Name: Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a formar y patronar hidrogeles mediante luz para cultivos celulares tridimensionales usando química fotoclick citocompatible. Este método permite encapsular células y estudiar sus respuestas en microentornos heterogéneos controlados.

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Este trabajo fue apoyado por los programas de Delaware Cobre, en el descubrimiento de medicamentos y en Biomateriales avanzados financiados por los Premios de Desarrollo Institucional del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (P20GM104316 y GM110758-01 P30, respectivamente), el Pew Charitable Trusts (00026178), el Premio Nacional de Carrera Science Foundation (DMR-1253906), el Fondo Burroughs Wellcome (1.006.787), y el programa Nacional de Ciencia Fundación IGERT SBE2 en la Universidad de Delaware (beca para L. Sawicki). Los autores agradecen al Centro de Delaware BIOimagen Instituto de Biotecnología de la Universidad de Delaware para la formación y el acceso a la microscopía confocal, Sra. Katherine Wiley de asistencia durante la filmación del video, el Sr. Mateo Rehmann generosamente para proporcionar hMSCs aisladas de la médula ósea, el profesor Christopher J . Kloxin y el Sr. Stephen Ma generosamente para proporcionar máscaras, y el Prof. Wilfred Chen por el uso del lector de placas automático. </p&gt;

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Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento presentado aquí demuestra técnicas para photoencapsulate células dentro de los hidrogeles formados por tiol-eno química modular y posteriormente photopattern los geles con señales bioquímicas. El uso de la luz para formar inicialmente hidrogeles permite una mezcla homogénea y la suspensión de las células dentro de la solución de polímero antes de la polimerización. Los rápidos de polimerización &#39;&#39; cerraduras el gel en la forma del molde definida y encapsula las células dentro de la red de hidrogel suspendidos. Los geles también pueden moldearse en numerosas formas diferentes (por ejemplo, diapositivas de vidrio o puntas de jeringa) dependiendo de la aplicación final deseada. Por ejemplo, las células encapsuladas para la cultura en 3D hidrogeles fijados a portaobjetos de vidrio son particularmente útiles para aplicaciones de imagen como atenuación de la luz es limitada dentro de una muestra delgada. moldes de jeringa se pueden utilizar para una rápida encapsulación de células, lo que permite un mayor número de muestras para estar preparados en un tiempo corto (en comparación con portaobjetos de vidrios) que se puede utilizar para experimentos que requieren un gran número de células, tales como citometría de flujo o qPCR. Posteriormente, estos geles a continuación, pueden estar decoradas con señales bioquímicas para provocar respuestas celulares deseados tales como la diferenciación o la invasión 30,31. Los ensayos para la viabilidad y la actividad metabólica indican la supervivencia de las células para el sistema de materiales y condiciones de modelado presentados. Tenga en cuenta que la actividad metabólica se monitorizó hasta el día 3 en geles no degradables (RGKGRK péptido de reticulación) para evaluar los efectos iniciales de condiciones de polimerización y los patrones sobre la función celular. Además, un ensayo de integridad de la membrana (viabilidad / citotoxicidad tinción vivo / muerto) de hMSC a 1 y 6 días después de la encapsulación en geles formulados con un péptido de reticulación degradable (GPQGIWGQ) admite que las células permanecen viables y se extendió a 1 semana de cultivo. La viabilidad de las líneas celulares adicionales se ha informado de las condiciones photopatterning 32 similares a lasutilizado aquí y puede ser evaluado por el sistema de hidrogel se describe mediante la tinción en vivo / muerto y ensayos de actividad metabólica. Si bien no hemos observado problemas con la viabilidad celular usando este sistema de materiales y procedimientos conexos (4.2 y 4.3), algunos tipos de células pueden ser sensibles a liberar radicales libres y / o exposición a la luz. En este caso, los usuarios pueden considerar el uso de sistemas de materiales no fotoiniciadas, como azida-alquino, 12 FXIII, 31 o químicas de la formación del hidrogel a base de Alder Diels. 33 técnicas fáciles de detectar y cuantificar los patrones de señales bioquímicas dentro de geles también son presentados (3.1 y 3.2). Ensayo de Ellman es de particular interés debido a que los reactivos están disponibles comercialmente y no se requieren etapas de procesamiento adicionales o sintético reactivos más costosos (por ejemplo, péptido marcado fluorescentemente). ensayo de Ellman se puede utilizar para determinar con precisión la modificación de tioles libres con señales bioquímicas bajo different photopatterning condiciones, así como para visualizar rápidamente patrones. Para la cuantificación de la incorporación de péptidos, la concentración de grupos funcionales tiol antes y después de patrón, como una medida cuantitativa de incorporación de péptido, se evalúa directamente con el ensayo de Ellman. Aunque este tipo de cuantificación se puede hacer con péptidos fluorescentemente marcada, 34 de cuantificación basado en formación de imágenes requiere más manejo y análisis de los pasos que consumen mucho tiempo (por ejemplo, la síntesis de un péptido marcado fluorescentemente y la generación de una curva de calibración para relacionar la fluorescencia a concentración de péptido usando análisis de imagen). Para imágenes péptido incorporación, reactivo de Ellman se puede aplicar directamente a las muestras inmediatamente y visualiza. Si bien limitado a los ejes x e y planos para la visualización de patrón, la técnica se puede utilizar como un método simple, rutina para determinar si se han modelado matrices que contienen grupos tiol libres. Es importante observar que el ensayo de Ellman no es ccitocompatible onsidered, lo que si bien se puede utilizar para observar y cuantificar photopatterns, no puede realizarse en la presencia de células. Para la formación de imágenes patrón en tres dimensiones y en la presencia de células, la conjugación de péptidos fluorescentes dentro de matrices de hidrogel sigue siendo un enfoque poderoso y ampliamente utilizado. Resolución de patrones puede ser evaluada en los ejes X, Y y Z. aviones usando microscopía confocal, y este método es citocompatible para que las células dentro de las regiones estampadas o regiones no se pueden identificar con dibujos. En su conjunto, las técnicas de ensayo y basados ​​en la imagen de Ellman son herramientas complementarias para los investigadores evaluar cuantitativa y cualitativamente la photopatterning de señales bioquímicas dentro del sistema de materiales. Photoclick, o más fotoiniciada ampliamente, químicas para la formación y modificación de hidrogeles en la presencia de células son numerosas. Las piezas de fundición, encapsulación, y el patrón técnicas presentadas aquí no son limITED al sistema material descrito y se puede aplicar a las químicas basadas en la luz alternativas, tales como tiol-alquino, 35 azida-alquino, 4 y otras químicas de tiol-eno (por ejemplo, tiol-norborneno), 10,13, así como con fotoiniciadores diferentes, tales como Irgacure 2959, eosina y, y camforquinona. Tenga en cuenta, los usuarios pueden necesitar para ajustar los parámetros de procedimiento (por ejemplo, tiempos de incubación, los tiempos de polimerización, la densidad celular) para garantizar que las condiciones siguen siendo citocompatible para estos otros sistemas. Dado que el proceso requiere patrones de difusión del péptido (s) alloc modificado en el hidrogel (2.2.3-2.2.5), este proceso puede resultar más útil para la adición de restos de unión a integrina (por ejemplo, péptidos o proteína de la matriz extracelular fragmentos) al hidrogel, donde se requiere la unión del ligando a la red para la generación de fuerzas de tracción por la activación celular y la integrina completo. 36 Nota, para biomoléculas que puedenser igualmente activo en solución o en el momento de inmovilización (por ejemplo, factores de crecimiento o citoquinas), la etapa de incubación para la difusión resto (~ 1 h) en el hidrogel podría conducir a eventos que convoluta resultados de modelado de señalización. Se han establecido otros métodos para la inmovilización del factor de crecimiento o el secuestro local para su patrón. 37-39 Además, la resolución de patrón viene dado por el control de la exposición a la luz. Aquí, máscaras permiten la creación de patrones a través de la profundidad de gel y en las direcciones x e y aviones; sin embargo, un mayor control espacial sobre los patrones de señales bioquímicas dentro de los geles se puede lograr con los métodos alternativos de irradiación, tales como el uso de un microscopio confocal de dos fotones para generar patrones en el x-, y-, y z- aviones. 34,40 finalmente, es importante señalar que mientras que el sistema de material utilizado en este procedimiento sólo se modifica inicialmente con las señales bioquímicas, químicas Photoclick ortogonales se podrían usar para permitir alteraciones en las propiedades de la matriz a través del tiempo. 12 El procedimiento y las técnicas que aquí se presentan se suman la diversidad de los enfoques actuales para la creación de matrices sintéticas con propiedades bien definidas y controladas por espaciotemporalmente. En particular, la disponibilidad comercial de los reactivos y materiales utilizados en este procedimiento será útil para una amplia gama de investigadores interesados ​​en el uso de biomateriales a base de hidrogel para aplicaciones en cultivo celular controlada.

Haga clic en las químicas se utilizan cada vez más en el diseño de materiales para numerosas aplicaciones biomédicas, incluyendo la administración de fármacos, la ingeniería de tejidos, y el cultivo celular controlada, debido a su reactividad citocompatible selectivos y eficientes, y con frecuencia. 1-3 químicas Photoclick que utilizan la luz para activar o iniciar reacciones (por ejemplo, azida-alquino, 4 tiol-eno, 5 y tetrazol-alqueno 6) son de particular interés para la formación o modificación de biomateriales. Un ritmo rápido en condiciones suaves y control de cuándo y dónde se llevan a cabo con la luz hacen que estas reacciones muy adecuados para el control dirigido por el usuario de las propiedades de biomateriales en la presencia de células de 7,8. En particular, las químicas tiol-eno Photoclick se han utilizado para generar biomateriales a base de hidrogel con robustas propiedades mecánicas 5,9 y para la encapsulación de una amplia variedad de tipos de células, incluyendo, pero not limitado a, células madre mesenquimales humanas (hMSC), fibroblastos, condrocitos, y células pancreáticas, con promesa para el cultivo celular y la entrega. 10,11 Además, estas sustancias químicas se han utilizado para el patrón espacial de las señales bioquímicas para imitar aspectos clave de microambientes de células nativas y facilitar las interacciones célula-matriz apropiados, incluyendo la adhesión, diferenciación, y la invasión. 3,12 Para la construcción de hidrogeles tiol-eno con luz, péptidos que contienen cisteína (tiol) se hacen reaccionar con polímeros funcionalizados con acrilatos o norbornenos ( &#39;eno&#39;) para una rápida polimerización, fotoiniciada en condiciones citocompatible. 13 La expansión de esta caja de herramientas, hemos tratado de establecer métodos para la formación del hidrogel con nuevos bloques de construcción versátil y accesible que requiere un procesamiento mínimo sintético o estaban disponibles comercialmente hacia su amplio uso como matrices extracelulares sintéticas.14 En concreto, los péptidos se modifican con aliloxicarbonilo (Alloc) -Protegido lisinas: uno para el colgante, grupos de unión a integrinas para promover la adhesión celular [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] o dos de enlaces cruzados no degradables o de células degradable [K ( alloc) RGKGRKGK (alloc) G o KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc, respectivamente]. Con estas secuencias, se establecieron las condiciones para la reacción rápida (1-5 min) con cuatro brazos poli modificado con tiol (etilenglicol) (PEG4SH) utilizando dosis citocompatible de luz UV de longitud de onda larga (10 mW / cm2 a 365 nm) y el fotoiniciador de litio fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Los hidrogeles resultantes eran estables bajo condiciones de cultivo celular durante semanas. Para habilitar la degradación impulsado por células y remodelación, un péptido enzimáticamente escindible se incorporó dentro de las reticulaciones de gel (es decir, GPQGIWGQ), 15 y una célula primaria modelo, las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC), se mantuvo altamente viable después de la encapsulación y during cultura dentro de estas matrices. Además, los péptidos se han modelado espacialmente dentro de estos materiales, y hMSCs siendo viable y metabólicamente activa en condiciones photopatterning. Secuencias de péptidos colgante alternativas, no mostrados aquí (por ejemplo, IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), también se puede incorporar dentro de matrices para sondear las interacciones de células adicionales con el microambiente circundante. Estos resultados son prometedores para la aplicación de estos materiales a base de hidrogel para (3D) de cultivo de células en tres dimensiones y la entrega a estudiar y las interacciones célula-matriz directos para una variedad de tipos de células. En esto, los métodos para photoencapsulate células y señales bioquímicas posteriormente photopattern dentro del sistema de hidrogel propuesta se presentan (Figura 1). Las técnicas para observar y cuantificar estos photopatterns también se demuestran: en particular, i) el uso cuantitativo y cualitativo de ensayo de Ellman para determinar la modifición de tioles libres dentro de sustratos estructurados y ii) la utilización cualitativa complementaria de péptidos fluorescentes (AF488Pep1Alloc) para observar estos patrones en tres dimensiones. Además, los ensayos para determinar la viabilidad (viabilidad / citotoxicidad tinción Live / muerto) y la actividad metabólica (MTS; 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio) se presentan de modo que los usuarios pueden determinar la citocompatibilidad de las condiciones photoencapsulation y photopatterning para diferentes líneas celulares dentro de matrices de hidrogel. Mientras que el protocolo se demuestra para un sistema de Photoclick hidrogel basada en la luz Facile, las técnicas pueden aplicarse a muchos otros sistemas de hidrogel iniciadas por radicales para photoencapsulation y photopatterning en presencia de células.

<table><tbody><tr><td>Péptidos personalizados</td><td>Varios proveedores</td><td>----</td><td>Los péptidos también se pueden sintetizar a través de técnicas SPPS estándar con materiales de proveedores como ChemImpex y ChemPep.</td></tr><tr><td>4 brazos PEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Listado en PEG homofuncionales de múltiples brazos. PEG4SH también se puede sintetizar como se mencionó anteriormente.</td></tr><tr><td>Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato</td><td>de litio Soluciones de fotopolímero de Colorado</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilfenilfosfonito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470</td><td>Precaución, causa quemaduras graves en la piel y daño ocular. Use guantes, ropa y protección para los ojos.</td></tr><tr><td>Cloruro de 2,4,6-trimetilbenzoilo</td><td>Sigma Aldrich 682519</td><td></td><td>Precaución, causa quemaduras graves en la piel y daño ocular. Use guantes, ropa y protección para los ojos.</td></tr><tr><td>Bromuro de litio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-butanona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>matraz, fondo redondo, 100&nbsp; ml Chemglass</td><td></td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml Embudo de filtro, Buchner, Frita mediana</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>Se puede utilizar papel de filtro dentro de un embudo de vidrio normal si se desea.</td></tr><tr><td>Barras de agitación magnéticas</td><td>Varios proveedores</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Agitación magnética y placa caliente</td><td>Varios proveedores</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Desecador al vacío</td><td>Varios proveedores</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sin rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Seleccione el medio y la tripsina adecuados según el tipo de célula.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>de varios proveedores</td><td>----</td> <td>tamaños de 1,5 o 2 ml, estériles.</td></tr><tr><td>Jeringa BD con puntas deslizantes (Luer) (sin aguja)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>El número de producto que aparece aquí es para una jeringa de 1 ml (16H), hay varios tamaños disponibles (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio liso premium de Fisherfinest</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Caucho de silicona de alta pureza, 0.010" de grosor, hoja de 6" x 8", durómetro de 55 A (junta)</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 pruebas</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, Amazon original</td><td></td><td>800002243</td><td>Se puede comprar a otros proveedores.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>Photomask Division, se pueden imprimir diferentes diseños según se desee.</td></tr><tr><td>DTNB; Reactivo de Ellman; 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio Dibásico</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5136</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, pellets/Certificado ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ortofosfórico</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de cisteína monohidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de viabilidad/citotoxicidad, para células de mamíferos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Ensayo acuoso de una solución</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Varios proveedores</td><td>----</td><td>Capaz de velocidades de 90-110 x g.</td></tr><tr><td>Lector de placas multipocillo</td><td>de varios proveedores</td><td>----</td><td>Capaz de leer la absorbancia a 405 nm en una placa de 96 pocillos.</td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente o confocal</td><td>de varios proveedores</td><td>----</td><td>Para visualizar patrones de péptidos y células dentro de hidrogeles.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>Se pueden utilizar sistemas de luz alternativos para polimerizar hidrogeles.</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite Software</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>Disponible en zeiss.com; compatible con imágenes tomadas con microscopios Zeiss</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td>----<td>Disponible en imagej.nih.gov; aplicable para el análisis general de imágenes</td></tr></tbody></table>

formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Instrucciones químicas han sido investigados para su uso en numerosas aplicaciones de biomateriales, incluyendo la administración de fármacos, la ingeniería de tejidos, y cultivo celular. En particular, las reacciones de click-mediada luz, tales como reacciones tiol-eno y tiol-ino fotoiniciadas, permitir el control espacio-temporal sobre las propiedades del material y permitir el diseño de sistemas con un alto grado de control de la propiedad dirigida por los usuarios. Fabricación y modificación de biomateriales a base de hidrogel utilizando la precisión proporcionada por la luz y la versatilidad que ofrece estas químicas tiol-X Photoclick son de interés creciente, en particular para el cultivo de células dentro, microambientes biomiméticos bien definidos. A continuación, se describen los métodos para la photoencapsulation de las células y la posterior photopatterning de señales bioquímicas dentro de matrices de hidrogel utilizando bloques de construcción modulares y versátiles polimerizados por una reacción Photoclick tiol-eno. Específicamente, un enfoque se presenta para constructing hidrogeles de aliloxicarbonilo (Alloc) reticulaciones de péptidos -functionalized y restos peptídicos colgantes y poli tiol funcionalizado (etilenglicol) (PEG) que se polimerizan rápidamente en presencia de fotoiniciador acylphosphinate litio y dosis citocompatible de larga longitud de onda ultravioleta (UV). técnicas fáciles de visualizar y cuantificar photopatterning la concentración de péptidos añadidos se describen. Además, se establecen métodos para las células de encapsulación, específicamente las células madre mesenquimatosas humanas, y la determinación de su viabilidad y actividad. Mientras que la formación y el patrón inicial de hidrogeles tiol-Alloc se muestran aquí, estas técnicas se pueden aplicar ampliamente a una serie de sistemas de materiales otra luz y radical iniciados (por ejemplo, tiol-norborneno, tiol-acrilato) para generar sustratos estampados.

La configuración y el procedimiento para photoencapsulate células y geles posteriormente photopattern que contienen células encapsuladas se representa en la Figura 1, y un ejemplo para la preparación de soluciones madre para formar un% de gel de 10 en peso se proporciona en la Tabla 1. Usando la Tabla 1, la cantidad de monómeros (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) y fotoiniciador (LAP) que se requieren para polimerizar hidrogeles se calcula. Sobre la base de estos cálculos, las soluciones madre de PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, y LAP se preparan y se mezclan con y sin Pep1Alloc para formar y photopatterning geles, respectivamente (Figura 1A). Posteriormente, las células se recogen de placas, se contaron, y se centrifugaron en cantidades adecuadas para la encapsulación (Figura 1B). El sedimento celular se resuspendió en la solución gelificante de (péptido / polímero / LAP en PBS), y mezclas de células / monómero se transfieren al vidrio o jeringa molds. Las células se encapsulan dentro del hidrogel después de la aplicación de la luz (1-5 minutos de 10 mW / cm 2 a 365 nm) (Figura 1C). Para photopatterning (Figura 1D), los geles se empaparon con Pep1Alloc y LAP durante 30 min a 1 hr y 30 min, lo que permite la difusión del péptido y el iniciador en la matriz polimerizada. Estos geles de péptidos cargados se cubren con fotomáscaras con patrones deseados y se expusieron a una segunda dosis de la luz (1 min) para conjugar los péptidos a tioles libres dentro de la matriz. Correas de suspensión sólo se une covalentemente al gel en las regiones expuestas a la luz, lo que facilita las interacciones célula-matriz adecuados y que imitan las propiedades mecánicas y bioquímicas clave del microambiente celular nativo hacia sondeo función de las células y el destino in vitro. ensayo de Ellman proporciona un método fácil y barato para cuantificar la modificación gel y la incorporación de péptidos dentro de photopatterned sustratos. Estampadas y geles sin patrón (es decir, geles con o sin modificación péptido) se sumergen en tampón de reacción post-polimerización de Ellman. A continuación, las normas de cisteína y los geles empapados en tampón se colocan en placas de 48 pocillos y se incubaron con reactivo de Ellman (Figura 2A, izquierda). Después de 1 hora y 30 minutos, partes alícuotas de muestras se colocan en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos, y la absorbancia se registra a 405 nm. Una curva de calibración (Figura 2A, derecha) de las normas de cisteína se representa (absorbancia frente a la concentración, ajuste lineal), y la cantidad de tioles libres en geles puede ser determinado en base a su factor de dilución. Estas concentraciones tiol libres para diferentes condiciones de polimerización y photopatterning de un gel de 10% en peso se muestran en la Figura 2B. Los geles polimerizados para 1 o 5 min sin Pep1Alloc (azul bares, I = 1 min y II = 5 min) tienen concentraciones de tiol libres estadísticamente similares, indicando tsombrero de una reacción rápida se produce la gelificación y se completa en 1 min (prueba t de dos colas, p&gt; 0,05). Por lo tanto, la exposición adicional a la luz (2-5 minutos) no se traduce en una mayor conversión de los grupos funcionales. Los geles polimerizados por 1 min sin Pep1Alloc se empaparon con Pep1Alloc (3 mg / ml) y LAP (2,2 mM) durante 30 y 90 min (barras verdes, II = 30 min y IV = 90 min) y se expusieron a una segunda dosis de luz para 1 min. La disminución de los tioles libres (60 a 80% con respecto a la condición 1 min) indica la modificación eficiente de los geles con señales colgante en estas condiciones. Si se desea una mayor modificación, aumento de las concentraciones de solución Pep1Alloc se pueden utilizar como la accesibilidad de Pep1Alloc a tioles libres en soluciones más diluidas de péptidos pueden limitar la conversión; por ejemplo, se ha encontrado que concentraciones de hasta 20 mg / ml Pep1Alloc producen&gt; 90% de conversión de tioles libres. Excepcionalmente, los patrones de péptidos añadidos para el hidrogel puedeobtener imágenes rápidamente con el reactivo de Ellman (Figura 3A, en 5 min). Sin embargo, la visualización del patrón se pierde con el tiempo (mayor de 5 min) debido a la difusión del amarillo TNB 2- dianión a través del gel. Para mejorar la resolución de imagen y observar los patrones en tres dimensiones (x, y, y z-planos) y en presencia de las células, la adición de péptido fluorescente (AF488Pep1Alloc) se puede utilizar. En la Figura 3B x, y, z proyecciones de pilas de imágenes tomadas con un microscopio confocal se muestran, lo que demuestra el patrón de resolución (escala de micras). Aproximadamente (94 ± 2)% y (94 ± 1)% de hMSCs encapsulados dentro de geles degradables (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) se mantienen (cuerpos celulares verdes) viables 1 y 6 días después de la encapsulación, respectivamente, con pocas células muertas (núcleos rojos ) observado (Figura 4A). Además, se observa hMSC propagando a 6 días después de la encapsulación ( <st<html> rong&gt; Figura 4A, recuadro), lo que indica que las células pueden remodelar e interactuar con estas matrices MMP-degradables modificados con RGDS de unión a integrinas. Los ensayos de actividad metabólicos realizados sobre células encapsuladas en geles no degradables (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 y 3 días después de la encapsulación (Figura 4B) proporcionar una segunda medida de la viabilidad celular y demuestran que las células permanecen activas durante las diversas condiciones photoencapsulation y photopatterning probados con ensayo de Ellman (Figura 2B). En particular, no hay ninguna diferencia significativa en la actividad metabólica entre 30 min y 90 min incubaciones con Pep1Alloc + LAP (condiciones III y IV) y la encapsulación inicial (condiciones I y II), que indica que el procedimiento es apropiado para aplicaciones de photopatterning en la presencia de células encapsuladas (t-test, p&gt; 0,05 de dos colas). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Configuración para encapsular las células dentro de los hidrogeles y posteriormente photopatterning con señal bioquímica (A) Las soluciones madre de macrómeros y fotoiniciador se preparan y se mezcla (PEG4SH = espina dorsal, Pep2Alloc = reticulación, Pep1Alloc = pendiente del resto de adhesivo (MFG), LAP = fotoiniciador ). (B) Las células se recogieron para la encapsulación. (C) Las células se mezclan con soluciones de macrómero sin o con péptidos de unión a integrinas (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP o PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, respectivamente) y se encapsulan después de la exposición a la luz. (D) Los geles que contienen grupos tiol en exceso durante la formación de gel (en este caso, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, formado con 2 mM exceso de tiol) puede tener un patrón con señales bioquímicas por la posterior adición de péptidos funcionalizadas con un solo grupo alloc (Pep1Alloc, por ejemplo, RGDS, IKVAV, etc.) para promover la adhesión celulardentro de regiones específicas del gel. A continuación, se muestra el patrón de geles con MFG con fluorescencia marcado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Figura 2:. Configuración y resultados del ensayo cuantitativo de Ellman para evaluar la modificación de hidrogeles estampadas Gels (A) y las normas de cisteína se incuban en placas de 48 pocillos con reactivo de Ellman. Una curva estándar lineal se representa para determinar la concentración de cisteína en las muestras de gel. (B) El exceso de tioles libres se incorporan dentro de los hidrogeles durante la formación de gel y se consumen en el patrón con un colgante alloc-péptido (min polimerización I = 1; II = 5 min de polimerización; III = 30 min de incubación con Pep1Alloc; IV = 90 min de incubación wi<html> º Pep1Alloc; tanto III y IV polimerizan y se modela con la luz durante 1 min). Los datos mostrados ilustran la media (n = 3) con barras de error muestran el error estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Figura 3:. Ensayo de Ellman y las imágenes fluorescentes para visualizar hidrogeles photopatterned reactivo (A) de Ellman se puede usar para detectar rápidamente los patrones (líneas) en las direcciones x y y-planos (amarillo = región sin patrón, barra de escala = 1 mm). (B) péptidos fluorescentes se pueden usar para observar los patrones en los ejes X, Y y Z. planos (verde = región modelada; 200 Barra de escala m; 10X objetivo de inmersión en agua; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Figura 4: Viabilidad y actividad metabólica de las células dentro de los hidrogeles photopatterned no degradables (A) Ejemplo confocal z-pila (z-proyección; 10X objetivo de inmersión en agua) de viables (verde; Ex / Em 488/525 nm) y muertos hMSCs (rojo; Ex / Em 543/580 nm) encapsulado dentro de los hidrogeles de 24 horas después de la encapsulación (barra de escala = 200 micras). Las células se extienden dentro de estos hidrogeles 6 días después (imagen de la inserción, Barra de escala = 50 micras) en la encapsulación. (B) Las células son metabólicamente activas 1 y 3 días (barras claras y oscuras, respectivamente) después de la encapsulación para los distintos polimerización (polimerización I = 1 min; II = 5 min de polimerización) y las condiciones de modelado (III = 30 min de incubación con Pep1Alloc ; IV = 90 min incubation con Pep1Alloc; tanto polimerizado y modelado con luz durante 1 min). Los datos mostrados ilustran la media (n = 3) con barras de error muestran el error estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tabla 1: Ejemplo de configuración para calcular los volúmenes de las soluciones madre para la fabricación de hidrogeles Las células dentro de la hoja de cálculo que se puso de relieve en azul indican los parámetros definidos por el usuario;. las otras cantidades se calculan sobre la base de estos valores. Los volúmenes finales de cada solución madre para hacer un gel de color naranja se resaltan. Los glóbulos blancos contienen las fórmulas utilizadas para calcular los volúmenes finales sobre la base de los parámetros definidos por el usuario. Tenga en cuenta que una concentración de 2,2 mM LAP es equivalente a 0,067% en peso.

Describimos un proceso secuencial para la formación mediada por luz y el posterior modelado bioquímico de matrices de hidrogel sintético para aplicaciones de cultivo celular tridimensional. Se demuestra la construcción y modificación de hidrogeles con química fotoclic citocompatible. Además, se presentan técnicas sencillas para cuantificar y observar patrones y determinar la viabilidad celular dentro de estos hidrogeles.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

El objetivo general de este procedimiento es formar, diseñar y encapsular células dentro de matrices extracelulares sintéticas basadas en polímeros. Este método puede utilizarse para abordar preguntas biológicas fundamentales relacionadas con la identificación de señales extracelulares que regulan las respuestas celulares dentro de microentornos heterogéneos. La principal ventaja de esta técnica es que se genera una matriz sintética robusta para el encapsulamiento y cultivo celular mediante protocolos y materiales accesibles.Este método puede utilizarse para el cultivo celular controlado y para estudiar la respuesta celular in vitro. Puede aplicarse a otros sistemas, incluyendo la administración de fármacos e ingeniería de tejidos. Prepare los materiales para la formación del hidrogel según se describe en el protocolo del texto.Coloque una lente colimadora en el extremo de la guía de luz llena de líquido para garantizar una intensidad de luz relativamente uniforme en todas las muestras. Ajuste la distancia entre la guía de luz y las muestras para lograr un tamaño de haz que cubra las muestras de interés. Para elaborar hidrogeles no patrones, prepare hidrogeles gruesos moldeados en puntas de jeringa pipeteando de 10 a 20 microlitros de la solución precursora del gel en la punta de una jeringa estéril cortada.Prepare un gel individual por jeringa de manera que tenga aproximadamente de 0,5 a 1,5 milímetros de grosor, según el volumen y el diámetro de la jeringa. Prepare hidrogeles delgados en moldes de portaobjetos de vidrio colocando la junta de goma alrededor de los bordes del portaobjetos de vidrio no recubierto. A continuación, pipetee de cinco a diez microlitros de la solución precursora del gel sobre el portaobjetos de vidrio no recubierto.Y coloque la portaobjetos recubierta con antiadherente encima de la solución de gel. Sujete las portaobjetos con clips pequeños para fijarlas. Ajuste la intensidad de la lámpara para alcanzar 10 milivatios por centímetro cuadrado en la superficie del gel para moldes de punta de jeringa o moldes de portaobjetos.Utilice un radiómetro para detectar la intensidad. Coloque los moldes bajo la lámpara. Aplique luz durante uno a cinco minutos para permitir la polimerización completa de los geles.Utilice un tiempo de polimerización más corto para geles con mayor contenido de tereftalato de polietileno, y un tiempo más largo para geles con menor contenido, a fin de producir geles hidrofóbicos completamente polimerizados con módulos dentro del rango de los tejidos blandos. Coloque los geles de los moldes de la punta de la jeringa en una placa estéril de 48 pocillos sin tratamiento y coloque las láminas de vidrio en un recipiente estéril.Para preparar hidrogeles con patrón, prepare la solución precursora según se describe en el protocolo escrito y pipetee vigorosamente la solución para asegurar una mezcla homogénea. A continuación, cubra los geles preformados con péptido de pentón con una solución de fotoiniciador de fosfato de litio e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Tras la incubación, elimine la solución en exceso.Si los geles se moldean en la punta de una jeringa, utilice una espátula para transferirlos cuidadosamente desde la placa de 48 pocillos hasta un portaobjetos de vidrio estéril para el grabado. Coloque una máscara fotográfica con el patrón deseado directamente encima de los geles moldeados en la jeringa y el portaobjetos. Asegúrese de que la parte impresa de la máscara toque el gel para obtener una fidelidad óptima del patrón.Coloque las muestras bajo la lámpara e irradie durante un minuto. Después del moldeado, coloque los geles moldeados con jeringa en una placa estéril de 48 pocillos no tratada para cultivo de tejidos. Coloque los geles moldeados sobre portaobjetos que están adheridos a los portaobjetos en un recipiente estéril.Lave tres veces, durante 15 minutos con medio de cultivo o el tampón apropiado según los experimentos planeados. Para realizar la detección y cuantificación de tiolos libres en hidrogeles fotopatrón, primero prepare las soluciones y realice los cálculos según se describe en el protocolo escrito. Forme hidrogeles delgados para el patrón como antes.En concreto, prepare geles con exceso de tiolos libres y patronee la mitad de estas muestras con el péptido pentónico utilizando una laminilla transparente para exponer completamente todo el gel a la luz. Coloque los geles patroneados y no patroneados en pocillos de una placa de 48 pocillos. Lave durante 15 minutos, tres veces, con tampón de reacción de Ellman, para permitir la difusión de las especies reaccionadas fuera del gel y que ocurra la hinchazón en equilibrio.Agregue buffer adicional de la reacción de Ellman a los geles de lavado, de modo que el volumen del gel hinchado con el buffer de reacción sea un múltiplo de 20 microlitros. Por ejemplo, si el volumen predicho del gel hinchado es de 15 microlitros, agregue cinco microlitros de buffer de reacción. Y si el volumen predicho del gel hinchado es de 30 microlitros, agregue 10 microlitros de buffer de reacción.Coloque por pipeta los estándares de cistina en pozos individuales de una placa de 48 pozos en múltiplos de 20 microlitros. La cantidad depende del volumen utilizado en el paso anterior. Por ejemplo, si en el paso anterior el volumen del gel hinchado, más tampón de reacción adicional, fue igual a 40 microlitros, agregue 40 microlitros de cada estándar a pozos vacíos individuales.A continuación, diluya el reactivo de Ellman y el tampón de reacción. Añada el reactivo de Ellman diluido a los pocillos que contienen los patrones y las muestras. Para muestras de 20 microlitros, añada 183,6 microlitros de solución a cada pocillo.Incube o coloque en agitación durante una hora y treinta minutos, o hasta que el color de la solución coincida con el color de los geles mediante inspección visual, para asegurar una difusión suficiente del dianión amarillo 2-Nitro-5-tiobenzoico, que se genera tras la reacción del reactivo de Ellman con tiolos libres del gel. Tome 100 microlitros de solución de las muestras y los patrones y colóquelos en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Lea la absorbancia a 405 nanómetros en un lector de placas.Para visualizar los patrones fotográficos, retire el exceso de tampón de reacción limpiando suavemente los bordes del hidrogel con un tejido. Aplique el reactivo de Ellman directamente sobre la superficie del gel. Inmediatamente, obtenga imágenes en un microscopio óptico a 10x o en un microscopio estereoscópico con una cámara de color.Recoger las células y prepararlas para la encapsulación según se describe en el protocolo escrito. Inmediatamente después de aspirar el PBS, suspender las células sedimentadas en la solución precursora hasta una concentración final de cinco mil células por microlitro. Dejar una concentración adecuada de tiolos libres para su posterior reacción con el péptido pentónico.Si se desea el estampado por luz. Moldee, polimerice y estampe los hidrogeles como antes. Enjuague los geles durante 10 minutos, tres veces, en medio de crecimiento después del estampado para eliminar especies no reaccionadas y exceso de fotoiniciador de fosfato de litio.Incube los geles en medio de crecimiento a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2 hasta el punto de tiempo deseado para análisis posteriores. Renovar el medio cada 48 horas, o según lo determine la aplicación. Para determinar la viabilidad de las células encapsuladas, primero retire el medio de crecimiento de los geles y enjuague durante 15 minutos, tres veces, con PBS para permitir la difusión del medio desde los geles.Añada dos microlitros de la solución descongelada de etidio homodímero-1 a dos milimolares y 0,5 microlitros de la solución descongelada de AN de calcio a cuatro milimolares a un mililitro de PBS estéril. Vortexee para asegurar una mezcla completa. Añada 300 microlitros de la solución a cada molde de jeringa con gel en las placas de 48 pocillos, o la cantidad suficiente para cubrir la superficie del gel sobre una laminilla de vidrio en un recipiente estéril.Y incubar durante 45 minutos. Eliminar la solución sobrenadante y enjuagar para eliminar el exceso de colorante de los geles. Observar las células en un microscopio confocal.O en un microscopio de epifluorescencia con capacidad de 10x. Y excitación a 488 nanómetros y emisión a 525 nanómetros. La concentración de tiol libre de hidrogeles no patroneados y patroneados cuantificada con el reactivo de Ellman demostró que los hidrogeles polimerizados inicialmente durante un minuto y durante cinco minutos tienen concentraciones de tiol libre estadísticamente similares, lo que indica una reacción rápida y una gelificación completa dentro del primer minuto.Los geles incubados con péptidos de pentón durante 30 minutos, y durante una hora y 30 minutos, presentan una reducción del 60 al 80 por ciento en la concentración de tiol libre, lo que indica una modificación eficiente del tiol en exceso. Los patrones por fotolitografía, formados al hacer pasar luz a través de muestras cubiertas con máscaras, impresas aquí con líneas, pueden observarse en dos dimensiones mediante la aplicación del reactivo de Ellman. O bien, en tres dimensiones mediante la incorporación de péptidos fluorescentes en imágenes posteriores.Se trataron células madre humanas adultas encapsuladas dentro de hidrogeles con coloraciones para viabilidad y hidrotoxicidad. Y se imagaron mediante microscopía confocal. Las células viables sin daño en la membrana se etiquetan en verde e indican la supervivencia de las células un día después del encapsulamiento.Las células comienzan a extenderse dentro de la matriz seis días después de la encapsulación. Como se muestra en la imagen inserta. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener procedimientos de manipulación estériles y cuidadosos para prevenir daños a las células después de la encapsulación mediante la introducción de contaminantes o cizallamiento mecánico.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como citometría de flujo con inmunotinción y expresión génica para estudiar la función y el destino celular en respuesta al entorno extracelular. Esta técnica allana el camino para que investigadores en los campos de la biología, la bioingeniería y la medicina estudien la erosión de regiones de tejido o la progresión de enfermedades en matrices extracelulares sintéticas con control de propiedades definido por el usuario, orientándose hacia el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encapsular células y diseñar matrices blandas para estudios de cultivo celular controlado.

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