Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas
15 de octubre de 2016
PI (4,5) P 2 regula diversas funciones celulares, pero su organización nanoescala en la membrana plasmática de la célula es poco conocido. Por PI etiquetado (4,5) P 2 con una sonda fluorescente de dos colores fusionado con el dominio de homología Pleckstrin, se describe un nuevo enfoque para estudiar la PI (4,5) P 2 distribución espacial en la membrana plasmática en la escala nanométrica .
El objetivo general de este trabajo es emitir la distribución a nanoescala de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato en la membrana plasmática celular mediante microscopía de localización de fluorescencia de molécula única. Este método ayuda a responder preguntas clave sobre la señalización de fosfoinositida. Por ejemplo, ¿cuál es la organización a nanoescala de los fosfoinositidos bajo el complejo de señalización en la membrana celular?
Las principales ventajas de esta técnica son la alta resolución espacial y la derivación del tratamiento con detergente, que es una preocupación importante en los estudios morfológicos de fosfolípidos. Este enfoque incluye tres pasos principales. Paso uno: La preparación de la lámina de membrana plasmática a partir de células vivas.
Paso dos: Marcaje de fosfoinositida e imágenes de florescencia de una sola molécula. Paso tres: Localización de una sola molécula y reconstrucción por imágenes. El día del experimento, la cubierta del pelaje se desliza con medio a un mililitro de PDL.
Una o dos horas más tarde, absorba el exceso de PDL con papel de seda desde el borde del cubreobjetos. A continuación, guarde los cubreobjetos en una placa metálica a cuatro grados centígrados. A continuación, lave las células INS-1 pretransportadas que se han cultivado en cubreobjetos con medio a un mililitro de PBS helado que contiene un milimolar de EGTA.
Repita este lavado tres veces y absorba el exceso de PBS. Ahora, con pinzas, coloque los cubreobjetos con las células cultivadas en los cubreobjetos recubiertos de PDL, con la célula hacia abajo. Haga esto en la placa de metal enfriada.
Luego, transfiera la placa a cuatro grados centígrados durante siete a diez minutos para que las celdas tengan tiempo de adherirse. A continuación, use pinzas para despegar suavemente el cubreobjetos cargado de celdas, lo que dejará una capa delgada de membrana celular en el cubreobjetos recubierto de PDL. A continuación, lave suavemente las láminas de membrana con medio mililitro de PBS helado.
Ahora fije cada lámina de membrana en aproximadamente 150 microlitros de PFA al cuatro por ciento helado con 0.2 por ciento de glutaraldehído en PBS. Deje que las membranas se fijen durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la fijación, proceda inmediatamente con la obtención de imágenes o cubra las preparaciones con PBS helado y guárdelas a cuatro grados centígrados.
Si se utilizan sondas de pH, se recomienda encarecidamente la obtención inmediata de imágenes. Para este procedimiento se utiliza un sistema SMLM basado en microscopio TIRF. Antes de obtener imágenes de las membranas, diluya un microlitro de solución de perlas fluorescentes en 10 mililitros de PBS con 50 milimolares de cloruro de magnesio.
A continuación, cargue una muestra en la cámara de imágenes y añada 200 microlitros de la solución diluida, luego espere 10 minutos. A continuación, lave la muestra con PBS tres veces. Ahora inicie el sistema de imágenes PALM.
En el software de creación de imágenes asociado, seleccione el botón de canal iRFP. Luego encuentre la membrana celular que expresa las sondas de pH en el canal iRFP, use las perlas fluorescentes para la corrección de la deriva. Establezca un ángulo TIRF normal como 2140, que es 1,5 más profundo que el ángulo crítico TIRF y debe ser el ángulo predeterminado.
A continuación, utilice el botón de captura para recopilar una imagen TIRF convencional en el canal iRFP como referencia. A continuación, cambie al canal PAm-Cherry1 haciendo clic en el botón Canal RFP. A continuación, ajuste la barra de desplazamiento de la almohadilla AOTF hasta la derecha para obtener una iluminación completa y aplique el láser durante unos 10 a 20 segundos para blanquear la florescencia de la membrana de fondo.
A continuación, establezca la configuración óptima de la cámara en la pestaña de formato en agrupación de dos por dos. A continuación, configure el protocolo de adquisición rápida en la pestaña Adquisición de secuencia ND en 30 000 imágenes a 20 hercios. A continuación, aplique una potencia del 0,1 al uno por ciento al láser de 405 nanómetros durante la adquisición de la imagen para que los puntos aislados espacialmente en cada fotograma sean fácilmente identificables.
Ahora adquiera imágenes PAm-Cherry1 haciendo clic en el botón Ejecutar ahora. El número de moléculas que se pueden activar disminuirá gradualmente durante las adquisiciones. En respuesta, aumente gradualmente la intensidad del láser de 405 nanómetros para mantener una densidad óptima de señales.
Adquiera imágenes hasta que se active toda la señal PAm-Cherry1. Más tarde, cuando se someta al procesamiento y la reconstrucción de imágenes, identifique y localice los eventos moleculares individuales de cada fotograma. Establezca el umbral de intensidad de filtrado con el número de umbral en la ondícula.
Se proporcionan más detalles en el protocolo de texto. La distribución espacial de PIP2 es sensible a diferentes fijaciones con la fijación adecuada descrita en el texto, las sondas PIP2 mostraron una distribución consistente cuando se marcaron con el anticuerpo PIP2 o dominios de pH específicos. En comparación, las células vivas marcadas con dominios de pH marcados con EGFP no tienen imágenes muy diferentes.
Todas las muestras mostraron una distribución uniforme de las sondas. Por el contrario, una fijación no óptima dio lugar a grupos de PIP2 nítidos y densos y a una disminución de la intensidad de la señal. En condiciones óptimas de fijación, las imágenes de súper resolución de PIP2 en células fijas revelaron una distribución homogénea de las sondas en una parte significativa de la membrana plasmática con gradientes de concentración limitados.
Algunos parches de membrana enriquecidos con sondas PIP2 estaban escasamente distribuidos y tenían varios tamaños. Las imágenes PALM de celdas vivas mostraron una distribución espacial similar a la de las celdas fijas. El análisis detallado de las señales PIP2 reveló que su dinámica era rápida en áreas locales, pero esto no resultó en cambios significativos en su abundancia general.
Esta técnica introduce una nueva forma para que los investigadores en el campo de los fosfolípidos exploren la distribución y actividad de otros subtipos de fosfoinositida en condiciones fisiológicas.
Resumen
Este estudio investiga la distribución a escala nanométrica del fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) en la membrana plasmática celular mediante microscopía de localización de fluorescencia de molécula individual. El método proporciona información sobre la señalización de fosfoinosítidos y la organización de los fosfoinosítidos en las membranas celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Microscopía de Fluorescencia
Antecedentes
- El PI(4,5)P2 desempeña un papel crucial en diversas funciones celulares.
- La organización a escala nanométrica del PI(4,5)P2 en la membrana plasmática no se comprende bien.
- Las técnicas existentes a menudo implican el tratamiento con detergentes, lo cual puede afectar la morfología de los fosfolípidos.
- Este estudio tiene como objetivo superar estas limitaciones mediante un enfoque de imagen novedoso.
Objetivo del estudio
- Elucidar la distribución a escala nanométrica de PI(4,5)P2 en la membrana plasmática.
- Explorar la dinámica de la señalización de fosfoinosítidos.
- Desarrollar un método que evite el tratamiento con detergentes para obtener mejores estudios morfológicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de láminas de membrana plasmática a partir de células vivas.
- Etiquetado de fosfoinosítidos e imagen mediante microscopía de fluorescencia de molécula individual.
- Adquisición y procesamiento de imágenes para localizar eventos moleculares individuales.
- Comparación de métodos de fijación para evaluar su impacto en la distribución de PI(4,5)P2.
Resultados principales
- Las condiciones óptimas de fijación revelaron una distribución homogénea de PI(4,5)P2 en la membrana plasmática.
- La fijación no óptima dio lugar a agrupamientos densos y una disminución en la intensidad de la señal.
- El imagenado en células vivas mostró patrones de distribución espacial similares a los de células fijadas.
- La dinámica de PI(4,5)P2 fue rápida en áreas locales sin cambios significativos en su abundancia total.
Conclusiones
- El estudio presenta un nuevo método para explorar la distribución de fosfoinosítidos.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de la señalización de fosfoinosítidos en condiciones fisiológicas.
- Esta técnica puede aplicarse para investigar otros subtipos de fosfoinosítidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la organización a escala nanométrica de los fosfoinosítidos como PI(4,5)P2 es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en las vías de transducción de señales. Este método permite obtener información mecanicista sobre la dinámica de lípidos de membrana sin artefactos inducidos por detergentes, lo que refuerza la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento. Aborda un punto crítico en la validación de dianas al aclarar la organización espacial relevante para las interacciones fármaco-diana en la membrana plasmática.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al revelar la organización espacial de PI(4,5)P2, un regulador clave de canales iónicos y complejos de señalización.
- Valor operativo: Permite la reducción de riesgos biológicos mediante la visualización directa de la organización de nanodominios lipídicos en entornos de membrana similares a los nativos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al proporcionar claridad mecanicista sobre dianas dependientes de fosfoinosítidos en condiciones fisiológicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados (láminas de membrana fijadas y células vivas) para ensayos de cribado posterior dirigidos a compuestos que modulan los fosfoinosítidos.
- Valor operativo: Proporciona lecturas espaciales cuantitativas de superresolución que mejoran la estandarización y la reproducibilidad del ensayo.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en diferentes subtipos de fosfoinosítidos, permitiendo una evaluación consistente de compuestos en las líneas de descubrimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la fidelidad del sistema relevante para la enfermedad al preservar la distribución de PI(4,5)P2 en imágenes de células vivas, lo que facilita la extrapolación a modelos preclínicos.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Clarifica si los efectos de señalización observados se deben a la reorganización de lípidos en lugar de cambios en la abundancia, mejorando la confianza en el blanco.
- Confianza Predictiva: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la dinámica de lípidos a escala nanométrica con resultados funcionales en contextos fisiopatológicos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación de la hipótesis del blanco hasta el desarrollo del ensayo y la validación mecanicista preclínica, particularmente para blancos que involucran la señalización de fosfoinosítidos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver la organización a escala nanométrica de PI(4,5)P2 en microdominios de la membrana plasmática.
- Tamizaje: Proporciona datos espaciales cuantitativos reproducibles y listos para ensayos, esenciales para un tamizaje fiable de compuestos frente a dianas que modulan lípidos.
- Análisis: Ofrece resultados de localización de moléculas individuales y reconstrucción que permiten comparar la distribución de lípidos bajo distintas condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante imágenes en células vivas que reflejan los patrones de distribución en células fijadas bajo condiciones fisiológicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen reutilizable para explorar múltiples subtipos de fosfoinosítidos, reduciendo el desarrollo metodológico redundante entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de señalización mediadas por fosfoinosítidos.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos optimizados para fijación e imágenes de molécula individual corregidas por deriva.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al aclarar los mecanismos dependientes de lípidos, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas del desarrollo de dianas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en la organización espacial validada de lípidos señalizadores clave en la membrana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de localización de moléculas individuales y en la preparación de láminas de membrana plasmática.
- Necesita un sistema SMLM basado en TIRF con activación láser y corrección de deriva utilizando perlas fluorescentes.
- Exige una estandarización interequipo de los protocolos de fijación para evitar agrupamientos artificiales de las señales de PI(4,5)P2.
- Requiere considerar adaptaciones al extenderse a otros subtipos de fosfoinosítidos o a modelos celulares relevantes para enfermedades.
- Limitación práctica: La interpretación de la señal debe tener en cuenta la dinámica local rápida que no altera la abundancia total del lípido, como se observó en datos de células vivas.
