La medición cuantitativa de los niveles relativos de ácido retinoico en E8.5 embriones y Neurosphere culturas utilizando el ensayo indicador basado en células raras-lacZ F9
6 de septiembre de 2016
No existen métodos para medir con precisión los niveles de ácido retinoico (AR) en pequeñas cantidades de tejido. Este protocolo describe la medición sencilla y cuantitativa de los niveles relativos de AR en embriones E8.5 y neuroesferas utilizando una línea celular reportera de AR.
El objetivo general de este procedimiento es medir cuantitativamente los niveles relativos de ácido retinoico en preparaciones de tejidos, como embriones de ratón E8.5 o cultivos de neuroesferas adultas, utilizando un ensayo celular con sistema de reportero. Aunque la vía de señalización del ácido retinoico está bien caracterizada, la medición histológica directa del ácido retinoico es técnicamente inviable. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo las mutaciones genéticas pueden afectar los niveles de ácido retinoico.
La principal ventaja de esta técnica es que es altamente sensible y versátil, con la capacidad de medir una amplia gama de concentraciones de RA en diversos tipos de muestras de tejido. Aunque este método puede proporcionar una información directa para determinar los niveles de RA en diferentes muestras de tejido, también puede aplicarse a otros estudios, como determinar la presencia o ausencia de enzimas metabólicas de RA mediante el monitoreo de los cambios en los niveles de RA. Antes de comenzar cualquier experimento, pruebe la respuesta de las células F9 RARE-LacZ frente al RA. Añada un nanomolar de RA todo-trans a células F9 RARE-LacZ sembradas en una placa de 96 pocillos.
A continuación, incube la placa y cultive a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, realice la tinción con LacZ y examine las células en busca de un precipitado azul. Si el color no es uniforme en todas las células, proceda a subclonarlas.
Divida los cultivos seleccionados en placas de 10 centímetros a 100.000 células por 10 mililitros. Después de dos días de cultivo, prepare una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de gelatina al 0,2% por pocillo, y deje la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, retire la gelatina y enjuague los pocillos dos veces con 500 microlitros de agua destilada.
Ahora, agregue 500 microlitros de medio de cultivo celular F9 RARE-LacZ a los pocillos. A continuación, seleccione colonias de células F9 utilizando una punta estéril para pipeta P10 y transfiera cada una a un pocillo. Después de tres o cuatro días de cultivo, divida las colonias en dos placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina, una para pruebas y la otra para ampliar el cultivo.
Después de dos días más de cultivo, agregue un nanomolar de RA a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cultive durante la noche. Al día siguiente, realice una tinción de LacZ para probar los respondedores altos y amplíe el cultivo correspondiente. Un día antes de recolectar los embriones E8.5 o disociar los neuroesferas, recubra una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de gelatina al 0,2 % por pocillo y deje la placa en reposo durante 30 minutos.
Luego, aspire el gelatina y enjuague los pocillos dos veces con 200 microlitros de agua destilada. A continuación, tripsinice las células F9 RARE-LacZ seleccionadas mantenidas en placas de 10 centímetros. Luego, siembre 100.000 células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos utilizando medio de cultivo sin G418.
Cargue suficientes pocillos para co-cultivar cada embrión, o prepare tres pocillos por genotipo si trabaja con neuroesferas. Además, prepare 24 pocillos para la curva patrón. Luego, incube la placa durante 24 horas.
Para el cultivo conjunto de células embrionarias, comience la disección de embriones E8.5. A continuación, agregue un nuevo tubo de 1,5 mililitros con 10 microlitros de tripsina y, utilizando una punta de pipeta P20 de orificio ensanchado, transfiera el embrión completo al tubo y coloque el tubo en hielo. Después de que todos los embriones hayan sido aislados, incube todos los tubos a 37 grados Celsius durante cinco minutos para disociar los tejidos.
Después de cinco minutos, triture suavemente el contenido de cada tubo utilizando una punta de pipeta P20 y transfiera 10 microlitros a un pocillo de la placa de 96 pocillos preparada con células F9 RARE-LacZ. Incube la placa durante la noche. Para los cultivos co-cultivos de neuroesferas, comience transfiriendo un cultivo de neuroesferas a tubos de 15 mililitros.
Centrifugar los tubos a 200 g durante 10 minutos y eliminar todo el sobrenadante excepto un mililitro. A continuación, triturar el contenido con una pipeta P1000. Ahora, usar un pequeño volumen para determinar la densidad de las células disociadas.
Luego, siembre 100.000 células de neuroesferas disociadas sobre las células F9 RARE-LacZ. Cargue tres pocillos con cada tipo de cultivo de neuroesferas. Ahora, asegúrese de preparar los pocillos para la curva patrón.
En triplicado, añada 100 microlitros de soluciones de ácido retinoico todo-trans preparadas mediante dilución seriada en siete concentraciones diferentes en medio de cultivo F9 RARE-LacZ. Incluya controles negativos de células no tratadas. Finalmente, incube la placa de 96 pocillos completamente cargada durante la noche.
Al día siguiente, retire el medio y fije las culturas utilizando 100 microlitros de glutaraldehído al 2,5% por pocillo. Deje que la placa incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, retire el fijador y lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de PBS durante 10 minutos por cada lavado.
A continuación, lave los pocillos tres veces con 200 microlitros de solución de lavado LacZ durante 10 minutos por cada lavado. Durante el tercer lavado, prepare la solución de tinción X-gal en un tubo de 15 mililitros envuelto en papel de aluminio. Asimismo, prepare una cámara humidificada para la placa de 96 pocillos.
Ahora, agregue 200 microlitros de la solución de tinción X-gal a cada pocillo. Coloque la placa dentro de la cámara humidificada e incube a 37 grados Celsius. Después de la incubación, retire la solución de tinción LacZ y sustitúyala con 200 microlitros de PBS.
Luego, mida la absorbancia a 610 nanómetros e image la placa. La línea celular F9 RARE-LacZ con reportero está compuesta por células de carcinoma embrionario adherentes que responden cuantitativamente al ácido retinoico con una inducción proporcional de beta-galactosidasa. Además, presentan una morfología epitelial.
A pesar del cultivo con selección de G418, la respuesta de estas células al ácido retinoico (RA) se debilitará tras varias pasajes. Por lo tanto, es necesario realizar subclonaciones periódicas para asegurar células respondedoras fuertes y uniformes al RA. Se espera que embriones E8.5 homocigotos para la mutación vl en Gpr161 muestren una señalización embrionaria de RA disminuida. Mediante este ensayo de cultivo conjunto descrito, que utiliza embriones disociados junto con células F9 RARE-LacZ, se confirmó esta expectativa.
Se utilizó también el cultivo conjunto de neuroesferas derivadas de adultos de tipo silvestre con células F9 RARE-LacZ para detectar RA en cultivos de neuroesferas. La tinción aumentada, en comparación con las células del estadio E8.5, podría deberse a la homogeneidad de los cultivos de neuroesferas. Al generar una curva patrón para los niveles de RA, se pudo cuantificar el nivel de RA en cultivos de neuroesferas de tipo silvestre y en embriones E8.5.
Al realizar este procedimiento, recuerde mantener mediante subclonación periódica células F9 RARE-LacZ que respondan fuertemente al RA. Asimismo, asegúrese de disociar completamente su muestra para facilitar una distribución homogénea y mediciones consistentes de RA. Tras seguir este procedimiento, se pueden investigar los efectos de mutaciones genéticas sobre los niveles de RA, y luego se pueden realizar otros métodos para determinar qué componentes de la vía de señalización de RA se ven directamente afectados.
Descripción general
Este protocolo describe un método para medir cuantitativamente los niveles de ácido retinoico (RA) en embriones de ratón E8.5 y cultivos de neuroesferas utilizando un ensayo de reportero basado en células. La técnica es sensible y versátil, lo que permite evaluar las concentraciones de RA en diversas muestras de tejido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Biología celular
Antecedentes
- El ácido retinoico (RA) desempeña un papel crucial en el desarrollo embrionario.
- La medición directa de los niveles de RA en los tejidos es técnicamente difícil.
- Los ensayos basados en células proporcionan una alternativa viable para evaluar las concentraciones de RA.
- Este método también puede aplicarse para estudiar las enzimas metabólicas del RA.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo confiable para medir los niveles de ácido retinoico (RA) en tejidos embrionarios y neuroesferas.
- Investigar los efectos de mutaciones genéticas sobre la señalización del ácido retinoico (RA).
- Establecer una curva patrón para cuantificar los niveles de ácido retinoico (RA) en diferentes muestras.
Métodos Utilizados
- Uso de células reporteras F9 RARE-LacZ para la detección de ácido retinoico.
- Co-cultivo de embriones disociados de E8.5 o neuroesferas con células reporteras.
- Aplicación de tinción LacZ para visualizar la respuesta al ácido retinoico.
- Medición de absorbancia para cuantificar los niveles de ácido retinoico.
Resultados principales
- El ensayo detectó con éxito los niveles de ATR tanto en embriones E8.5 como en neuroesferas.
- Se observó una tinción más intensa en los cultivos de neuroesferas en comparación con las células E8.5.
- Se establecieron curvas estándar para la cuantificación precisa de ATR.
- Los resultados confirmaron una señalización reducida de ATR en embriones con mutaciones genéticas específicas.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque sensible para medir los niveles de RA en diversos tejidos.
- Puede ayudar a esclarecer el papel del RA en los procesos de desarrollo.
- El ensayo es aplicable para estudiar las vías metabólicas relacionadas con el RA.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición cuantitativa de los niveles de ácido retinoico (RA) apoya la validación de objetivos en biología del desarrollo y neurociencia, al permitir la eliminación de riesgos mecanicistas en las hipótesis sobre la vía del RA. El ensayo reportero F9 RARE-LacZ proporciona confianza predictiva al evaluar los efectos genéticos y farmacológicos sobre la señalización del RA, orientando decisiones tempranas de descubrimiento. Este enfoque facilita la clasificación de carteras al identificar compuestos o modelos genéticos que modulan la biodisponibilidad del RA antes de realizar validaciones posteriores costosas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de niveles de RA en modelos genéticos, como los mutantes Gpr161 vl, para aclarar la actividad de la vía.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco mediante una lectura dosis-responsiva de beta-galactosidasa en una línea celular estandarizada.
- Valor predictivo: Apoya la identificación de compuestos iniciales mediante la medición de la modulación de RA en cultivos de neuroesferas, reflejando respuestas del sistema relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante la absorbancia a 610 nm, permitiendo la construcción de una curva patrón de RA para la comparación entre muestras.
- Valor operativo: Proporciona resultados reproducibles y escalables utilizando un cultivo conjunto en formato de placa de 96 pocillos, adecuado para cribado de throughput medio.
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores al garantizar células F9 RARE-LacZ uniformes y sensibles al RA mediante subclonación periódica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta modelos de neuroesferas embrionarias (E8.5) y adultas para evaluar la señalización de RA a través de diferentes etapas del desarrollo.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Ayuda a determinar la presencia o ausencia de enzimas metabólicas de RA mediante el monitoreo de cambios en los niveles de RA, reduciendo los falsos positivos en la validación de dianas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Orienta las decisiones de avance o interrupción al cuantificar la modulación de RA en sistemas relevantes para la enfermedad antes de realizar inversiones preclínicas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, proporcionando mediciones cuantitativas de AR que respaldan la comprobación de hipótesis y la alineación de biomarcadores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al medir los niveles relativos de RA en embriones disociados y neuroesferas.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos y resultados cuantitativos mediante tinción con LacZ y medición de absorbancia, lo que permite una evaluación confiable de compuestos.
- Analítica: Genera datos aptos para análisis estadístico mediante diluciones triples de RA y curvas estándar, ayudando a los equipos a comparar condiciones entre diferentes genotipos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al evaluar el RA en cultivos de neuroesferas derivadas tanto de embriones como de adultos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para la medición de RA en múltiples proyectos, reduciendo el desarrollo redundante de ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en los estudios de señalización del ácido retinoico (RA).
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la cuantificación de RA entre diferentes tipos de tejidos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas que modulan el RA.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos cuantitativos de niveles de RA.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, disociación de tejidos y técnicas de ensayo con sistemas de reportero.
- Depende de instrumentación para la medición de absorbancia a 610 nm y de infraestructura para incubación.
- Necesita estandarización entre equipos en el manejo de células F9 RARE-LacZ y en los programas de subclonación.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de muestras tisulares, como embriones frente a neuroesferas.
- Está limitado por la necesidad de realizar subclonaciones periódicas para mantener una respuesta uniforme y fuerte al ácido retinoico en las células reporteras.
