Name: Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprende a fabricar microvasos 3D mediante moldeo por inyección para estudiar biología vascular y fisiología endotelial. Esta técnica permite replicar redes vasculares con condiciones personalizables de flujo y composición celular.

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Los autores desean reconocer la Lynn y Mike Garvey Laboratorio de Imagen en el Instituto de Células Madre y Medicina Regenerativa, así como el Fondo de Washington nanofabricación de la Universidad de Washington. También reconocen el apoyo financiero del Instituto Nacional de Salud otorga DP2DK102258 (a YZ), y la formación otorga T32EB001650 (a SSK y MAR) y T32HL007312 (MAR).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Microvasos de ingeniería son un modelo in vitro, donde están presentes y sintonizable características fisiológicas, tales como la geometría luminal, las fuerzas hidrodinámicas, y las interacciones multicelulares. Este tipo de plataforma es de gran alcance, ya que ofrece la posibilidad de modelar y estudiar el comportamiento del endotelio en una variedad de contextos en los que las condiciones de cultivo in vitro en puede ser igualada a la del microambiente en cuestión. Por ejemplo, los mecanismos que i...

La microvasculatura en cada órgano ayuda a definir el microambiente del tejido, mantener la homeostasis del tejido y regulan la inflamación, la permeabilidad, la trombosis, y la fibrinólisis 1,2. Endotelio microvascular, en particular, es la interfaz entre el flujo sanguíneo y el tejido circundante y por lo tanto juega un papel crítico en la modulación de la función del órgano vascular y en respuesta a estímulos tales como las fuerzas hidrodinámicas y citoquinas circulantes y hormonas 3 - 5. La comprensión de las interacciones detalladas entre el endotelio, la sangre y el microambiente tejido circundante es importante para el estudio de la biología vascular y progresión de la enfermedad. Sin embargo, los avances en el estudio de estas interacciones se ha visto obstaculizado por limitada en herramientas in vitro que no recapitulan en la estructura microvascular vivo y la función 6,7. Como resultado, el campo y el avance terapéutico se ha basado en gran medida en costoso y tiempo-el consumo de modelos animales que a menudo no traducir del éxito en seres humanos 8 - 10. Mientras que los modelos in vivo son de gran valor en el estudio de mecanismos de la enfermedad y funciones vasculares, que son complejas y a menudo carecen de un control preciso del individuo celular, bioquímica, y las señales biofísicas. Vasculatura en todo el cuerpo posee una estructura jerárquica madura en conjunción con lechos capilares expansivas, proporcionando la perfusión optimizado y el transporte de nutrientes al mismo tiempo 11. Inicialmente, las formas vasculatura como un plexo primitiva que reorganiza a una red jerárquica ramificada durante el desarrollo temprano 12,13. Aunque muchas de las señales implicadas en estos procesos se conocen bien 14 - 16, sigue siendo difícil de alcanzar, tales cómo el patrón vascular se determina 15. A su vez, la recapitulación de este proceso in vitro para diseñar redes vasculares organizados tiene abejan. Muchas plataformas difíciles existentes in vitro para modelar la vasculatura, por ejemplo, dos cultivos de células endoteliales dimensionales, carecen de características importantes tales como la proximidad multi-celular, tres geometría luminal dimensional, flujo, y de la matriz extracelular. Los ensayos de formación de tubos en 3D (hidrogeles de colágeno o fibrina) 17 - 19 o invasión ensayos de 20,21 se han utilizado para estudiar la función endotelial en 3D y sus interacciones con otras vasculares 17,22 celulares o tejidos tipos 23. Sin embargo, ensamblados lúmenes en estos ensayos carecen de interconectividad, el flujo hemodinámico, y la perfusión adecuada. Además, la propensión a la regresión vascular en estos ensayos de formación de tubo 24 impide que la cultura a largo plazo y la maduración que limita el grado de estudios funcionales que se pueden realizar. Por lo tanto, hay una necesidad creciente para diseñar plataformas in vitro de redes microvasculares que pueden modelar adecuadamente ESendotelial características y son capaces de cultivo a largo plazo. Una variedad de técnicas de ingeniería vasculares han surgido en los últimos años para aplicaciones médicas para reemplazar o vasos de derivación afectada en pacientes con enfermedad vascular. Vasos de gran diámetro fabricados con materiales sintéticos tales como tereftalato de polietileno (PET), y politetrafluoroetileno (PTFE) han tenido un considerable éxito terapéutico con la permeabilidad a largo plazo (promedio 95% la permeabilidad de más de 5 años) 25. Aunque de pequeño diámetro injertos sintéticos (&lt;6 mm) por lo general se enfrentan a complicaciones tales como hiperplasia de la íntima y trombopoyesis 26 - 28, ingeniería tisular injertos de pequeño diámetro hechos con material biológico han hecho progresos significativos 29,30. A pesar de los avances de este tipo, los vasos de ingeniería en la microescala han seguido siendo un reto. Para modelar adecuadamente la microvasculatura, es necesario para generar patrones de red complejas con sufciente resistencia mecánica para mantener la permeabilidad y con una composición de matriz que permite tanto la permeación de nutrientes para las células del parénquima y remodelación celular. Este protocolo presenta una novedosa red de vasos artificiales perfusable que imita un nativo in vivo con un ajuste ajustable y controlable microambiente el 31 de - de 34. El método descrito genera microvasos Diseñado con diámetros del orden de 100 micras. microvasos ingeniería se fabrican mediante la perfusión de las células endoteliales a través de un canal de microfluidos que está incrustado dentro del tipo I colágeno suave hidrogel. Este sistema tiene la capacidad de generar redes modelados con estructura luminal abierta, replicar las interacciones multicelulares, modular la composición de la matriz extracelular, y aplicar fuerzas hemodinámicas fisiológicamente relevantes.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Fabricación de obleas</fuerte>Sistema de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>plasma AutoGlow</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Headway Research, Inc&nbsp;</td><td>PWM32 Recubrimiento giratorio &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alineador de contacto ABM</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Step Profilómetro</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Desarrollador</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Resist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio de 8"</td><td>Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generador de micropatrones de sobremesa</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&mu; PG 101</td><td>Para la generación de fotomascarillas</td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol ispropílico</td><td>Avantor Performance Materiales</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (120 x 120 mm, cuadradas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>Tricloro(3,3-trifluoropropil)silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>Base de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Mixto a 10:1 (p/p)</td></tr><tr><td>Desecador al vacío</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td>Fabricación y cultivo de dispositivos</poli</td>(metacrilato >de metilo) (PMMA)Tratador de <td></td><td></td><td>plexiglás</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Corona</td><td>Productos Electrotécnicos, Inc.</td><td>BD-20</td><td>Dispositivo portátil para el tratamiento con plasma de dispositivos PMMA y moldes PDMS</td></tr><tr><td>Soldador Weller</td><td>&nbsp;</td>Tornillo de máquina ranurado con cabeza de celosía <td>de acero inoxidable WTCPS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>Pasadores de acero inoxidable</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>Se pueden utilizar pinzas similares</td></tr><tr><td>Espátula (Micro Cuchara)</td><td>Servicios de Microscopía Electrónica</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>Destornillador</td><td></td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier destornillador de cabeza plana, esterilizado en autoclave</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>4460030966</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (150 x 25 mm)</td><td>Placas de</td> Petri <td>de 430599</td><td></td>Corning</tr><tr><td>(100 x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>Algodón, cortado en trozos</td><td></td><td></td> de 1 cm x 3 cm <td></td></tr><tr><td>Polietilemina (PEI)</td> esterilizado en autoclave <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Diluido al 1% en agua de grado de cultivo celular</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Diluido al 0,1% en agua</td></tr> <tr><td>de grado de cultivo celularColágeno estéril H2O</td><td></td><td></td><td>DI H2O</td></tr><tr><td>tipo I, disuelto en ácido</td><td></td><td></td> acético al 0,1% <td>Aislado de colas de rata como se describe en Rajan et. al. 2006 (ref #37)</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 30 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10x Media&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (estéril)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Diluido a 1 N en agua de grado de cultivo celular</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medios de crecimiento endotelial</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp. (70&nbsp; kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de carga de gel</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de relleno roma de 18 g</td><td>BD&nbsp;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 g Aguja dosificadora de acero inoxidable</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32" ID, Tubo de silicona de 3/32" de diámetro exterior</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>Acoplamiento de tubo a tubo de 1/16"</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&deg; Conectores de codo, tubo a tubo</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>Acoplamiento Luer Lock (hembra, 1/16" ID)</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de plástico, con mordazas Servicios de</td><td>microscopía electrónica</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa doble</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Poliestireno Tubo de fondo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>Device Analysis</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-hCD31</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>1:25 dilución de trabajo</td></tr><tr><td>FITC anticuerpo conjugado anti-von Willebrand Factor</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>dilución de trabajo 1:100</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-conejo de cabra 568</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilución de trabajo 1:100</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Resuspendido en DMSO</td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Para fabricar un tampón de cacodilato de 0,2 M</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa Dextrano conjugado por FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><reactivos de cultivo fuertes> adicionales&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>Inhibidor de GSK-3 de molécula pequeña</td></tr><tr><td>VEGF recombinante humano</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>bFGF recombinante humano</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterning y montaje de microvasos 3d

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels 

En plataformas in vitro para estudiar las células endoteliales y la biología vascular se limitan en gran medida a la cultura de células endoteliales 2D, el flujo cámaras con polímero o sustratos a base de vidrio, y ensayos de formación de tubo a base de hidrogel. Estos ensayos, mientras informativa, no se recapitulan la geometría del lumen, la matriz extracelular adecuada, y la proximidad multicelular, que juegan un papel clave en la modulación de la función vascular. Este manuscrito describe un método de moldeo por inyección para generar vasos diseñado con diámetros del orden de 100 micras. Los microvasos se fabrican mediante la siembra de células endoteliales en un canal microfluídico incrustado dentro de un tipo nativo I colágeno hidrogel. Mediante la incorporación de las células del parénquima dentro de la matriz de colágeno antes de la formación de canal, microambientes específicos de tejido pueden ser modeladas y estudiadas. modulaciones adicionales de propiedades y medios hidrodinámico composición permiten el control de la función vascular compleja dentro del microambiente deseada.Esta plataforma permite el estudio de la contratación perivascular de células, las interacciones sangre-endotelio, respuesta de flujo, y las interacciones de tejido microvascular. microvasos ingeniería ofrecen la posibilidad de aislar la influencia de los componentes individuales de un nicho vascular y precisamente controlan sus químicos, biológicos, mecánicos y propiedades para estudiar la biología vascular tanto en la salud y la enfermedad.

La plataforma recipiente ingeniería crea microvasculatura funcional incrustado dentro de un tipo natural de colágeno I de la matriz y permite el control ajustado del medio ambiente celular, biofísicas y bioquímicas in vitro. Para fabricar los microvasos de ingeniería, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) se sometieron a perfusión a través de la red de microfluidos colágeno embebido en donde se unen para formar un lumen de patentes y el endotelio confluen...

Este manuscrito presenta un método de moldeo por inyección para diseñar microvasos que recapitular las propiedades fisiológicas de endotelio. El proceso basado en microfluidos crea redes vasculares 3D patente con condiciones tailorable, tales como gradientes bioquímicos de flujo, composición celular, la geometría, y. Se describe el proceso de fabricación y los ejemplos de posibles aplicaciones.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

El objetivo general del uso de microvasos modificados es replicar la estructura y función de los vasos en el cuerpo para estudiar la fisiología vascular en estados normales y patológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular, como la forma en que diferentes células anatómicas responden al flujo, cómo influyen en la función tisular y cómo se inician y progresan las enfermedades vasculares con el tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que puede modificarse fácilmente para imitar diferentes sistemas orgánicos y estados patológicos.Esto puede realizarse modificando los tipos celulares, la composición de la matriz y del medio, y otras variables. Por lo general, las personas nuevas en este método podrían tener dificultades antes de tomar conciencia de los errores comunes que pueden llevar a una mala calidad de los vasos. La demostración visual de este método es fundamental porque existen varios trucos para una fabricación exitosa durante los pasos de moldeo por inyección y ensamblaje.Para este procedimiento, prepare previamente los moldes de PDMS planos y microestructurados, así como las piezas de alojamiento de PMMA. En el protocolo por escrito se proporciona una descripción de cómo fabricar estas piezas. Someta a autoclave los moldes de PDMS junto con los tornillos, pasadores, pinzas y una espátula.No autoclave las piezas de PMMA. Deben esterilizarse con lejía bajo una campana. Después de dejar las piezas de PMMA en remojo en lejía durante al menos una hora, enjuague la lejía con agua autoclavada dos veces.Luego, coloque los fragmentos en placas estériles. Aspire el exceso de agua y deje que sequen al aire. Con todo limpio, inicie el protocolo tratando los pozos internos de ambas piezas de PMMA, superior e inferior, utilizando un tratador de plasma manual durante aproximadamente un minuto.Apague la luz para ayudar a visualizar la cobertura del tratamiento con plasma. A continuación, agregue PEI al 1 % a los pozos internos. Si el PEI no se extiende fácilmente, aumente el tiempo de tratamiento con plasma.Después de dejar que el PEI reaccione durante 10 minutos, elimine la solución y luego enjuague los dispositivos con agua estéril y deje que sequen al aire. Una vez secos, aplique glutaraldehído al 0,1 % sobre las superficies tratadas y permita que el glutaraldehído reaccione durante media hora. A continuación, enjuague las piezas dos veces con agua estéril y deje que sequen al aire.Ahora, prepare colágeno neutralizado fresco al 0,75 % para la fabricación de vasos combinando el volumen de colágeno en stock previamente asignado con la solución de neutralización de medio e hidróxido de sodio. Agite lentamente y con cuidado con una espátula hasta que la solución sea homogénea y tenga color naranja. Luego, si es necesario, agregue las células a la concentración deseada y continúe agitando la solución hasta que las células se distribuyan uniformemente.Como preparación para el proceso de ensamblaje, coloque el molde de PDMS con micropatrones en un recipiente de 100 por 20 milímetros y trate el molde con plasma durante un minuto. A continuación, alinee la pieza superior de PMMA sobre el PDMS de manera que los reservorios cuadrados coincidan con los reservorios de entrada y salida. Luego, inserte pasadores de acero inoxidable en los orificios de los reservorios de entrada y salida para que permanezcan abiertos después de la inyección de colágeno.Ahora, cargue la mezcla de colágeno y células en una jeringa de un mililitro sin introducir burbujas de aire. Luego, utilizando pinzas, presione suavemente la pieza superior de PMMA para fijarla al molde de PDMS e inyecte lentamente aproximadamente medio mililitro de la mezcla de colágeno y células en el puerto de inyección. El colágeno debe llenar el área de 20 por 20 milímetros sobre el patrón y no debe salirse.A continuación, cierre cuidadosamente el recipiente sin mover los pasadores de fijación. Después, coloque en la pieza inferior de PMMA una cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros cuadrados dentro del pocillo interno. Luego, distribuya aproximadamente 0,25 mililitros de colágeno uniformemente sobre el vidrio.Complete la mitad inferior bajando suavemente el PDMS plano dentro del colágeno, de modo que quede plano contra el PMMA sin burbujas de aire entre ambos. Ahora, coloque cuidadosamente ambas mitades del dispositivo en una incubadora a 37 grados Celsius y deje que la solución de colágeno forme gel durante 30 minutos antes de continuar. Después de la gelación, agregue suficiente PBS para rodear el PDMS en la pieza inferior.Luego, use pinzas para eliminar cualquier exceso de colágeno alrededor de los bordes y desprenda lentamente la pieza plana de PDMS mientras mantiene el colágeno hidratado con PBS. Para preparar la pieza superior, use pinzas para levantar el ensamblaje de PMMA y PDMS y voltéelo. A continuación, agregue unas gotas de PBS sobre la cara interna y retire el molde de PDMS de la pieza superior de PMMA, despegándolo con rapidez y firmeza.A continuación, con un segundo par de pinzas, retire suavemente los pasadores del otro lado del alojamiento de PMMA. Asegúrese de que la entrada y la salida estén libres de exceso de colágeno moviendo los pasadores hacia arriba y hacia abajo antes de retirarlos. Si los pasadores se caen por sí solos, simplemente use otro pasador estéril para garantizar que la entrada y la salida estén despejadas.Luego, agregue más PBS sobre el colágeno con microestructura, dé la vuelta al fragmento e inserte los tornillos en los orificios de las cuatro esquinas. Ahora, coloque suavemente la pieza superior sobre la inferior, alineando los tornillos con sus orificios. No permita que las dos piezas se deslicen una contra la otra.Luego, enrosque suavemente las piezas utilizando una espátula y un toque ligero para que no queden demasiado apretadas. Es fundamental ser cuidadoso y preciso durante el ensamblaje. Al aplicar una cantidad generosa de PBS, se reduce la fricción entre las superficies internas.Mientras se ajustan los tornillos, proceda lentamente y deténgase tan pronto como se encuentre alguna resistencia. A continuación, aspire el PBS que rodea las superficies de PMMA y coloque un pequeño trozo de algodón debajo de un borde del dispositivo. Luego, aspire cualquier PBS de los depósitos.Ahora, rellene los depósitos con medio de cultivo celular e incube el dispositivo durante al menos una hora para la gelificación. Una vez que el dispositivo esté ensamblado, utilice una suspensión de células endoteliales a 10 millones de células por mililitro para sembrar el dispositivo. Retire el medio de los depósitos de entrada y salida y, con una pipeta de 20 microlitros equipada con puntas para carga de geles, agregue 10 microlitros de la suspensión celular en el centro del depósito de entrada.Las células fluirán inmediatamente hacia la red y la recubrirán. Una vez que las células hayan llenado la red y el flujo se haya equilibrado, agregue 150 microlitros de medio en ambos reservorios. Luego, incube el dispositivo durante una hora o más para que las células puedan extenderse y adherirse.Para cultivos a largo plazo, retire el medio cada 12 horas y agregue nuevamente 150 microlitros de medio fresco al depósito de entrada y 50 microlitros al depósito de salida. Después de 24 horas de cultivo, se puede utilizar una bomba de jeringa para establecer condiciones de flujo continuo. Después de llevar los materiales a la cabina de flujo laminar, retire los tubos de las bolsas de autoclave y colóquelos en un recipiente.Luego, prepare un recipiente estéril de flujo derritiendo los orificios laterales y pasando a continuación el tubo a través de ellos. Prepare una jeringa de 10 mililitros con medio de cultivo que contenga Dextrano al 3,5%. A continuación, conecte la jeringa llena al bloqueo de cebo en el extremo del tubo de entrada.A continuación, fije la jeringa a la bomba y pase medio hasta que todas las burbujas de aire atrapadas hayan salido del tubo. Una vez que el tubo esté lleno de medio y no presente burbujas, transfiera el dispositivo a un nuevo recipiente e inserte la unión del conector de entrada en la entrada del alojamiento. Luego, ajuste la bomba de jeringa al caudal deseado e inicie la perfusión.Prepare la salida llenando el tubo con medio de cultivo celular utilizando una aguja de calibre 18 y una jeringa de un mililitro. Átela y retire la aguja. A continuación, derrita un orificio en la tapa del tubo colector de salida usando un soldador.A continuación, agregue medio al tubo de recolección, inserte el tubo y coloque la junta de conexión en la salida del alojamiento. Durante todo este proceso, se utiliza una pinza para retener el medio en el tubo. Una vez finalizado, transfiera todo el montaje a una incubadora.Dependiendo de las condiciones experimentales, puede ser necesario recargar la jeringa después de 24 a 36 horas. Durante el reemplazo de la jeringa, asegúrese de que no se introduzcan burbujas en el tubo. Se perfundieron células endoteliales de vena umbilical humana a través de la red microfluídica embebida en colágeno para formar una luz permeable y un endotelio confluyente.Se utilizaron varias geometrías de vasos para establecer diferentes condiciones de flujo. Se emplearon condiciones de cultivo con flujo continuo para aplicar un estrés cortante constante sobre el endotelio. Los dispositivos cultivados bajo condiciones de flujo impulsado por gravedad también mantuvieron viabilidad y permeabilidad a largo plazo.Una característica fundamental de estos microvasos es su capacidad de responder a estímulos inflamatorios. Esto se investigó perfundiendo los microvasos con sangre completa. Los microvasos no estimulados contenían endotelio no activado y permanecieron en estado de quiescencia.Los microvasos estimulados se activaron y su respuesta inició la formación de trombos. Otra aplicación interesante del sistema es estudiar los cambios fenotípicos en la vasculatura formada a partir de diferentes poblaciones de células endoteliales. Por ejemplo, los microvasos formados a partir de poblaciones únicas de células madre exhibieron diferentes capacidades de brotamiento angiogénico.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar microvasos y utilizarlos para estudiar la biología vascular y construir sistemas de órganos modelo complejos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la práctica mejorará la tasa de formación exitosa de vasos y permitirá obtener resultados más consistentes. Una vez dominado, se pueden fabricar varios dispositivos en tres o cuatro horas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la perfusión de sangre completa, con Dextran o tratamientos farmacéuticos para evaluar la quiescencia endotelial, la permeabilidad, la respuesta a fármacos y la morfología general de las células y los vasos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un protocolo para la fabricación de dispositivos de microfluidos que puede permitir la captura de células y la cultura. En este enfoque micro modelado como ranuras dentro de los canales de microfluidos se utilizan para crear las regiones de baja tensión de corte dentro de la celda que se puede acoplar.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

Se presentan dos procesos de microfabricación de chips de polímero poroso para el cultivo de células en tres dimensiones. El primero es el estampado en caliente combinado con un proceso de soldadura vapores de disolventes. El segundo utiliza un proceso desarrollado recientemente microthermoforming combinada con la tecnología de iones de la pista que conduce a una simplificación significativa de la fabricación.

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

La vaporización de un proceso de componentes de sacrificio (VASc) se utiliza para fabricar estructuras microvasculares. Este procedimiento utiliza fibras de ácido poli (láctico sacrificio) para formar micro-canales huecos con la posición geométrica en 3D precisa proporcionada por láser de placas de guía micromecanizadas.

Proceso de fabricación microestructuras tridimensionales mediante vaporización de un componente de sacrificio

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Aquí, demostramos un método de producción simple para microgotas de agua en aceite (W/O) monodispersas de tamaño controlable utilizando un dispositivo microfluídico centrífugo de base capilar. Este método requiere solo un pequeño volumen de muestra y permite una producción de alto rendimiento. Esperamos que este método sea útil para análisis bioquímicos y celulares rápidos.

Dispositivo de microfluidos centrífuga basada en capilar para la Formación Tamaño-controlable de monodisperso microgotas

Este protocolo describe la implementación de la degradación de hidrogel basada en láser guiada por imágenes para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incrustadas en hidrogeles de diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA). Estos sistemas microfluídicos biomiméticos pueden ser útiles para aplicaciones de ingeniería de tejidos, generación de modelos de enfermedades in vitro y fabricación de dispositivos avanzados "en un chip".

Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular

Este informe describe una técnica simple y fácil de realizar, utilizando vacío a baja presión, para llenar canales microfluídicos con células y sustratos para la investigación biológica.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.

Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Presentamos una tecnología que utiliza el ensamblaje asistido por capilaridad en una plataforma microfluídica para modelar objetos de tamaño micro suspendidos en un líquido, como bacterias y coloides, en matrices prescritas en un sustrato de polidimetilsiloxano.

Modelado de microorganismos y micropartículas a través del ensamblaje secuencial asistido por capilaridad

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional

Aprende a fabricar microvasos 3D mediante moldeo por inyección para estudiar biología vascular y fisiología endotelial. Esta técnica permite replicar redes vasculares con condiciones personalizables de flujo y composición celular.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

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