Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

El objetivo general de este procedimiento es formar, modelar y encapsular células dentro de matrices extracelulares basadas en polímeros sintéticos. Este método se puede utilizar para abordar cuestiones biológicas críticas relacionadas con la identificación de señales extracelulares que regulan las respuestas celulares dentro de microambientes heterogéneos. La principal ventaja de esta técnica es que se genera una matriz sintética robusta para la encapsulación y cultivo celular utilizando protocolos y materiales accesibles.

Este método se puede utilizar para el cultivo celular controlado y para estudiar la respuesta celular in vitro. Se puede aplicar a otros sistemas, como la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos. Prepare los materiales para la formación de hidrogeles como se describe en el protocolo de texto.

Coloque una lente colimadora en el extremo de la guía de luz llena de líquido para garantizar una intensidad de luz relativamente uniforme en todas las muestras. Ajuste la distancia de la guía de luz a las muestras para lograr un tamaño de punto que cubra las muestras de interés. Para hacer hidrogeles sin patrones, prepare hidrogeles gruesos moldeados en puntas de jeringa pipeteando de 10 a 20 microlitros de la solución precursora de gel en la punta de una jeringa cortada estéril.

Haga un solo gel por jeringa para que tenga aproximadamente de 0,5 a 1,5 milímetros de grosor, según el volumen y el diámetro de la jeringa. Prepare hidrogeles delgados en moldes de portaobjetos de vidrio colocando la junta de goma alrededor de los bordes del portaobjetos de vidrio sin recubrimiento. A continuación, pipetee de cinco a 10 microlitros de la solución precursora de gel en el portaobjetos de vidrio sin recubrimiento.

Y coloque el portaobjetos de vidrio recubierto con antiadhesivo encima de la solución de gel. Asegure los portaobjetos de vidrio con pequeños clips de carpeta para estabilizarlos. Ajuste la intensidad de la lámpara para lograr 10 milivatios por centímetro cuadrado en la superficie del gel para moldes de punta de jeringa o moldes de portaobjetos de vidrio.

Uso de un radiómetro para detectar la intensidad. Y coloca los moldes debajo de la lámpara. Aplique luz durante uno a cinco minutos para permitir la polimerización completa de los geles.

Utilice un tiempo de polimerización más corto para geles con mayor contenido de tereftalato de polietilenglicol. Y un mayor tiempo para que los geles con un contenido más bajo produzcan hidrogeles totalmente polimerizados con módulos dentro de la gama de tejidos blandos. Coloque los geles de los moldes de la punta de la jeringa en una placa estéril de 48 pocillos sin tratar y coloque los portaobjetos de vidrio en un plato estéril.

Para preparar hidrogeles modelados, prepare la solución precursora como se describe en el protocolo de texto y pipetee la solución vigorosamente para asegurar una mezcla uniforme de la solución. A continuación, cubra los geles preformados con un péptido de pentatón en la solución fotoiniciadora de fosfato de litio e incube durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire el exceso de solución.

Si los geles se moldean en la punta de una jeringa, use una espátula para transferir cuidadosamente de la placa de 48 pocillos a un portaobjetos de vidrio estéril para crear patrones. Coloque una mascarilla fotográfica con el patrón deseado directamente encima de la jeringa y los geles moldeados por portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que la parte impresa de la mascarilla toque el gel para una fidelidad óptima del patrón.

Coloque las muestras debajo de la lámpara e irradie durante un minuto. Después del modelado, coloque los geles moldeados con jeringa en una placa estéril de 48 pocillos tratada con cultivo de tejidos. Coloque los geles moldeados de portaobjetos de vidrio que se adhieren a los portaobjetos de vidrio en un plato estéril.

Enjuague tres veces, 15 minutos con medio cultivado o el tampón adecuado en función de los experimentos planificados. Para preparar la detección y cuantificación de tioles libres en hidrogeles fotomodelados, primero prepare las soluciones y realice los cálculos como se describe en el protocolo de texto. Forme hidrogeles finos para modelar como antes.

Específicamente, haga geles con exceso de tioles libres y modele la mitad de estas muestras con el péptido pentón usando un cubreobjetos transparente para exponer completamente todo el gel con luz. Coloque geles estampados y no estampados en los pocillos de una placa de 48 pocillos. Enjuague durante 15 minutos, tres veces con el tampón de reacción de Ellman, para permitir la difusión de las especies reaccionadas al final fuera del gel y que se produzca una hinchazón de equilibrio.

Agregue tampón de reacción de Ellman adicional a los geles de enjuague, de modo que el volumen de gel hinchado con el tampón de reacción sea un múltiplo de 20 microlitros. Por ejemplo, si el volumen de gel hinchado previsto es de 15 microlitros, agregue cinco microlitros de tampón de reacción. Y si el volumen de gel hinchado previsto es de 30 microlitros, agregue 10 microlitros de tampón de reacción.

Pipetear los patrones de la Sixtina en pocillos individuales de una placa de 48 pocillos en múltiplos de 20 microlitros. Dependiendo del volumen utilizado en el paso anterior. Por ejemplo, si el paso anterior tenía un volumen de gel hinchado, más un tampón de reacción adicional igual a 40 microlitros, agregue 40 microlitros de cada patrón a los pocillos vacíos individuales.

A continuación, diluya el reactivo de Ellman y el tampón de reacción. Agregue el reactivo de Ellman diluido a los pocillos que contengan patrones y muestras. Para muestras de 20 microlitros, agregue 183,6 microlitros de solución a cada pocillo.

Incubar o colocar en un agitador durante una hora y treinta minutos, o hasta que el color de la solución coincida con el color de los geles mediante inspección visual, para asegurar una difusión suficiente del dianión amarillo 2-Nitro-5-tiobenzoico, que se genera tras la reacción del reactivo de Ellman con los tioles libres del gel. Tome 100 microlitros de solución de las muestras y los patrones y colóquelos en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Lea la absorbencia a 405 nanómetros en un lector de placas.

Para visualizar los patrones fotográficos, elimine el exceso de tampón de reacción limpiando suavemente los bordes del hidrogel con un pañuelo de papel. Pipetea el reactivo de Ellman directamente sobre la superficie del gel. Imagen inmediata en un microscopio óptico a 10x o en un microscopio estereoscópico con una cámara a color.

Recoja las celdas y prepárelas para la encapsulación como se describe en el protocolo de texto. Inmediatamente después de aspirar PBS, suspenda las células peletizadas en la solución precursora hasta una concentración final de cinco mil células por microlitro. Deje una concentración adecuada de tioles libres para su posterior reacción con el péptido pentón.

Si se desea un patrón fotográfico. Moldee, polimerice y modele los hidrogeles como antes. Enjuague los geles durante 10 minutos, tres veces, en el medio de crecimiento después del patrón para eliminar las especies no reaccionadas y el exceso de fotoiniciador de fosfato de litio.

Incubar los geles en un medio de crecimiento a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2 hasta el punto de tiempo deseado para su posterior análisis. Reponga el medio cada 48 horas, o según lo determinen las aplicaciones. Para determinar la viabilidad de las células encapsuladas, primero retire el medio de crecimiento de los geles y enjuague durante 15 minutos, tres veces, con PBS para permitir la difusión del medio de los geles.

Agregue dos microlitros de homodímero-1 de etidio de dos milimolares descongelados y 0,5 microlitros de las soluciones de AN de calcio de cuatro milimolares descongeladas, a un mililitro de PBS estéril. Vórtice para asegurar una mezcla completa. Agregue 300 microlitros de solución estancada a cada gel de molde de jeringa en las placas de 48 pocillos, o lo suficiente para cubrir la superficie del gel en un portaobjetos de vidrio en un plato estéril.

E incubar durante 45 minutos. Retire el exceso de solución estancada y enjuague para eliminar el exceso de tinte de los geles. Tome imágenes de las células en un microscopio confocal.

O en un microscopio de epifluorescencia con capacidad de 10x. Y 488 nanómetros de excitación y 525 nanómetros de emisión. La concentración de tiol libre de hidrogeles no modelados y con patrones cuantificada con Ellman demostró que los hidrogeles inicialmente poliméricos durante un minuto y durante cinco minutos tienen concentraciones de tiol libre estadísticamente similares, lo que indica una reacción rápida y una gelificación completa en un minuto.

El subsiguiente patrón a granel de los geles incubados con péptidos de penta durante 30 minutos, y durante una hora y 30 minutos, tiene una reducción del 60 al 80 por ciento en la concentración de tiol libre, lo que indica una modificación eficiente del exceso de tiol. Los patrones fotográficos formados por el brillo de la luz a través de muestras cubiertas con máscaras, impresas aquí con líneas, se pueden observar en dos dimensiones con la aplicación del reactivo de Ellman. O bien, en tres dimensiones con la incorporación de péptidos fluorescentes en imágenes posteriores.

Las células madre humanas adultas encapsuladas dentro de hirogeles se trataron con tinciones de viabilidad e hidrotoxicidad. Y se le tomaron imágenes con microscopía confocal. Las células viables sin daño en la membrana se etiquetan en verde e indican la supervivencia de las células un día después de la encapsulación.

Las células comienzan a diseminarse dentro de la matriz seis días después de la encapsulación. Como se muestra en la imagen insertada. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener procedimientos de manipulación estériles y cuidadosos para evitar daños a las células después de la encapsulación mediante la introducción de contaminantes o transparencias mecánicas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunotinción, la citometría de flujo y las expresiones génicas, para estudiar la función y el destino de las células en respuesta al entorno extracelular. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en los campos de la biología, la bioingeniería y la medicina, estudien la erosión de la región tisular o la progresión de la enfermedad en matrices extracelulares sintéticas con control de propiedades definidas por el usuario, hacia el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encapsular células y modelar matrices blandas para estudios de cultivos celulares controlados.