Name: Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda la microinyección citoplasmática asistida por láser en cigotos de ganado para biotecnología animal. Este método permite entregar herramientas de edición del genoma como CRISPR-Cas9 de forma eficiente y confiable.

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El trabajo relacionado con esta técnica está respaldado por los proyectos HD070044 NIH/NICHD RO1 y USDA/NIFA Hatch W-3171 y W-2112.

1. Producción Micropipeta <ol><li> micropipeta de inyección <ol><li> Colocar un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro externo (OD): 1,0 mm, diámetro interior (ID): 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearla. </li><li> Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga Tapper. (Ejemplo: Calor: 825; Tire: 30; Velocidad: 120; Tiempo: 200; Presión: 500). </li><li> Retirar con cuidado las pipetas tirados desde el dispositivo y colocarlo en un microforge en una posición horizontal. </li><li> Llevar la pipeta accionada y el filamento calefactor microforge con su cuenta de vidrio en el foco. Utilice la retícula ocular para medir el espesor deseado y mover la pipeta horizontalmente hasta que el filamento calentador alcanza el diámetro interior de destino (5 micras). </li><li> Ajustar el calor a aproximadamente 45% y llevar suavemente la pipeta hacia abajo de manera que toque el filamento. Activar el calentador brevemente. esta wenfermo ligeramente fundir la pipeta por lo que se adhiere al filamento y tras el enfriamiento, la pipeta se romperá en el punto de contacto la generación de un corte recto. Nota: Ajuste de la temperatura adecuada es clave en este paso ya que las temperaturas demasiado altas harán que la curva de la pipeta y por lo tanto un corte recto no serán posibles y las temperaturas demasiado bajas no serán suficientes para fundir la pipeta (Figura 1A). </li><li> Hacer un aproximado ángulo de 30 °, cerca de la punta de la pipeta al colocarla cerca de 10 m de distancia del filamento calefactor. Ajuste la temperatura a 60% y activar el calentador. Nota: Esto doblar la pipeta sobre el filamento. Se desea Este ángulo de modo que la punta de la aguja es paralela a la superficie de la placa de inyección cuando está montado en el inyector (Figura 1B). </li><li> Manejar pipetas de microinyección con precaución, ya que son muy afiladas y frágil. </li></ol></li><li> sosteniendo micropipeta <ol><li> Coloque una borosiliccomió capilar de vidrio (diámetro exterior: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearlo. </li><li> Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga incluso estrecharse y paredes paralelas (Ejemplo: Calor: 815; Tire: 20; Velocidad: 140; Tiempo: 175; Presión: 200). </li><li> Retirar con cuidado la pipeta retirado del dispositivo extractor y colocarlo en el soporte microforge en una posición horizontal. Ajuste el enfoque en el filamento calefactor y pipeta. </li><li> Utilice la retícula ocular para medir el diámetro de la pipeta y mover la pipeta hasta que su diámetro por encima del filamento llega a 180 micras. </li><li> En el tamaño indicado, marcar el capilar de vidrio con una pluma de punta de diamante, y luego presione suavemente en la punta tirado para romper el vidrio. Esto debe resultar en un corte recto (Figura 1C). </li><li> Mover la pipeta a una posición vertical con su punta cerca del filamento. Ajuste la temperatura<html> de la microforge a 60%. </li><li> Fuego esmalte de la punta de la pipeta usando técnicas estándar 7 hasta que alcanza una ID de 40 micras. Utilice la retícula ocular para comprobar el ID (Figura 1D). </li><li> Hacer un ángulo de la pipeta. <ol><li> Llevar la pipeta de vuelta a una posición horizontal sobre 10 m de distancia del filamento y 5 mm de distancia de la punta. Ajustar la temperatura a aproximadamente 60% y activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se alcanza un ángulo deseado (de alrededor de 30 o). Compruebe el ángulo visual (Figura 1E). Nota: La pipeta se monta generalmente a la microinyector en un ángulo aproximado de 60 o con respecto a la parte inferior de la placa de inyección. La punta de la pipeta se dobla de modo que es paralelo al fondo de la placa, que es necesaria para la inyección correcta del embrión en su plano medio. </li></ol></li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 2. Configuración Micromanipulador <ol><li> Compruebe que los microinyectores están completamente cargados con aceite y que no haya burbujas de aire en el sistema (burbujas en el microinyector impiden un control preciso de la inyección). </li><li> Compruebe que los micromanipulador están en la posición central. Esto permitirá una amplia gama de movimiento de las pipetas. </li><li> Inserte la pipeta en el soporte que sostiene micromanipulador izquierda y la pipeta de inyección en el soporte de micromanipulación derecha. </li><li> Deje que el aceite entre en las pipetas por capilaridad y comprobar que el sistema está funcionando correctamente moviendo el petróleo hacia arriba y abajo dentro de la pipeta usando los controles microinyector. Nota: Si no hay circulación de aceite en el interior de las agujas, puede haber una obstrucción. En este caso, utilice una aguja nueva. </li><li> Utilice los controles micromanipulador para traer las pipetas en el centro del campo de visión del microscopio. El uso de magnificación 4X, comprobar que las puntas de micropipeta están en el ángulo correcto (pan paralelo a la parte inferior del plato). Nota: Una configuración correcta de las agujas es clave para una inyección de éxito y los resultados consistencia. </li><li> Calibrar el sistema láser siguiente manual de calibración del fabricante. </li></ol> 3. Preparación de plato de la inyección (Figura 2) <ol><li> Coloque una gota 50 l de calentado (37 ° C) SOF-HEPES (composición se detalla en la sección de materiales) suplementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS) en el centro de la tapa de un 100 mm placa de Petri. Colocar un 1 - drop l 2 de la solución a inyectar cerca de la caída de la inyección. Asegúrese de que los embriones no se enfría por debajo de la temperatura ambiente. Nota: En este protocolo vamos a añadir el colorante rojo-dextrano a la solución de inyección para poder visualizar el sitio de la inyección y hacer un seguimiento posterior. </li><li> Cubrir las gotas en la placa de inyección utilizando aproximadamente 10 ml de aceite mineral. </li><li> Coloque el plato de inyección en la platina del microscopio invertido y llevar el PIPETTES en la gota de inyección. Compruebe que las agujas están en foco dentro de la gota. Ajustar su altura, según sea necesario utilizando los controles micromanipulador. </li><li> El uso de un microdispensador, cargar sobre 20-30 cigotos (17 a 20 horas después de la fecundación (HPF)) en el lado superior de la caída de la inyección. Realizar inyección a temperatura ambiente por lo que el número de embriones en la caída de la inyección se determina por la velocidad a la que la persona puede inyectar ellos. No cargue más embriones que los que se pueden inyectar en 30 min. <ol><li> Para cargar los embriones en el microdispensador, presione el émbolo completamente y sumerja la punta en la solución que contiene los embriones. Tocar los embriones para ser recogidos con la punta del capilar de vidrio (uno a la vez) y liberan lentamente el émbolo para cada embrión entra en el capilar. Repita esto hasta que todos los embriones son recogidos o la capacidad microdispensador está llena. </li><li> Para liberar los embriones cargados, presione el émbolo suavemente hasta que todo el volumen de containing los embriones se libera del capilar. </li></ol></li></ol> 4. La microinyección <ol><li> Usando el objetivo 4X, cargar la solución que se inyecta en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa (aspiración). Cargar solución suficiente para inyectar 2 - 3 cigotos. A continuación, pasar a la caída de la inyección. </li><li> Dentro de la caída de la inyección, mover la pipeta que sostiene que la punta se acerca a un cigoto. Aplicar presión negativa (aspirado) con el microinyector de retención por lo que el cigoto se fija a la pipeta de sujeción y el cambio a un objetivo de 20X. </li><li> Una vez que el cigoto se une a la pipeta de sujeción, comprobar su calidad usando la pipeta de inyección para mover suavemente el embrión alrededor sin separarlo. Un cigoto buena calidad debe tener los dos cuerpos polares (aunque a veces solamente se ve) y un citoplasma homogéneo. No se inyecte cigotos anormales (Figura 3A). </li><li> Si es necesario, vuelva a colocar el embrión para una inyección adecuadaubicación. Un buen posicionamiento sería aquel en el que hay algo de espacio entre la ZP y la PM, por lo que la PM no se dañe por el láser. </li><li> Compruebe que la pipeta de inyección se coloca en plano medio del embrión tocando con suavidad el cigoto en el sitio de la inyección. Si no está en su plano medio, la aguja tenderá a hacer girar el embrión en lugar de la punción. Ajuste la altura de la pipeta de inyección según sea necesario. </li><li> Hacer un agujero en la ZP utilizando un láser (Figura 3B). <ol><li> El uso de software lugar del láser el retículo láser en el ZP donde se hará el agujero (en el lado opuesto a donde el embrión está unido a la pipeta de sujeción). Uso de la ventana de control del láser, haga clic en el botón de disparo. Asegúrese de que el tamaño del agujero es lo suficientemente grande para crear una abertura en la ZP para la aguja de pasar a través sin dañar el PM (Ejemplo: 0,662 mseg de ancho de impulso / 6,9 m Tamaño del agujero). </li></ol></li><li> Pasar la aguja de inyeccióna través del agujero en la ZP y hacer contacto con la PM. Continúe empujando la pipeta hacia adelante hasta que la aguja es ¾ de la forma en el embrión (Figura 3C). </li><li> Observe la posición del menisco en la interfase solución de aceite, ya que esto puede utilizar para controlar constantemente el volumen de inyección. </li><li> Aplicar presión negativa (aspirado) en la pipeta de inyección, lo que resultará en PM y el citoplasma se aspiran en la aguja de inyección. Continuar hasta que el movimiento de citoplasma en la aguja acelera o cuando el contenido de citoplasma mezclar con una solución de inyección puede ser visto. Estos indicarán la rotura de la PM (Figura 3D). </li><li> Inyectar de nuevo el contenido citoplasmático, seguido de la solución en el citoplasma del cigoto mediante la aplicación de presión positiva (inyección), hasta que el menisco en la interfase solución de aceite ha avanzado diámetro equivalente de un cigoto pasado el punto de partida. Nota: Bajo nuestras condiciones, esto representa aproximadamente 7 pl de solución inyectada (Figura 3E). </li><li> Cambio a un objetivo 4X y mover el inyectado embrión / s para el lado inferior de la caída de la inyección. Liberar el embrión mediante la aplicación de presión positiva en el microinyector explotación. Mantener los embriones no inyectados en el lado superior y los inyectados que están en el lado inferior de la gota para ayudar a mantener un registro de los embriones inyectados / no-inyectada y trabajar de manera eficiente. </li></ol> 5. Recuperación de embriones y la inyección Resultados <ol><li> Haga 3 gotas de aproximadamente 200 l en un nuevo plato con pre-calentado SOF-HEPES. Recoger los embriones inyectados usando un microdispensador (como se describe más arriba). Lavar los embriones inyectados moviéndolos a través de la SOF 3-HEPES gotas. </li><li> Contar los embriones lisadas durante la microinyección y desecharlos. Nota: Un cigoto se lisaron puede distinguirse fácilmente de uno intacto desde el primero aparece translúcida, llene toda la ZP, y por lo general tiene citoplasmáticacontenido de fugas hacia el exterior del embrión. </li><li> Opcionalmente, comprobar la eficacia de microinyección usando un microscopio de fluorescencia. Tenga en cuenta que la exposición a la luz UV puede provocar daños de embriones que pueden afectar el desarrollo posterior. </li><li> Grupos de cultivo de 25 embriones inyectados en 50 gotas l de medio de optimización simplex de potasio (KSOM) suplementado con 4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) bajo aceite mineral en 38,5 ° C, 5% de CO2 en aire, y humedad de saturación. </li><li> Complementar los medios de cultivo con 5% de SFB dos días después de la inyección. </li><li> Compruebe blastocisto (BL) las tasas de 7 días después de la inyección. Calcular las tasas de BL como el número total de embriones de blastocisto / número total de embriones cultivados en esa gota. </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li>
<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
<li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR%2FCas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li>
<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pipette+Cookbook+2015+P-97+%26+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instrument. 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf</a> (2015).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf">www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf</a> (2014).</li>
<li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCibelli%2C+JB+%22Principles+of+cloning%22">Principles of cloning</a>. , Academic Press. (2002).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La microinyección de cigotos es un método bien establecido para la introducción de soluciones en embriones de mamíferos. Con algunas variaciones dependientes de la especie y el objetivo del experimento, esta técnica se puede utilizar ampliamente. Mostramos cómo realizar la microinyección intracitoplasmática de usar un láser para ayudar a la entrada de una micropipeta de extremos romos. Los cigotos de algunas especies de ganado (tales como ganado vacuno, ovejas y cerdos) tienen un citoplasma oscuro, dificultando la visua...

microinyección citoplasmática de embriones de 1 célula es una técnica muy poderosa. Puede ser utilizado para la entrega de cualquier solución en el embrión, por ejemplo, producir genes knock-outs para estudiar la función de genes o de genes para generar animales editado. Cigotos de animales de granja agrícolas más relevantes tienen una composición de ácidos grasos muy alto que hace que su citoplasma opacos y oscuros 1. También tienen una membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características hacen que la microinyección pronuclear mediante inyección convencional / citoplasmática como se utiliza en especies de roedores difíciles y, a menudo inexactos. Microinyección citoplasmática tiene ventajas sobre la microinyección pronuclear, ya que es más fácil de realizar y también causa menos daño a los embriones inyectados, resultando en una mayor viabilidad 2. El objetivo general de este protocolo es demostrar un método exitoso para la entrega de soluciones en el citoplasma de cigotos de animales de granja. Para ser capaz de realizarmicroinyección citoplásmica con una alta eficiencia en embriones de ganado, se utiliza un láser para generar un agujero en la zona pelúcida (ZP) y luego una aguja de vidrio de extremo romo se utiliza para la microinyección. Esta estrategia tiene como objetivo reducir el daño mecánico impreso en el embrión durante la inyección. Entonces, la aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja de inyección permite la rotura eficiente y seguro de la PM asegurar que la solución se suministra en el citoplasma del embrión. Esta técnica ya se ha utilizado con éxito en los embriones de bovino para entregar siRNA en el citoplasma cigóticos 3,4 y para generar mutaciones utilizando las repeticiones agrupadas espaciadas regularmente cortos palindrómicas (CRISPR) / sistema CRISPR asociado 9 sistema 5 (Cas9). También es adecuado (con modificaciones menores) para inyectar la especie bovina ovocitos cumulus-cerrado 6. A continuación, describimos nuestro protocolo de inyección entrega de un medio de contraste, que puede ser aplicable a inyectar cualquier dessolución IRED en el zigoto, y muestran que el uso de esta técnica provoca la lisis mínima y no afecta el desarrollo embrionario temprano.

<table><tbody><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Estos capilares se utilizan para fabricar las pipetas de sujeción e inyección. Se puede utilizar cualquier tubo de borosilicato de pared gruesa/estándar sin filamento.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipado con lente de aumento de 10X.</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipado con lentes 4X, 20X y con un sistema láser.</td></tr><tr><td>Instrumentos</td> de <td>investigación</td> láser <td>7-47-500</td><td>Saturno 5 Láser activo.</td></tr><tr><td>Microdispensador</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>El microdosificador se utiliza para mover los embriones. También se puede utilizar una pipeta p10 pero cargando el mínimo volumen posible.</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 100 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Utilice la tapa del plato para hacer la placa de inyección, ya que tienen paredes más bajas y facilitarán el posicionamiento y movimiento del micromanipulador. También se puede utilizar la tapa de una placa de cultivo de 60 mm.</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Estas placas se utilizan para cultivar los embriones en 50 &mu; l gotas cubiertas con aceite mineral. Alternativamente, también se puede usar un plato de 4 pocillos. Independientemente de la placa elegida para cultivar los embriones, siempre deben equilibrarse en la incubadora durante al menos 4 horas antes de transferirles los embriones.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Cualquier incubadora que se pueda configurar a 38.5 &deg; C, se pueden utilizar condiciones de CO2 de CO.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Se utiliza para visualizar los embriones en las gotas de cultivo y durante los lavados. Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico con un aumento de 10X.</td></tr><tr><td>Unidad de control HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Sistema de calefacción acoplado al microscopio estereoscópico.</td></tr><tr><td>Plato de microscopio calefactado</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Sistema de calefacción acoplado al microscopio estereoscópico.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>Se utiliza una solución estéril de 10 mg/ml para inyectar.</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Mantenga el aceite mineral a temperatura ambiente y protéjalo de la luz con papel de aluminio.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Suplementado con 4 mg/ml de BSA. Las placas KSOM para el cultivo de embriones deben equilibrarse en una incubadora durante al menos 4 horas antes de su uso.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Utilice un FBS calificado para células madre.</td></tr><tr><td>Cigotos</td><td>Los cigotos se inyectan de 17 a 20 hpf y pueden derivarse in vitro- o in-vivo.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Concentración final: 107,7 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Concentración final: 7.16 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Concentración final: 1,19 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Concentración final: 0,49 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>DL-lactato de sodio</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Concentración final: 5,3 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Concentración final: 1.71 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>D-(&menos;)-Fructosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Concentración final: 0,5 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Concentración final: 21 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Concentración final: 1x. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Concentración final: 1x. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761 Concentración</td><td>final: 4 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Concentración final: 0,33 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Concentración final: 1 mM. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Concentración final: 1 mg/ml. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Concentración final: 5 &mu; g/ml. Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Agua para transferencia embrionaria</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Componente del medio SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Medio SOF-HEPES</td><td>Hecho en el laboratorio</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &plusmn; 10 mOs. Filtro esterilizado a través de un 22 &mu; El filtro M se puede almacenar en la nevera a 4 ° C. C durante 1 mes. Cálido en 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr></tbody></table>

asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

La microinyección citoplasmática en embriones unicelulares es una técnica muy potente. Por ejemplo, permite la entrega de herramientas de edición del genoma que pueden crear modificaciones genéticas que estarán presentes en cada célula de un organismo adulto. También se puede utilizar para administrar siRNA, mRNAs o anticuerpos bloqueantes para estudiar la función génica en embriones preimplantacionales. La técnica convencional de microinyección de embriones utilizada en roedores consiste en una micropipeta muy fina que penetra directamente en la membrana plasmática cuando se introduce en el embrión. Cuando esta técnica se aplica a los animales de ganado, generalmente resulta en una baja eficiencia. Esto se debe principalmente a que, a diferencia de los ratones y las ratas, los cigotos bovinos, ovinos y porcinos tienen un citoplasma muy oscuro y una membrana plasmática altamente elástica que dificulta la visualización durante la inyección y la penetración de la membrana plasmática. En este protocolo, describimos un método de microinyección adecuado para la administración de soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado bovino que ha demostrado ser exitoso también para embriones de ovejas y cerdos. En primer lugar, se utiliza un láser para crear un agujero en la zona pelúcida. A continuación, se introduce una micropipeta de vidrio de extremo romo a través del orificio y se avanza hasta que la punta de la aguja alcanza aproximadamente 3/4 del embrión. Luego, la membrana plasmática se rompe por aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja. Finalmente, el contenido citoplasmático aspirado seguido de la solución de interés se inyecta de nuevo en el citoplasma embrionario. Este protocolo se ha utilizado con éxito para la administración de diferentes soluciones en cigotos bovinos y ovinos con una eficiencia del 100%, una lisis mínima y tasas de desarrollo de blastocistos normales.

Asistida por láser microinyección citoplásmica es un protocolo potente y fiable para ofrecer soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado. La figura 3 muestra un esquema general de los cigotos antes y después de la inyección, así como el esquema general de la técnica. Dextrano-rojo se utiliza como solución de la inyección para permitir sitio de seguimiento de la eficiencia y la precisión de la inyección y la inyección. El éxito de la entrega de la solución se ilustra...

Este protocolo muestra cómo realizar la microinyección citoplasmática en cigotos de animales de granja. Esta técnica se puede utilizar para administrar cualquier solución en el embrión de una célula, como herramientas de edición del genoma para generar animales knockout.

Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

El objetivo general de este procedimiento es introducir eficazmente soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado mediante una aguja de extremo romo con la ayuda de un láser. Este método se utiliza en investigación y en el campo de la transgénesis animal, ya que cuando se asocia con una herramienta de edición del genoma, como un sistema CRISPR Cas9, puede generar nuevas vacas para estudiar la función génica y animales transgénicos de manera muy sencilla y confiable. La principal ventaja de esta técnica es que puede emplearse para introducir cualquier solución en el citoplasma de cigotos de animales grandes.Con una persona hábil, la eficiencia de inyección minimiza las tasas de lomotil en el hígado animal. Primero, prepare la micropipeta de inyección colocando una capilar de vidrio de borosilicato en un tirador de micropipetas y fíjela en su lugar. Utilice un programa adecuado para estirar el capilar de modo que resulte en una punta fina con una conicidad larga.Luego, retire cuidadosamente las pipetas estiradas del dispositivo y colóquelas sobre un microforjador en posición horizontal. Enfoque la pipeta estirada y el filamento calefactor del microforjador, con su perla de vidrio. Utilice la retícula del ocular para medir el grosor deseado y mueva la pipeta horizontalmente hasta que el filamento calefactor alcance el diámetro interno objetivo de cinco micrómetros.Ajuste el calor alrededor del 45 % y baje suavemente la pipeta hasta que toque el filamento. Luego, active brevemente el calentador. Esto fundirá ligeramente la pipeta, haciendo que se adhiera al filamento, y al enfriarse, la pipeta se romperá en el punto de contacto, generando un corte recto.Establecer la temperatura adecuada es fundamental en este paso. Las temperaturas demasiado altas doblarán la pipeta, mientras que las temperaturas demasiado bajas no serán suficientes para cortar la pipeta. A continuación, forme un ángulo aproximado de 30 grados cerca de la punta de la pipeta colocando la punta a unos 10 micrómetros de distancia del filamento calefactor.Establezca la temperatura en 60% y active el calentador para que la pipeta se doble sobre el filamento hasta alcanzar el ángulo deseado. Utilizando la configuración mostrada aquí, estire una capilar de vidrio para obtener una micropipeta con una punta fina, una conicidad larga y uniforme y paredes paralelas. Retire cuidadosamente la pipeta estirada del dispositivo extractor y colóquela en el portaobjetos del microforjado en posición horizontal.Utilice el retículo del ocular para medir el diámetro de la pipeta y mueva la pipeta hasta que su diámetro sobre el filamento alcance los 180 micrómetros. Marque la capilar de vidrio con un bolígrafo de punta de diamante y luego presione suavemente sobre la punta estirada para romper el vidrio. Esto debería resultar en un corte recto.A continuación, mueva la pipeta a una posición vertical, con su punta cerca del filamento. Establezca la temperatura del microfórceps al 60 % y pulimente la punta de la pipeta mediante técnicas estándar hasta que el diámetro interno alcance el tamaño deseado. Mida el diámetro interno de la pipeta, que debe ser de 40 micrómetros.Utilizando el mismo procedimiento que antes, doble la punta en un ángulo de 30 grados. Inserte la pipeta de sujeción en el porta de la micromanipulación izquierda y la pipeta de inyección en el porta de la micromanipulación derecha. Luego, llene la pipeta de inyección con aceite.Utilice los controles del micromanipulador para colocar las pipetas en el centro del campo de visión del microscopio. Con un aumento de 4X, verifique que las puntas de las micropipetas estén en el ángulo correcto, de forma que queden paralelas al fondo del recipiente. Coloque una gota de 50 microlitros de solución SOF-HEPES a 37 grados Celsius, suplementada con 20 % de FBS, en el centro de la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros.Luego, coloque una gota de uno a dos microlitros de la solución que se va a inyectar cerca de la gota de inyección. A continuación, cubra las gotas y la placa de inyección con aproximadamente 10 mililitros de aceite mineral. Coloque la placa sobre la platina del microscopio y utilice un microdispensador para cargar alrededor de 20 a 30 cigotos en la parte superior de la gota de inyección.Utilizando el objetivo 4X, cargue la solución que se va a inyectar en la pipeta de inyección aplicando presión negativa al microinyector. Cargue una cantidad suficiente de solución para inyectar de dos a tres cigotos y luego muévase a la gota de inyección. Dentro de la gota de inyección, mueva la pipeta de sujeción de manera que la punta se acerque a un cigoto.Aplique presión negativa con el microinyector de sujeción para que el cigoto se fije a la pipeta de sujeción. Una vez que el cigoto esté seguro, cambie a un objetivo de 20X. Verifique que la pipeta de inyección esté posicionada en el plano medio del embrión tocando suavemente el cigoto en el sitio de inyección.Si no está en su plano medio, la aguja tenderá a hacer que el embrión gire, en lugar de perforarlo. A continuación, utilice un software para colocar el láser verticalmente en la zona pelúcida donde se hará el orificio. Una vez posicionado correctamente, use la ventana de control del láser y haga clic en el botón DISPARAR.Asegúrese de que el tamaño del orificio sea lo suficientemente grande como para crear una abertura en la zona pelúcida que permita el paso de la aguja sin dañar la membrana plasmática. Pase la aguja de inyección a través del orificio en la zona pelúcida y haga contacto con la membrana plasmática. Continúe empujando la pipeta hacia adelante hasta que la aguja esté insertada en el embrión hasta una profundidad de 3/4 partes.Observe la posición del menisco en la interfase entre la solución y el aceite. Esto se utilizará para controlar de manera constante el volumen de inyección. Aplique presión negativa en la pipeta de inyección para aspirar la membrana plasmática y el citoplasma dentro de la aguja de inyección.Continúe hasta que el movimiento del citoplasma en la aguja se acelere o hasta que se observe el contenido citoplasmático mezclándose con la solución de inyección. Estos serán indicadores de la ruptura de la membrana plasmática. Inyecte nuevamente el contenido citoplasmático, seguido por la solución, dentro del citoplasma del cigoto, aplicando presión positiva hasta que el menisco en la interfase entre la solución y el aceite haya avanzado una distancia equivalente al diámetro de un cigoto a partir del punto inicial.A continuación, cambie a un objetivo de 4X y mueva el embrión inyectado hacia el lado inferior de la gota de inyección. Libere el embrión aplicando presión positiva sobre el microinyector de sujeción. Recopile los embriones inyectados utilizando un microdispensador.Lave los embriones inyectados trasladándolos a través de las tres gotas de SOF-HEPES y cultívelos, como se describe en el protocolo de texto adjunto. La administración exitosa de la solución es visible en la imagen fluorescente, donde se utiliza dexion rojo para rastrear el sitio de inyección, así como la eficiencia y precisión de la inyección. Aquí, el colorante se distribuye de manera homogénea en el citoplasma, lo cual es típico al utilizar esta técnica.Este protocolo presenta tasas mínimas de lisis en cigotos bovinos y ovinos. Pocos de los embriones inyectados se lisaron en ganado bovino o ovino como resultado de la microinyección. Además, no existen diferencias estadísticamente significativas en las tasas de desarrollo a blastocisto entre los grupos control e inyectados para embriones tanto bovinos como ovinos.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse a un ritmo de dos embriones por minuto. Con una persona hábil, se minimizan las tasas de blastocisto animal. Después de ver este video, debería comprender cómo realizar la microinyección intracitoplasmica asistida por láser en cigotos de ganado.Y también cómo utilizar presión de succión positiva y negativa para asegurar la ruptura de la membrana plasmática y lograr una entrega eficiente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

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Entrega de Gene lentivirales asistida por láser ratón huevos fertilizados

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