciosas. Hemos aplicado el ensayo para medir las respuestas de células T asociadas con entrega intradérmica de vacunas de ADN.

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Aprende a evaluar la eficacia protectora de la vacuna BCG administrada por vía intranasal y subcutánea en ratones. Este método permite analizar las respuestas inmunes pulmonares y el papel de IL17 en la protección contra la tuberculosis.

La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

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