Name: Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a generar andamios cardíacos a partir de tejido neonatal de ratón para estudios regenerativos. Este método permite investigar las interacciones célula-matriz y las propiedades únicas de la matriz extracelular neonatal.

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Los autores agradecen a la Sra. Cynthia DeKay por la preparación de las figuras.

Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Minnesota. 1. Método para el ratón El aislamiento del corazón <ol><li> La eutanasia a un ratón neonatal por decapitación con una sola pala uso. </li><li> Hisopo el tórax con 70% de etanol. </li><li> Diseccionar la piel del pecho por el corte lejos de la pared del pecho con unas tijeras estándar, mientras que tirando de la piel lateralmente con un par de fórceps # 5. </li><li> Perforar el abdomen justo por debajo del esternón con las tijeras de corte a través de la pared abdominal. Agarrando el proceso xifoides con # 5 pinzas, retraer el esternón rostral del cuerpo durante el corte, aunque los nervios de cada lado del pecho con las tijeras. La caja torácica se refleja superiormente con las pinzas para revelar el corazón. </li><li> Sin rodeos diseccionar los dos lóbulos principales del timo tirando lateralmente con # 5 pinzas, exponiendoel arco de la aorta, así como las venas cavas y pulmonares. </li><li> Seccionar las arterias principales de la arco aórtico, y la propia aorta, con las tijeras de primavera 10 cm. Conservar la aorta entre la base del corazón y la arteria braquiocefálica. Agarre los extremos de los vasos cortados con el # 5 fórceps para reflejar el corazón hacia delante, separándola de la tráquea y el esófago. </li><li> Seccionar la vasculatura pulmonar y otras venas principales, mediante el corte entre los pulmones y el corazón en ambos lados del corazón con las tijeras de primavera 10 cm. Las venas permanecen abiertos para proporcionar un drenaje. </li><li> Retire el corazón del mediastino con el # 5 pinzas, agarrando los extremos cortados de los grandes vasos. Coloque el corazón en una placa de cultivo de 60 mm que contiene solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para la cateterización. </li></ol> 2. Método para la descelularización por perfusión de Langendorff <ol><li> Preparar el conjunto de catéter con antelación. Dibuje una sección de 4 cmde PE 50 tubos en una pequeña llama de alcohol para crear un catéter más pequeño, más delgado. Recorte los extremos con una cuchilla para cumplir con las dimensiones (aprox. 300 m OD diámetro exterior con una brida de aprox. OD 500 micras) que se muestra en la Figura 1. Esto proporcionará dos catéteres simétricas a cada lado de la lengüeta de arrastre. </li><li> Apunte el extremo cortado de la tubería en la llama brevemente, para fundir una brida en la abertura en el extremo delgado. </li><li> Llene la jeringa 12 ml con PBS y montar el catéter mediante la colocación de una llave de paso de 3 vías en la jeringa. Añadir un 22 G x 1 aguja a la llave de paso y empujar la aguja a través del septum. Deslizar el catéter tubo de PE dibujado en la aguja (Fig. 1). </li><li> El riego de las piezas ensambladas con PBS, asegurando que todas las burbujas de aire se han eliminado. </li><li> Insertar el catéter, preparado como se describe anteriormente, en la aorta del corazón aislado, que no se extiende más allá de la válvula aórtica y se liga con un lazo de sutura 7-0. Descansar la brida de tél catéter proximalmente contra el lazo, haciendo un sellado hermético y evitando que el corazón se salga del catéter. </li><li> Observe el cateterismo con una lupa, mientras que la perfusión suavemente el corazón usando la jeringa que contiene PBS. Asegúrese de que no hay fugas en el sistema y el tejido blanches homogéneamente como se extrae la sangre latente. </li><li> Coloque el septum en el cuello del adaptador de entrada y sellarlo por plegado de los lados sobre el cristal. </li><li> Una el depósito lleno con 60 ml de 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS) en agua destilada (dH 2 O) a través de una línea de longitud suficiente para producir una columna que genera 20 mm Hg de presión como se muestra en la Fig. 1. Calcular la presión de la altura de la columna de líquido basado en la relación de 1 mm Hg es igual a 1,3595 cm H 2 O. Precaución: El SDS es un polvo altamente floculante con propiedades irritantes. Contacto debe ser evitado. Manejar el polvo usando la ropa protectora adecuada. </li><li> Perfundir el corazón con SDS al 1% durante 14 horas. El corazón será transparente en apariencia sin tejido restante observable. </li><li> Enjuague el sistema hasta la llave de paso de la solución de SDS restante y reemplazarlo con 10 ml de dH2O Perfundir el corazón con 10 ml 1% de Triton X-100 (diluido en agua destilada), seguido de 10 ml dH 2 O, seguido de 60 ml de PBS que contenía penicilina estreptomicina 1x (Pen-Strep). </li><li> Almacenar el corazón en PBS con 1 Pen-Strep a 4 ° C. Si la aplicación de post descelularización destinado requiere perfusión entonces el catéter en la aorta se debe mantener, de lo contrario cortar el lazo de sutura y retirar el catéter. </li></ol> Determinación 3. ADN <ol><li> Preparar un resumen del corazón ECM o control descelularizada utilizando 200 mg / ml de proteinasa K en KCl 50 mM, MgCl 2,5 mM 2, 0,45% de Tween 20 en Tris 10 mM (pH 8,3). </li><li> Incubar el tejido en 55 ° C con agitación hasta que se disuelve el tejido,típicamente 4-5 horas. </li><li> Cuantificar el contenido de ADN del homogeneizado con un ensayo de unión al ADN 4,11. </li></ol> 4. La fijación y seccionamiento de Tejido <ol><li> Fijar descelularizado corazones, recelularizado o P3 de control en 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar el tejido en PBS 3x. </li><li> Coloque el tejido en una solución de 7,5% de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M a 4 ° C hasta que se hunde. </li><li> Cambie la solución a 15% de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M a 4 ° C, de nuevo, hasta que se hunde. </li><li> Calentar el tejido a 37 ° C, sustituir la mitad del volumen con una solución de gelatina en 15% de sacarosa y tampón fosfato 0,1 M y equilibrar durante la noche. Las concentraciones de gelatina se incrementan por etapas a través de 1%, 2,5%, 5% y finalmente 7,5% dos veces. </li><li> Colocar las muestras en criomoldes utilizando fresca 7,5% de gelatina. Para restaurar la forma de las muestras descelularizados, gelatina líquida se puede perfundió en las cámaras como tél corazones se moldean. Congelar flotando los criomoldes en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Cut (10 m de espesor) secciones con un criostato. Llevar la corredera cerca de la superficie de la sección y observe la sección de moverse fuera de la cuchilla sobre la superficie debido a la carga de los portaobjetos tratados electrostáticamente. Se secan los portaobjetos durante la noche y almacenar a -80 ° C para su posterior análisis. </li><li> Retire los portaobjetos del congelador, se equilibre a temperatura ambiente y luego se coloca en un frasco Coplin con PBS durante 20 minutos a 37 ° C para disolver la gelatina. </li><li> Manchar las secciones de corte desde el paso 4.7 con hematoxilina y eosina. Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin. Exponer las diapositivas hidratados en el paso 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, el agua del grifo durante 1,5 min, tampón durante 3 minutos, el agua del grifo durante 1 minuto, agente de azulado durante 1,5 minutos, etanol al 80% durante 1 min, alcohólica eosina Y durante 8 s, 80% de etanol durante 1 min, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de eliminación (sustituto xileno) durante 1 min 3x, cubreobjetos con resinaMedio de montaje basado. Examinar los portaobjetos al microscopio. </li><li> Para confirmar la retención de proteínas ECM reactividad de la ECM corazón, mancha para las proteínas estructurales de ECM tales como colágeno IV mediante la colocación de las diapositivas hidratados en una cámara humidificada y se trata con 10% de suero normal de burro (NDS) en solución salina tamponada con fosfato con 0,1% Triton -X100 (PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Utilizar un volumen suficiente para cubrir las secciones de tejido. </li><li> Reemplazar la solución con el anticuerpo primario de elección a una dilución determinada empíricamente en 5% NDS / PBST. Por ejemplo, el anticuerpo de colágeno IV se diluyó en 1: 150. Incubar toda la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBST 3 veces y aplicar un anticuerpo secundario de elección conjugado con un colorante fluorescente. Diluir el anticuerpo en una cantidad determinada empíricamente. Incubar durante 1 hora a RT. Lavar 3x con PBS. </li><li> Tinción de los portaobjetos con un tinte de unión al ADN tales como DAPI para verificar la ausencia de núcleos de células mediante el uso de un mounti DAPI que contieneng medio cuando la cubierta se deslice las diapositivas. </li><li> Examinar los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia de 50 a 400X. </li></ol> 5. P1 neonatal murino ventricular cardiomiocitos para recelularización <ol><li> Rociar cada cachorro con un 70% de etanol y decapitar con una sola pala uso. </li><li> Mantenga cada cachorro entre el pulgar y el índice, mientras que el tórax se divide en la línea media con pequeñas tijeras estériles para exponer la cavidad torácica. Aplicar presión para permitir que el corazón sobresalga libremente desde el pecho mientras se corta libre de los grandes vasos y las aurículas dejando sólo el tejido ventricular. </li><li> Coloque cada corazón directamente en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml de calcio enfriado en hielo, solución salina tamponada de bicarbonato libre de Hank con mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico 20 (CBFHH) hasta que se recogen todos los corazones. </li><li> Aspirar el CBFHH y añadir 10 a 15 ml de CBFHH fresco (enfriado con hielo) en el tubo. Lavar el tejido haciendo girar el tejido en tél tubo varias veces. </li><li> Decantar la solución que contiene el corazón en una placa de Petri de plástico 60 mm. </li><li> Diseccionar cualquier tejido auricular latente de los corazones con una lupa en el hielo por el recorte alejado de los corazones con las tijeras de primavera. Picar los ventrículos en trozos pequeños de tamaño homogénea. Eliminar cualquier tejido no ventricular separado del plato con # 5 pinzas. </li><li> Pipet tanto de la solución de CBFHH como se necesita para la transferencia de los fragmentos de tejido en un pequeño vial estéril que contiene una barra de agitación micro estéril. </li><li> Permitir que el tejido de sedimento al fondo del vial y eliminar la solución de CBFHH. </li><li> Completar hasta 50 ml de una solución de enzima 1,75 mg / ml de tripsina, 20 mg / ml de ADNasa II en CBFHH. Pipeta de 5 ml de esta solución de enzima y añadirlo a un tubo que contiene tejido ventricular picada y el lugar en un agitador magnético. Se agita a una velocidad constante (340 rpm) a temperatura ambiente durante 8 min. NOTA: La acción de agitación debe ser suave y sin embargo permitirpara la suspensión de la suspensión. </li><li> Retire el vial de la placa de agitación y permitir la suspensión para sedimentar durante 3 min. Pipetear y desechar el sobrenadante inicial de digerir, ya que contiene principalmente células de sangre y restos de tejido. </li><li> Pipetear una segunda alícuota de 5 ml de la solución de enzima y añadirlo al ventrículo digestión. Se agita durante 8 minutos y dejar que se sedimente durante otras 3 min. Antes de comenzar las digestiones, preparar dos tubos de 50 ml (marcado 1 y 2) que contienen cada uno 12 ml de suero bovino fetal de hielo frío (FBS). Coloque un filtro de células de 40 micras encima de cada tubo. Pipeta de este sobrenadante a través del filtro en el tubo 1. </li><li> Repetir el proceso de digestión adicionales 8 veces, alternando la colocación del sobrenadante digest entre los dos tubos que contienen FBS. Dividir el último sobrenadante por igual entre los tubos 1 y 2 para asegurar volúmenes iguales en cada tubo. NOTA: Cada tubo de recogida contendrá ahora 32,5 ml de volumen total de suspensión de células. </li><li> Centrifugar los tubos contienening el gx 150 sobrenadante durante 6 min a 4 ° C. </li><li> Durante la percepción de las alícuotas de digestión, se preparan cinco placas de cultivo de 100 mm de tejido con 6 ml de medio de Dulbecco (Modificado de Eagle Media (DMEM) con 10% de SFB, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alícuotas a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min para equilibrar los medios de comunicación. </li><li> Aspirar la mezcla de enzimas CBFHH y resuspender las células en el 30 ml de medio de cultivo preparado anteriormente, la combinación de las células de ambos tubos de recogida. </li><li> Retorno 6 ml de suspensión celular a cada uno de las placas de 100 mm y se incuba durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Al final de la incubación, transferir las células no adherentes a 5 nuevos platos y volver a incubar durante 45 min (la fracción de fibroblastos habrá comenzado a adherirse a los platos y se puede cultivar por separado si se desea). </li><li> Al final de la segunda ronda de pre-recubrimiento, recoger los medios de comunicación y las células no adherentes de los platos y hacer girar los medios de comunicación en 150g durante 6 min. </li><li> Dibuje el exceso de medios de comunicación para llevar las células a la concentración aproximada deseada, (4,0 x 10 5 células por constructo en 100 l de líquido de perfusión). Retirar una alícuota para el recuento y la viabilidad o la prueba 14. </li></ol> 6. Bioreactor recelularización de P3 Matrix corazón <ol><li> Tratar previamente la matriz de corazón aislado con medios de cultivo (véase el paso 5.15) durante la noche antes de añadir las células. </li><li> Montar los elementos de un sistema Langendorff como se muestra en la Fig. 2. Autoclave las piezas de vidrio y óxido de etileno esterilizar las piezas de plástico para asegurar la esterilidad. Varias unidades secundarias del sistema se pueden montar en una campana de flujo laminar antes de ser montado en el soporte de apoyo. Baño de agua circulante y la trayectoria del flujo de agua caliente se ha omitido para mayor claridad. </li><li> Llenar el sistema ensamblado con 120 ml de medio de cultivo tisular (véase el paso 5.15). </li><li> Coloque la matriz corazón sondaje de la Etapa 2,14 en un 60 mm culplato tura bajo ampliación y conectar una jeringa de 1 ml con 22 G x 1 de la aguja cargada con suspensión de células de la Etapa 5,20 al catéter. Asegúrese de que este montaje es libre de burbujas de aire para evitar la embolización del corazón. </li><li> perfundir suavemente los 100 l de suspensión de células en la matriz de corazón a través de las arterias coronarias. Una vez completado, desconecte la combinación jeringa / aguja. NOTA: Una perfusión lenta de aprox. Se requiere 20 l por min para evitar que las células de las que fluye hacia fuera de las venas, que transitan por el corazón. </li><li> Con un trozo romo 22g asegurado a la conexión Luer en la parte inferior de la tapa del frasco corazón biorreactor, empujar el catéter sobre el trozo. </li><li> Arrancar la bomba peristáltica y observar que el flujo como se indica en la Figura 2. El flujo avanza desde el depósito a través de la bomba a través de la trampa de burbujas al catéter colocado en la aorta en el paso 2.5 (camino rojo en la Fig. 2). Observar el flujo de la circulación cardiaca de la venas y gotear desde el ápice, de recirculación al depósito de los medios de comunicación. NOTA: La velocidad de flujo de perfusión depende de factores individuales, tales como la resistencia vascular de la construcción, y el tamaño del corazón, pero una tasa de 50 a 100 l / min es un buen punto de partida. En los puntos de tiempo intermedios, evaluaciones funcionales se pueden ejecutar. La escala de tamaño del corazón recelularizado neonatal limita las evaluaciones, que se pueden realizar, pero hemos determinado que los sistemas basados ópticamente se pueden utilizar para cuantificar superando el comportamiento de la misma manera que se han utilizado en corazones de ratas adultas. 4 El constructo puede ser perfundido para Extended períodos de tiempo (hasta 23 horas). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La dependencia de esta técnica en repetidas perfusiones del corazón hace que la evitación de una embolia un componente crítico de un resultado exitoso. Desde el cateterismo inicial del corazón en los pasos 2,2-2,6, a los cambios de solución entre pasos 2.8-2.14, existen manipulaciones que pueden permitir la introducción de burbujas de aire que comprometen el flujo de líquido de perfusión en el miocardio. Debido al tamaño diminuto del corazón neonatal, incluso burbujas hora en la vasculatura pueden causar un infarto técn...

La insuficiencia cardíaca es común y mortal. Es una enfermedad progresiva que da como resultado la contractilidad disminuida del corazón, lo que impide el flujo de sangre a los órganos y las hojas de las demandas metabólicas de la insatisfecha cuerpo. Se estima que 5,7 millones de estadounidenses tienen insuficiencia cardiaca y es la primera causa de hospitalización en los Estados Unidos 9. El costo colectiva de tratamiento de los pacientes en la insuficiencia cardíaca en los Estados Unidos excede $ 300 mil millones de dólares por año 9-10. El único tratamiento definitivo para la insuficiencia cardíaca en fase terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100.000 corazones de donantes para procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos 1-2. Debido al limitado número de donantes, sólo aproximadamente 2.400 trasplantes se realizan cada año en los EE.UU. 2. Claramente, esta escasez de órganos debe ser abordado ya que se requieren otras estrategias para producir órganos adicionales para Transplantala e, idealmente, estos órganos sería autólogo a fin de evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida. Cardiomiocitos adultos de mamíferos demuestran una capacidad regenerativa limitada después de la lesión, pero la evidencia reciente sugiere que los corazones neonatales de mamíferos mantienen una notable capacidad de regeneración después de la lesión 5-8. En concreto, después de la resección quirúrgica parcial, una ventana regenerativa ha descubierto entre el nacimiento y postnatal día 7. Este período de regeneración se caracteriza por una falta de cicatriz fibrótica, formación de neovascularización, liberación de factores angiogénicos del epicardio, y la proliferación de los cardiomiocitos 5-8 , 11. Esta ventana de regeneración de tiempo proporciona la posibilidad de utilizar el corazón neonatal como una nueva fuente de material para el desarrollo de un corazón bioartificial. La matriz extracelular es conocido proporcionar señales importantes para promover cardiomyocytproliferación e y el crecimiento. Claras diferencias en la disponibilidad de las moléculas en las matrices neonatales y adultos 12 y su capacidad para promover la regeneración se han explorado 13. matrices adultos descelularizado se han utilizado en varios estudios para proporcionar un andamio ECM para la repoblación celular y la generación de un corazón bioartificial. Si bien estos estudios, y los nuevos descubrimientos en tecnologías de células madre, están avanzando rápidamente, varios obstáculos aún no se han cumplido. Por ejemplo, las limitaciones en la preservación de la estructura nativa de la matriz, la integración celular en la pared de la matriz, y la capacidad para apoyar la proliferación y el crecimiento de todos limitan el éxito de este enfoque. Mientras que los atributos regenerativos superiores se han atribuido al corazón neonatal, los aspectos prácticos del uso de un pañuelo de papel tales han limitado su exploración. Sobre la base de la capacidad de regeneración demostrado del corazón neonatal, hemos desarrollado nuevas matrices mediante el desarrollo de unatécnica de descelularización para el corazón P3 ratón. El corazón P3 fue elegido para estos estudios, ya que se encuentra dentro de la ventana de la regeneración cardiaca como se determina previamente 6 pero el corazón es lo suficientemente grande para la cosecha, decellularize y recellularize. El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de crear una matriz de un corazón neonatal de ratón. Nuestros estudios proporcionan evidencia de la viabilidad de decellularizing un minuto, corazón neonatal mientras se mantiene la integridad estructural y proteico de la ECM. También demostramos la capacidad de recellularize este ECM cardiaca con mCherry cardiomiocitos expresan y hemos examinado estos cardiomiocitos para la expresión de diversos marcadores cardíacos siguientes recelularización. Esta tecnología permitirá para la prueba de la superioridad de una matriz neonatal para el desarrollo de un corazón bioartificial.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Materiales para el aislamiento del corazón del ratón</crías de ratón fuerte></td></tr><tr><td>P1 (como se muestra; B6; D2-Tg (Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultivo</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 (estéril)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Hoja de un solo uso</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tijeras estándar</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de 10 cm</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15024-10</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - 3 mm Herramientas</td> de <td>ciencia fina</td> de filo <td>de corte 15000-00</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>#5 Pinzas</td><td>Dumnot (Herramientas de ciencia fina)</td><td>11295-00</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td colspan="4">2. Materiales para la descelularización</fuerte>Adaptador de</td></tr> <tr><td>entrada</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>tabique esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td></td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>1/8 pulg. ID x Tubo C-Flex de 3/8 de diámetro exterior</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td> esterilizable <td>en autoclave</td></tr><tr><td>Luer macho a adaptador de lengüeta de manguera de 1/8"</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>Luer hembra a adaptador de lengüeta de manguera de 1/8"</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica Prolene 7-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Soporte de anillo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Abrazadera</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Abrazadera soporte regular</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Barril de jeringa de 60 cc&nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>22 G x 1 Jeringa</td><td>BD</td><td></td><td>305155 o equivalente</td></tr><tr><td>Jeringa de 12 cc</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>llave de paso de 3 vías</td><td>Smith Medical MX5311L</td><td></td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tubo PE50</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Debe ser moldeable por el calor. Se recomienda polietileno.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Se recomienda el grado ultrapuro. Prepare una solución fresca y filtre la esterilización antes de usar.</td></tr><tr><td>1% Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare una solución fresca a partir de un 10% de caldo y filtre la esterilización antes de usar.</td></tr><tr><td>Agua purificada estéril con sistema dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>o MilliQ.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>o equivalente &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3. Materiales para la cuantificación de ADN</</td></tr><tr><td>proteinasa</td> > fuerte, <td>K</td>, <td>Fisher BP1700</td><td>>30 U/mg, actividad</td></tr>, <tr><td>KCl</td><td>, Sigma-Aldrich,</td><td>P9333</td><td>o equivalente</td></tr>: <tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tris base/clorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>o</td></tr><tr><td>kit de ensayo Pico-Green dsDNA</td> equivalente <td>Life Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td><td>requiere que el fluorímetro lea</td></tr><tr><td colspan="4">4. Método para la fijación y corte de tejido</fuerte></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>o gelatina</td></tr><tr><td>equivalente Tipo A de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>debe tener 300 bloom o más</td></tr><tr><td colspan="4">5. Método para la histología de tejidos</fuerte></td></tr><tr><td>Criomoldes 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Hematoxilina 560&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Blue buffer&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Eosina Alcohólica Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801615</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Fórmula 83 Sustituto de xileno&nbsp;</td><td>CBG Biotech&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Permount Mounting Mount&nbsp;</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Anticuerpo de colágeno IV</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>&alpha;-Anticuerpo de actinina</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>mCherry Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Anticuerpo NKX2.5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Burro anti-ratón AF488 </td><td>Anticuerpo Life Technology</td><td>A21202</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Donkey anti-pollo AF594 Anticuerpo</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-cabra contra burros CY5</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>o equivalente</td></tr>, <tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), AF594</td>, <td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>o equivalente,</td></tr><tr><td>Prolong, Gold Antifade Mountant con DAPI</td>, <td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td colspan="4">6. Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares neonatales mediante pre-siembra</HBSS fuerte></td></tr> <tr><td>(Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-CL</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cell Sfilter</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>50 ml tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm placas</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>La superficie de Primeria mejora la adhesión de los fibroblastos promoviendo una mayor pureza de los miocitos</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>DNasa II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vitamina B12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>o</td></tr><tr><td>placas equivalentes recubiertas de fibronectina&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cristalería de biorreactor cardíaco</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>Debe ser esterilizable en autoclave o gas.</td></tr></tbody></table>

los andamios neonatal cardíaca: matrices novedosos para estudios regenerativos

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

La única terapia definitiva para la insuficiencia cardíaca terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100,000 corazones de donantes para los procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos1-2. Debido al número limitado de donantes, solo se realizan aproximadamente 2,400 trasplantes cada año en los EE. UU.2. Se han llevado a cabo numerosos abordajes, desde estudios de terapia celular hasta la implantación de dispositivos de asistencia mecánica, ya sea solos o en combinación, en un intento de persuadir al corazón para que se repare a sí mismo o para que descanse el corazón que falla. A pesar de estos esfuerzos, los dispositivos de asistencia ventricular todavía se utilizan en gran medida con el propósito de tender puentes hacia el trasplante y la utilidad de las terapias celulares, si bien tienen cierta promesa curativa, todavía se limita a los ensayos clínicos. Además, se ha intentado un xenotrasplante directo, pero el éxito ha sido limitado debido al rechazo inmunitario. Claramente, se requiere otra estrategia para producir órganos adicionales para trasplante y, idealmente, estos órganos serían autólogos para evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida. La descelularización es un proceso de eliminación de células residentes de los tejidos para exponer la matriz extracelular nativa (MEC) o andamio. La descelularización por perfusión ofrece la preservación completa de la estructura tridimensional del tejido, al tiempo que deja intacta la mayor parte de las propiedades mecánicas del tejido4. Estos andamios se pueden utilizar para la repoblación con células sanas para generar modelos de investigación y, posiblemente, órganos muy necesarios para el trasplante. Hemos expuesto los andamios de ratones neonatos (P3), conocidos por conservar notables capacidades regenerativas cardíacas5-8, a la descelularización mediada por detergentes y hemos repoblado estos andamios con células cardíacas murinas. Estos estudios respaldan la factibilidad de diseñar una construcción de corazón neonatal. Además, permiten investigar si la MEC de los corazones postnatales tempranos puede albergar señales que resulten en mejores estrategias de recelularización.

descelularización En promedio, el tiempo para la descelularización de un corazón P3 usando este protocolo es de aproximadamente 14 hr. dado el peso del corazón promedio de 23 mg para el recién nacido P3. Acellularity La figura 3a muestra un corazón neonatal P3 completamente intacto (todo el montaje). La Figura 3b muestra el mismo corazón después de descelularizac...

En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

El objetivo general de esta metodología es generar nuevos andamiajes a partir de tejido cardíaco neonatal de mirián para su uso en estudios regenerativos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cardiología regenerativa. Proporciona un modelo novedoso para el estudio de las interacciones célula-matriz, ya que la matriz extracelular se deriva de tejido cardíaco con capacidad de proliferación.La principal ventaja de esta técnica es que permite el descubrimiento de novedades en la matriz extracelular neonatal. Stefan Kren, un técnico en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Antes de comenzar el procedimiento, pase una sección de cuatro centímetros de tubo de PE 50 sobre una pequeña llama de alcohol para crear un catéter más pequeño y delgado.Recorte los extremos a las dimensiones adecuadas para obtener dos catéteres simétricos desde cada lado del PO y coloque brevemente un extremo cortado del tubo en la llama para fundir una lámina sobre la abertura del extremo delgado. A continuación, llene una jeringa de 12 mililitros con PBS y coloque una llave de paso de tres vías en la jeringa. Conecte una aguja de calibre 22 a la llave de paso e inserte la aguja a través del septum.Luego, deslice el catéter de tubo de PE sobre la aguja y lave el conjunto con PBS. Cuando el conjunto del catéter esté listo, limpie el tórax del neonato con etanol al 70 %. Luego, use tijeras estándar para cortar la piel del pecho, mientras tira lateralmente del tejido con una pinza número cinco.A continuación, perfore la pared abdominal justo por debajo del esternón y sujete el proceso xifoides con la pinza. Retraiga el esternón en dirección rostral respecto al cuerpo mientras corta a través de las costillas en ambos lados del tórax, y refleje la caja torácica en dirección superior. Cuando el corazón sea visible, tire lateralmente del timo para diseccionar los dos lóbulos principales, exponiendo el arco de la aorta y las venas cavas y pulmonares.Utilizando tijeras de resorte de 10 centímetros, seccionar las arterias principales desde el arco aórtico, así como la propia aorta. Agarrar los extremos de los vasos seccionados para reflejar el corazón hacia adelante, separándolo de la tráquea y el esófago, y cortar entre los pulmones y el corazón y en ambos lados del corazón para seccionar la vasculatura pulmonar y otras venas principales. Luego, agarrar los extremos seccionados de los vasos principales y extraer el corazón del mediastino, colocando el corazón en una placa de cultivo de 60 milímetros que contenga PBS estéril.Para descelularizar el corazón, coloque la placa de cultivo bajo un microscopio de disección e inserte la aguja del ensamblaje del catéter en la aorta hasta, pero sin sobrepasar, la válvula aórtica. Sujete la aguja con un lazo de sutura 7-0, apoyando la falange del catéter proximalmente contra el lazo y formando un sello hermético, y perfunda suavemente el corazón con PBS. Si no hay fugas, el tejido se volverá homogéneamente pálido a medida que se elimine la sangre latente.Coloque el septo en el cuello del adaptador de entrada y doble los lados del septo sobre el vidrio. A continuación, conecte un reservorio lleno con 60 mililitros de dodecilsulfato de sodio al 1 % en agua destilada mediante una línea de longitud suficiente para generar una columna que produzca una presión de 20 milímetros de mercurio, y perfunda el corazón con SDS durante 14 horas. Al final de la perfusión, el corazón estará translúcido sin tejido restante observable.Lave el sistema hasta la llave de paso con la solución SDS restante y llene el depósito con 10 mililitros de agua desionizada. A continuación, lave el corazón con perfusiones consecutivas de 10 mililitros de Triton X-100 al 1%, 10 mililitros de agua desionizada y 60 mililitros de PBS que contenga penicilina y estreptomicina. Después de la última perfusión, guarde el corazón en PBS con antibióticos a cuatro grados centígrados.Para recelularizar el tejido, transfiera la matriz cardíaca con catéter a una placa de cultivo de 60 milímetros bajo un microscopio estereoscópico y conecte una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 22 cargada con las células adecuadas de interés al catéter. Confirme que el ensamblaje esté libre de burbujas y perfunda suavemente 20 microlitros de la suspensión celular por minuto en la matriz cardíaca a través de las arterias coronarias. Una vez que se hayan administrado 100 microlitros de las células, desconecte la jeringa y empuje el catéter hacia un extremo romo de calibre 22 sujeto al adaptador tipo aguja en la parte inferior de la tapa del frasco del biorreactor para corazón.Ahora, encienda la bomba peristáltica y confirme que el flujo avanza desde el depósito, pasando por la bomba, a través del trampa burbujas, hacia el catéter, y que la circulación cardíaca fluye hacia fuera por las venas y gotea desde el ápice, recirculando hacia el depósito de medio. En estas imágenes, se muestra la tinción con hematoxilina y eosina de corazones intactos y descelularizados. Observe la ausencia de núcleos positivos a la hematoxilina y la reducción de las estructuras eosinófilas en el corazón descelularizado.Para evaluar el contenido de la matriz extracelular en corazones neonatales intactos y descelularizados, la inmunotinción demuestra que el colágeno IV se expresa robustamente tanto en el corazón intacto como en el descelularizado, y que la localización de esta proteína se mantiene tras la eliminación celular, mientras que los núcleos positivos para DAPI se eliminan eficazmente. El contenido de ADN también disminuye en los corazones neonatales tras la descelularización basada en detergentes, lo cual es consistente con informes que utilizan la descelularización basada en detergentes en otros tejidos. En estas imágenes, pueden observarse cardiomiocitos recelularizados que han migrado hacia la pared del ventrículo izquierdo.Hasta 23 días después de la perfusión, estas células migradas pueden ser positivas para marcadores de células progenitoras cardíacas, mCherry, marcadores de cardiomiocitos diferenciados o DAPI, con la mayoría de las células expresando los cuatro marcadores. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 34 horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de no embolizar el corazón introduciendo aire a través del aparato de perfusión.Tras seguir este procedimiento, la producción de geles e impresión 3D pueden utilizarse para crear injertos proliferativos o incluso corazones 3D in vitro. Esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores promuevan la regeneración cardíaca. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo descelularizar y recelularizar un corazón de ratón neonato.No olvide que trabajar con dodecilsulfato de sodio puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar una máscara N-95 o una campana extractora al manipular el reactivo en polvo seco.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas...

Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

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Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

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Este protocolo describe un modelo altamente reproducible de regeneración cardíaca por inducción quirúrgica de infarto de miocardio en el ventrículo izquierdo de ratones postnatales día 1. El método consiste en la inducción de anestesia hipotérmica y la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda.

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

La matriz extracelular cardiaca (ECM) es una compleja red de moléculas que orquestar procesos clave en los tejidos y órganos mientras aguantando remodelación fisiológica durante toda la vida. Descelularización estandarizado del corazón fetal y adulto permite estudios experimentales comparativos de ambos tejidos en un contexto 3D mediante la captura de arquitectura original y propiedades biomecánicas.

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

Decellularized andamios derivados de cartílago pueden utilizarse como un andamio para reparación de cartílago de guía y como medio para regenerar tejido osteocondral. Este documento describe el proceso de descelularización en detalle y ofrece sugerencias para utilizar estos andamios en configuración in vitro.

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Aquí se presenta un conjunto de protocolos para la generación y criopreservación de esferoides cardíacos (CS) a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos cultivados en un formato multidimensional de alto rendimiento. Este modelo tridimensional funciona como una plataforma robusta para el modelado de enfermedades, exámenes de detección de alto rendimiento y mantiene su funcionalidad después de la criopreservación.

Generación, detección de alto rendimiento y biobancos de esferoides cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

En este trabajo se presenta un modelo animal de fibrosis inducida por transición endotelial-mesenquimatosa, como se observa en defectos cardíacos congénitos como la estenosis aórtica crítica o el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, que permite la evaluación histológica detallada del tejido, la identificación de vías de señalización reguladoras y la prueba de opciones de tratamiento.

Un modelo de trasplante de corazón de rata heterotópico neonatal para el estudio de la transición endotelial a mesenquimal

Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.

Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo

Aprende a generar andamios cardíacos a partir de tejido neonatal de ratón para estudios regenerativos. Este método permite investigar las interacciones célula-matriz y las propiedades únicas de la matriz extracelular neonatal.

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

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