Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

El objetivo general de este procedimiento es aislar de manera eficiente ARN específico con proteínas que están asociadas con el ARN in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el metabolismo y la regulación del ARN, como qué es un conjunto distinto de fau-bee-pees unidos a una transcripción particular. La principal ventaja de esta técnica es la alta eficiencia del aislamiento, lo que permite la identificación de seguimiento de proteínas nobles asociadas al ARNm.

La metodología rápida utiliza una cepa de levadura que coexpresa ARNm marcado con MS2 y una proteína de fusión de una proteína de unión a MS2 y una proteína de unión a estreptavadina. Cultive 500 mililitros de células de levadura a 30 grados centígrados en dextrosa sintética o medio selectivo SD hasta un OD600 de 0,8 a 1,0. Cuando las células estén listas, centrifugar a 3000 veces G durante 4 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.

Lave las células en PBS y vuelva a centrifugar. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un volumen igual de SD sin metionina. Incubar durante 45 a 60 minutos a 30 grados centígrados para inducir la expresión de la proteína de fusión.

Después de 45 a 60 minutos, reserve 10 mililitros de las células para la extracción de ARN y use las células restantes para una purificación rápida. Para comenzar este procedimiento, agregue a las células 1,35 mililitros de formaldehído al 37%, hasta una concentración final del 0,1% para entrecruzar los complejos ARN-proteína. Continúe incubando a 30 grados centígrados durante 10 minutos.

Para detener la reticulación, agregue 26,5 mililitros de glicina 2,5 molar, hasta una concentración final de 0,125 molar, e incube a 30 grados centígrados durante 3 minutos. A partir de aquí, mantenga todo en hielo y trabaje rápidamente para minimizar la degradación del ARN. Centrifugar las células a 3000 veces G durante 4 minutos a 4 grados centígrados.

Deseche el sobrenadante, agregue 45 mililitros de PBS frío y vuelva a centrifugar. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5 mililitros de tampón de lisis rápida que contiene una alta concentración de inhibidores de la rnasa. Divida la suspensión de la celda en alícuotas de 500 microlitros en tubos de microfuga con tapa de rosca y agregue aproximadamente 400 miligramos de perlas de vidrio enfriadas a cada alícuota.

Lise las células en un batidor de cuentas durante tres minutos. Ponga inmediatamente el lisado en hielo. Transfiera el lisado a nuevos tubos de microfuga.

Corta la parte superior de una jeringa de 5 mililitros y colócala en un tubo vacío de 15 mililitros para que sirva como adaptador para los tubos con tapón de rosca. Usa una aguja caliente para perforar un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo y colócalos encima de los tubos adaptados de 15 mililitros. Centrifugar los conjuntos de la tina a 3000 veces G durante un minuto a 4 grados Celsius para eluir el lisado a los tubos de 15 mililitros.

Transfiera el flujo de cada tubo de 15 mililitros a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 10.000 veces G durante 10 minutos a 4 grados Celsius para eliminar los restos de la celda. Agrupe el sobrenadante de todos los tubos de 1,5 mililitros en un solo tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 y 1/100 de volumen del lisado para el aislamiento de ARN y proteínas, respectivamente.

Comience el procedimiento rápido para aislar complejos de proteínas de ARN agregando 300 microgramos de Avidin al lisado celular. Incubar durante 30 minutos a 4 grados centígrados bajo balanceo constante. Mientras se incuba el lisado celular con Avidin, lave previamente las perlas de estreptavidina, transfiera aproximadamente 300 microlitros de la suspensión de perlas de estreptavadina para que pese 1,5 mililitros en un tubo de microcentrífuga, centrifugue la preparación y luego retire el sobrenadante superior, lo que dará como resultado 250 microlitros de perlas.

Agregue 1 mililitro de tampón de lisis rápida a las perlas y centrifugue a 660 veces G durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Retirar el sobrenadante y lavar de nuevo con tampón de lisis rápida. Para bloquear las perlas, agregue 0,5 mililitros de tampón de lisis rápida, 0,5 mililitros de BSA y 10 microlitros de ARNt de levadura e incube durante 1 hora a 4 grados centígrados con rotación constante.

Lave las perlas dos veces con 1 mililitro de tampón de lisis rápida. Añadir 250 microlitros de las perlas de estreptavidina prelavadas al lisado que contiene avidina e incubar durante 1 hora a 4 grados centígrados con rotación constante. Este tiempo de incubación es un compromiso entre proporcionar suficiente tiempo de unión y minimizar las posibilidades de degradación del ARN.

Después de una hora, centrifugar a 660 veces G durante 2 minutos a 4 grados centígrados para eliminar las perlas de estreptavidina. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 y 1/100 de volumen del lisado para el aislamiento de ARN y proteínas, respectivamente.

Agregue 1 mililitro de tampón de lisis rápida a las perlas. Mezclar por pipeteo, transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugar a 660 veces G durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Lavar tres veces más con tampón de lisis rápida.

Después del lavado final con tampón de lisis rápida, retire el sobrenadante, agregue 1 mililitro de tampón de lavado rápido y gire durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Centrifugar y lavar 2 veces más con tampón de lavado rápido. Lave las cuentas con 1 mililitro de PBS y centrifugue como antes.

Retire el sobrenadante, agregue a las cuentas 120 microlitros de PBS y gire durante 5 minutos en un rodillo. Centrifugar como antes y recoger todo el sobrenadante para la extracción de ARN y proteínas como muestra de lavado. Para eluir el ARN y las proteínas asociadas al ARN, agregue 120 microlitros de biotina 6 milimolares en PBS a las perlas e incube durante 45 minutos a 4 grados centígrados con rotación constante.

Centrifugar las perlas y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Vuelva a girar la muestra eluida y transfiera la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para asegurarse de que no se arrastren las perlas. Toma de muestras para la extracción de ARN o proteínas.

Para determinar la eficiencia del aislamiento y la calidad del ARN, se realizó un análisis del norte para dos ARN marcados. PMP1 y FPR1, a partir de lisis de células fundidas, lisis celular rápida y después de la elución con biotina. Los ARN ribosómicos se detectaron mediante tinción con bromuro de etidio, y la falta de ARN ribosómicos en la muestra de elución indica la rigurosidad de la purificación.

La rigurosidad y especificidad de la purificación se demuestran aún más por la falta de una señal de un ARNm no marcado en las muestras de elución. La señal aparente en el carril FPR1, que no es del tamaño de ACT1, es un remanente de la hibridación previa con la sonda MS2L. Aunque el ARN de entrada está algo más degradado en comparación con el ARN que fue purificado por el protocolo de fenol caliente, se aísla específicamente una cantidad significativa de ARN marcado de longitud completa, como lo revela la fuerte señal en las fracciones de elución.

Las muestras de proteínas se pueden analizar mediante SDS-PAGE y tinción de plata antes del análisis proteómico. La proteína de fusión MS2-CP-GFP-SBP, indicada por la flecha, demuestra una carga proteica igual. Los asteriscos indican bandas con intensidades diferenciales que luego se cortaron del gel para el análisis de espectrometría de masas.

Al intentar este procedimiento, es importante usar guantes, asegurarse de que el área de trabajo esté limpia, preparar la solución con agua libre de ARN y trabajar de manera rápida y eficiente para reducir el tiempo del protocolo. No olvide que trabajar con reactivos como el fenol y el formaldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana química mientras se realiza este procedimiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo purificar de manera eficiente y efectiva el ARN de fayn-tress y su cuerpo asociado.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como RNA-Seq para detectar ARN que se unen a la transcripción de interés.