Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID
30 de septiembre de 2016
Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.
El objetivo general de este procedimiento es aislar eficientemente ARN específico junto con las proteínas que se asocian con el ARN in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el metabolismo y la regulación del ARN, como cuál es el conjunto distinto de FBPs unido a un transcrito particular. La principal ventaja de esta técnica es la alta eficiencia de aislamiento, lo que permite la posterior identificación de proteínas asociadas a ARNm novedosas.
La metodología rápida utiliza una cepa de levadura que coexpresa ARNm marcado con MS2 y una proteína de fusión compuesta por una proteína fijadora de MS2 y una proteína fijadora de estreptavidina. Cultive 500 mililitros de células de levadura a 30 grados Celsius en medio selectivo de dextrosa sintética o medio SD hasta un OD600 de 0,8 a 1,0. Cuando las células estén listas, centrifugue a 3000 × g durante 4 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
Lave las células con PBS y centrifugue nuevamente. Descarte el sobrenadante y re-suspenda las células en un volumen igual de SD sin metionina. Incube de 45 a 60 minutos a 30 grados centígrados para inducir la expresión de la proteína de fusión.
Después de 45 a 60 minutos, separe 10 mililitros de las células para la extracción de ARN y utilice las células restantes para la purificación rápida. Para comenzar este procedimiento, añada a las células 1,35 mililitros de formaldehído al 37%, hasta una concentración final de 0,1%, con el fin de entrecruzar los complejos ARN-proteína. Continúe incubando a 30 grados Celsius durante 10 minutos.
Para detener el entrecruzamiento, agregue 26,5 mililitros de glicina 2,5 molar hasta una concentración final de 0,125 molar e incube a 30 grados Celsius durante 3 minutos. A partir de este momento, mantenga todo en hielo y trabaje rápidamente para minimizar la degradación del ARN. Centrifugue las células a 3000 × g durante 4 minutos a 4 grados Celsius.
Deseche el sobrenadante, agregue 45 mililitros de PBS frío y centrifugue nuevamente. Retire el sobrenadante y re-suspenda las células en 5 mililitros de tampón de lisis rápida que contenga una alta concentración de inhibidores de RNasa. Divida la suspensión celular en alícuotas de 500 microlitros en tubos microcentrífugos con tapa roscada y agregue aproximadamente 400 miligramos de perlas de vidrio enfriadas a cada alícuota.
Lise las células en un homogeneizador con perlas durante tres minutos. Coloque inmediatamente el lisado sobre hielo. Transfiera el lisado a nuevos tubos de microcentrífuga.
Corte la parte superior de una jeringa de 5 mililitros y colóquela sobre un tubo vacío de 15 mililitros para usarla como adaptador para tubos con tapón roscado. Utilice una aguja caliente para perforar un orificio pequeño en la parte inferior de cada tubo y colóquelos encima de los tubos de 15 mililitros adaptados. Centrifugue los conjuntos de tubos a 3000 ×g durante un minuto a 4 °C para eluir el lisado hacia los tubos de 15 mililitros.
Transfiera el flujo pasante de cada tubo de 15 mililitros a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 grados Celsius para eliminar los restos celulares. Reúna el sobrenadante de todos los tubos de 1,5 mililitros en un solo tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 y 1/100 del volumen del lisado para el aislamiento de ARN y proteína, respectivamente.
Inicie el procedimiento rápido para aislar complejos de ARN y proteínas añadiendo 300 microgramos de avidina al lisado celular. Incube durante 30 minutos a 4 grados Celsius con rotación constante. Mientras el lisado celular se incuba con avidina, pre-lave las perlas de estreptavidina, transfiera aproximadamente 300 microlitros de la suspensión de perlas de estreptavidina a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, centrifugue la preparación y luego elimine el sobrenadante superior, lo que dará como resultado 250 microlitros de perlas.
Añada 1 mililitro de tampón de lisis rápida a las perlas y centrifugue a 660 × g durante 2 minutos a 4 grados Celsius. Retire el sobrenadante y lave nuevamente con tampón de lisis rápida. Para bloquear las perlas, añada 0,5 mililitros de tampón de lisis rápida, 0,5 mililitros de albúmina sérica bovina (BSA) y 10 microlitros de ARNt de levadura e incube durante 1 hora a 4 grados Celsius con rotación constante.
Lave las perlas dos veces con 1 mililitro de tampón de lisis rápida. Añada 250 microlitros de las perlas de estreptavidina prelavadas al lisado que contiene avidina e incube durante 1 hora a 4 grados Celsius con rotación constante. Este tiempo de incubación representa un equilibrio entre proporcionar tiempo suficiente para la unión y minimizar las posibilidades de degradación del ARN.
Después de una hora, centrifugue a 660 veces G durante 2 minutos a 4 grados Celsius para eliminar las perlas de estreptavidina. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 y 1/100 del volumen del lisado para el aislamiento de ARN y proteína, respectivamente.
Añada 1 mililitro de tampón de lisis rápida a las perlas. Mezcle mediante pipeteo, transfiera a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 660 ×g durante 2 minutos a 4 grados Celsius. Lave tres veces más con tampón de lisis rápida.
Después del último lavado con tampón de lisis rápida, retire el sobrenadante, agregue 1 mililitro de tampón de lavado rápido y rote durante 5 minutos a 4 grados Celsius. Centrifugue y lave 2 veces más con tampón de lavado rápido. Lave las perlas con 1 mililitro de PBS y centrifugue como antes.
Elimine el sobrenadante, agregue a las perlas 120 microlitros de PBS y rote durante 5 minutos en un rotador. Centrifugue como antes y recoja todo el sobrenadante para la extracción de ARN y proteínas como muestra de lavado. Para eluir el ARN y las proteínas asociadas al ARN, agregue 120 microlitros de biotina 6 milimolar en PBS a las perlas e incube durante 45 minutos a 4 grados Celsius con rotación constante.
Centrifugar las perlas y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar nuevamente la muestra eluida y transferir la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para asegurar que no haya arrastre de perlas. Tomar muestras para la extracción de ARN o proteína.
Para determinar la eficiencia de aislamiento y la calidad del ARN, se realizó un análisis Northern para dos ARN marcados: PMP1 y FPR1, procedentes de la lisis de células por vertido, lisis celular rápida y tras la elución con biotina. Los ARN ribosomales se detectaron mediante tinción con bromuro de etidio, y la ausencia de ARN ribosomales en la muestra eluida indica la rigurosidad de la purificación.
La rigurosidad y especificidad de la purificación quedan demostradas además por la ausencia de señal de un ARNm sin etiqueta en las muestras de elución. La señal aparente en la banda de FPR1, que no tiene el tamaño de ACT1, es un residuo de la hibridación previa con la sonda MS2L. Aunque el ARN de entrada está algo más degradado en comparación con el ARN purificado mediante el protocolo de Fenol Caliente, se aísla una cantidad significativa de ARN etiquetado de longitud completa de forma específica, como lo revela la señal intensa en las fracciones de elución.
Las muestras de proteínas pueden analizarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción con plata antes del análisis de proteómica. La proteína de fusión MS2-CP-GFP-SBP, indicada por la flecha, demuestra una carga proteica equitativa. Los asteriscos indican bandas con intensidades diferenciales que posteriormente se recortaron del gel para el análisis mediante espectrometría de masas.
Al realizar este procedimiento, es importante usar guantes, asegurar un área de trabajo limpia, preparar las soluciones con agua libre de RNAsa y trabajar de forma rápida y eficiente para reducir el tiempo del protocolo. No olvide que trabajar con reactivos como el fenol y el formaldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana química, al llevar a cabo este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar de manera eficiente y efectiva el ARN de fayn-tress y su cuerpo asociado.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de ARN (RNA-Seq) para detectar los ARN que se unen al transcrito de interés.
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Descripción general
Este artículo presenta un método in vivo para aislar ARN específico junto con sus proteínas asociadas. Esta técnica tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la regulación del ARN dentro de las células.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Interacciones ARN-proteína
- Procesos celulares
- Metabolismo del ARN
Antecedentes
- Las interacciones ARN-proteína son cruciales para diversas funciones celulares.
- Comprender estas interacciones puede proporcionar información sobre la regulación del ARN.
- Los métodos existentes pueden carecer de eficiencia al aislar complejos específicos de ARN-proteína.
- Este estudio presenta un enfoque novedoso que utiliza cepas de levadura.
Objetivo del estudio
- Aislar ARN específicos e identificar las proteínas asociadas in vivo.
- Responder preguntas relacionadas con el metabolismo y la regulación del ARN.
- Mejorar la eficiencia de las técnicas de aislamiento de complejos ARN-proteína.
Métodos Utilizados
- Uso de una cepa de levadura que expresa simultáneamente ARNm marcado con MS2.
- Proteína de fusión del proteína de unión a MS2 y proteína de unión a estreptavidina.
- Crecimiento de células de levadura en medio sintético con dextrosa.
- Centrifugación para aislar complejos de ARN-proteína.
Resultados principales
- Se logró una alta eficiencia en el aislamiento de complejos de ARN-proteína.
- Se facilitó la identificación de nuevas proteínas asociadas al ARNm.
- El método permite un procesamiento rápido de las muestras.
- Se obtuvieron conocimientos sobre la regulación del ARN mediante este enfoque.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta valiosa para estudiar las interacciones ARN-proteína.
- Mejora nuestra comprensión del metabolismo y la regulación del ARN.
- Las aplicaciones futuras podrían conducir a descubrimientos en procesos celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de proteínas que se unen al ARN (RBPs) asociadas con transcritos específicos es fundamental para la validación de dianas en terapias basadas en ARN y en el descubrimiento de biomarcadores. La metodología RaPID permite el aislamiento eficiente in vivo de complejos ARN-proteína, lo que contribuye a reducir riesgos mecanicistas al aclarar las interacciones funcionales en un sistema relevante para la enfermedad. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles sobre las asociaciones entre RBPs y ARNm.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la identificación de PBMs unidas a ARNm relevantes para enfermedades, como el PMP1 asociado al RE.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo reproducible para aislar complejos nativos de ARN-proteína de levadura, reduciendo los falsos positivos provenientes de métodos in vitro.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en los blancos mediante la captura específica y de alta eficiencia de interacciones in vivo, facilitando la selección de carteras.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados (cepas de levadura que expresan ARN marcado con MS2 y proteína de fusión) para aplicaciones de cribado posteriores.
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento complejo mediante precipitación con perlas de estreptavidina, mejorando la reproducibilidad entre experimentos.
- Preparación para ensayos: Produce fracciones purificadas de ARN y proteína adecuadas para análisis cuantitativo mediante espectrometría de masas o hibridación Northern.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta la identificación de proteínas de unión al ARN en fase de descubrimiento con la validación preclínica al permitir análisis posteriores como RNA-Seq y SDS-PAGE.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Demuestra rigurosidad y especificidad mediante la ausencia de señales de ARN ribosómico y de ARN mensajero sin etiquetar en las muestras de elución.
- Sistema Relevante para Enfermedades: Aplicable a modelos de levadura del metabolismo del ARN, con posibilidad de adaptación a sistemas mamíferos para la validación de dianas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método RaPID se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la comprobación de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos antes de la identificación de compuestos activos y la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de complejos específicos de ARN-proteína a partir de condiciones in vivo, aclarando las asociaciones funcionales.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos mediante el aislamiento estandarizado de complejos de ARN-proteína, apoyando la selección reproducible de compuestos o factores genéticos.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos mediante espectrometría de masas y análisis por blotting Northern, permitiendo la comparación de la abundancia de proteínas ligadas al ARN en distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad preclínica al proporcionar complejos purificados para su validación posterior en modelos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el descubrimiento de proteínas ligadas al ARN en múltiples transcritos, reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la regulación del ARN.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad mediante pasos definidos de reticulación, lisis y purificación basada en perlas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos confiables sobre las interacciones entre proteínas fijadoras de ARN y ARNm, reduciendo el riesgo biológico en etapas tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en asociaciones validadas de proteínas fijadoras de ARN en contextos relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular, cultivo de levaduras y técnicas de interacción ARN-proteína.
- Necesita instrumentación para el reticulado (formaldehído), separación basada en perlas y centrifugación a múltiples velocidades.
- Exige la estandarización entre equipos en cuanto a la composición del tampón de lisis y el uso de inhibidores de ARNasas para asegurar la reproducibilidad.
- Incluye consideraciones de adaptación al transferir el método desde levaduras a otros sistemas modelo, particularmente en relación con la incorporación de etiquetas y la expresión de proteínas de fusión.
- Presenta limitaciones prácticas, como el riesgo de degradación del ARN durante el procesamiento y la necesidad de manipulación rápida y en frío para mantener la integridad del complejo.
