Name: Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a aislar ARN específico y sus proteínas asociadas in vivo mediante la metodología RaPID en levadura. Esta técnica permite identificar nuevas proteínas ligadas al ARN con alta eficiencia.

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Agradecemos al Prof. Jeff Gerst y Boris Slobodin por sus útiles consejos para configurar el protocolo rápido y proporcionando los plásmidos necesarios. También agradecemos al Dr. Abigail Atir-Lande por su ayuda en el establecimiento de este protocolo y el Dr. Tamar Ziv del Centro de Proteómica Smoler por su ayuda en el análisis LC-MS / MS. Agradecemos al Prof. TG Kinzy (Rutgers) para el anticuerpo YEF3. Este trabajo fue apoyado por el subsidio 2011013 de la Fundación Binacional de Ciencia.

Nota: Inserte una secuencia que consiste en 12 sitios de unión a MS2 (bucles de MS2; MS2L) en el locus genómico deseado, por lo general entre el marco de lectura abierto (ORF) y la 3 &#39;UTR. Un protocolo detallado para esta integración se proporciona en otro lugar 22. Verificar la inserción apropiada y la expresión por PCR, análisis Northern o RT-PCR 20,23. Es importante verificar que la integración no interviene en la síntesis de la 3&#39;UTR. Además, un MS2-CP plásmido que expresa fusionada a SBP bajo la expresión de un promotor inducible (el agotamiento de la metionina) también debe ser introducido en las células 24. Una cepa idéntica, con exclusión de los bucles MS12 introducidos, se debe utilizar como un control para la detección de señales no específicas. 1. purificación rápida <ol><li> Grow 500 ml de células de levadura (utilizar 250-1.000 ml de células de levadura según el nivel de expresión del gen de interés) que expresan MS2 etiquetado-mRNA y 20Proteína de fusión MS2-CP-GFP-PAS 24 a OD 600 0,8 - 1,0 a 30 ° C en el medio de crecimiento apropiado (por ejemplo, dextrosa sintética (SD) medio selectivo). </li><li> centrifugar las células a 3.000 xg durante 4 minutos a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar las células en 1x tampón fosfato salino (PBS), centrífuga como antes (paso 1.2), se resuspenden en un volumen igual (paso 1.1) de SD sin metionina, y se incuba durante 45 - 60 min a 30 ° C para inducir la expresión de la MS2 -CP-GFP-PAS proteína de fusión. Nota: El tiempo de inducción más largo puede causar la agregación de GFP. </li><li> Destinará 10 ml de células y extraer ARN a partir de esta muestra utilizando el sencillo método de &quot;fenol caliente&quot; 25. Precaución: El fenol es altamente tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad. Nota: Este ARN es una buena referencia para la calidad del ARN aislado (Figura 1A). </li><li> Por 500 ml células, añadir 1,35 ml de formaldehído al 37% a una final concentración de 0,1% para reticular los complejos de ARN-proteína. Continuar la incubación a 30 ° C durante 10 min. Precaución: El formaldehído es altamente tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad. </li><li> Añadir 26,5 ml de 2,5 M de glicina a una concentración final de 0,125 M y se incuba durante 3 min para detener la reticulación. A partir de este paso adelante, poner todo en hielo para minimizar la degradación del ARN. </li><li> Centrifugar las células a 3.000 g durante 4 min a 4 ° C y se lavan con 45 ml de PBS frío 1x. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis rápida por 100 ml de cultivo celular inicial. </li><li> Dividir en alícuotas de 500 l en tubos de microcentrífuga con tapón de rosca y añadir ~ 400 mg de perlas de vidrio refrigeradas a cada alícuota (aproximadamente un total de 0,2 ml tubo de PCR). </li><li> lisar las células en una perla batidora durante 3 min. Inmediatamente después, poner el lisado en hielo. Nota: Los comunicados de lisis celular ARNasas celulares, que son la principal causa de la degradación del ARN. tampón de lisis rápida contiene una alta concentración de RNasa INHIbidores, tales como la heparina inhibidor de RNasa no específica y los inhibidores específicos. También se recomienda trabajar con rapidez y mantener todo frío. </li><li> Transferir el lisado a tubos nuevos. Pierce un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo de microcentrífuga con una aguja caliente (0,8 mm x 40 mm) y coloque los tubos de microcentrífuga en la parte superior de los tubos de 15 ml. Utilice la cabeza de una jeringa de 5 ml como un adaptador entre los tubos de microcentrífuga y los tubos de 15 ml. Se centrifuga el conjunto de tubos a 3000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el flujo a través del tubo 15 ml a un tubo nuevo 1,5 ml y centrifugar a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares. </li><li> sobrenadantes de la piscina desde todas tubos de 1,5 ml en un solo tubo de 15 ml, y dejar de lado 1/50 y 1/100 del volumen del lisado para el ARN y el aislamiento de proteínas, respectivamente. Nota: Estos servirán como las muestras &quot;de entrada&quot; para su posterior análisis (Figura 1). </li><li> Añadir 300 g de avidina por cada 500 ml de icultivo de levadura nitial e incubar durante 30 min (esta puede reducirse a 10 min) a 4 ° C bajo constante de rodadura (10 rpm). Nota: Los bloques de avidina biotina y proteínas biotiniladas de la unión a las perlas de estreptavidina. </li><li> Pre-lavar las perlas de estreptavidina antes de la incubación con el lisado celular. <ol><li> Transferir unos 300 l de la estreptavidina perlas de suspensión a un tubo de 1.5 ml y eliminar el sobrenadante superior. Esto resultará en 250 l de perlas. Lavar las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lisis rápida. Centrifugar las perlas de estreptavidina a 660 xg durante 2 min a 4 ° C entre cada paso. </li><li> Bloquear las perlas mediante la incubación durante 1 hora con 0,5 ml de tampón de lisis RaPID, 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA y 10 l de 10 mg / ml de ARNt de levadura. Los granos se pueden dejar O / N en solución de bloqueo a 4 ° C con rotación, si es necesario. </li><li> Lavar dos veces con 1 ml de tampón de lisis rápida. Nota: Las perlas magnéticas se pueden utilizar también para reducir el tiempo y background. Estos, sin embargo, tienen menor capacidad de perlas de sefarosa. </li></ol></li><li> Añadir 250 l de las perlas de estreptavidina pre-lavado para el lisado que contiene avidina-(del paso 1,14) y se incuba 1 hora a 4 ° C con rotación constante (10 rpm). Nota: Este tiempo de incubación es un compromiso entre proporcionar suficiente tiempo de unión y reducir al mínimo las posibilidades de la degradación del ARN. </li><li> Centrifugar a 660 xg durante 2 min a 4 ° C para eliminar las perlas de estreptavidina y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml. Aparte 1/50 y 1/100 volumen del lisado para el ARN y la proteína de aislamiento, respectivamente. Nota: Estas serán las muestras &quot;sin consolidar&quot;. </li><li> Lavar las perlas con 1 ml de tampón de lisis rápida, agitar suavemente, transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se centrifuga como en el paso 1.17. Repita este paso tres veces. </li><li> Lavar las perlas con 1 ml de tampón de lavado rápido, y esta rotación de tiempo (10 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso dos veces. </li&gt; <li> Lavar las perlas con 1 ml de 1x PBS y centrifugar como anteriormente. </li><li> Lavar las perlas de nuevo con 120 l de 1x PBS. Centrifugadora que el anterior, y tomar todo el sobrenadante de ARN y la extracción de proteínas como la muestra &quot;Lavado&quot;. Nota: Esta última muestra de lavado indicará la rigurosidad de los lavados y debe ser del mismo volumen que la muestra de elución. Esto simplificará el procesamiento y la carga en los ensayos posteriores. </li><li> Para eluir el ARN y ARN-proteínas asociado de la columna, añadir 120 l de biotina 6 mM en 1 x PBS y se incuba durante 45 min a 4 ° C con rotación constante (10 rpm). </li><li> Centrifugar las perlas como anteriormente y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 ml. Girar la muestra eluida de nuevo y transferir la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 ml para asegurar que no arrastre de perlas. </li><li> Tomar muestras de ARN o extracción de proteínas. Nota: El volumen ocupado debe depender del siguiente nivel de análisis y expresión del ARN o proteína de interés. A modo de orientación, por el norte de análisis 26, tomar el 80% de la muestra, por Western blot 23,27 o RT-PCR de 28 años, tener un 20%, y por espectrometría de masas de 29 a descubrir nuevas proteínas, tomar la muestra completa. </li></ol> 2. La extracción de RNA <ol><li> Añadir un volumen igual de 2x La reticulación Reversión del búfer y se incuba durante 45 minutos a 65 ° C. Continuar directamente para la extracción de RNA. Nota: El Reversión reticulación Buffer contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), lo que mejora significativamente la extracción de RNA 20. </li><li> Utilizar el estándar de fenol: cloroformo método 26 para extraer el ARN de las muestras &quot;sin consolidar&quot; (pasos 1.13 y 1.17) &quot;entrada&quot; y. Nota: Estas muestras contienen una gran cantidad de la heparina inhibidor de RNasa, que puede inhibir subsiguientes ensayos que utilizan inversa Transcriptase- (RT) (por ejemplo, RT-PCR), por lo tanto, la precipitación LiCl 30 se recomienda para eliminarlo. El wash &quot;y&quot; &quot;muestras de elución (pasos 1.21 y 1.24) contienen bajas cantidades de ARN y se precipitan a través de los siguientes pasos. </li><li> Añadir un volumen igual de guanidinio 8M-HCl (GuHCl) y dos volúmenes de etanol al 100% de las muestras de elución &quot;&quot; &quot;lavado&quot; y. Se incuba a -80 ° C durante al menos 2 hr. Nota: guanidinio se desnaturalizar proteínas de manera eficiente y por lo tanto inhibir RNasas y proteasas en la muestra. </li><li> Centrifugar a 20.000 xg, 4 ° C durante 30 min y descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado con etanol frío al 80% y se centrifuga de nuevo a 20.000 xg, 4 ° C durante 15 min. </li><li> Se disuelve el pellet de ARN en 400 l de RNasa libre de agua y precipitar de nuevo para eliminar cualquier GuHCl restos u otros contaminantes. Añadir 40 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y 800 l de etanol al 100%, se incuba a -20 ° C durante al menos 1 hr. </li><li> Centrifugar y lavar como en el paso 2.4 y eliminar todo el etanol con una punta de 10 l. Resuspender el ARN pelly en 10 l de agua libre de RNasa. Tener un cuidado especial como el sedimento de ARN no suele ser visible. Nota: Las muestras se pueden utilizar para el análisis de Northern como se describe en 23 (Figura 1). </li></ol> 3. Preparación para la proteína de transferencia Western o análisis de espectrometría de masas <ol><li> Añadir 1/3 volumen de tampón de muestra Laemmli 4x (LSB) de las muestras de proteína y se incuba 45 min a 65 ° C para invertir la reticulación de ARN y proteínas. Nota: Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C. </li><li> Proteínas en un gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 31. Ajuste el porcentaje del gel de acuerdo con el tamaño de las proteínas a analizar. Nota: 10% de gel de acrilamida da una amplia gama de separación y es bueno como una primera aproximación. </li><li> Transferencia de las proteínas a la membrana como en el análisis de inmunotransferencia estándar 27 para el control de la eficiencia de aislamiento (Figura 1C). Manchar con Coomassie Blue R250 o tinción de plata antes del análisis de espectrometría de masas. Nota: tinción de plata es la opción preferida ya que es más sensible y permite una mejor detección (Figura 1B). La tinción se puede hacer ya sea con soluciones preparadas manualmente o kits comerciales. El tiempo de incubación del gel en la solución de colorante final se debe determinar experimentalmente. De incubación prolongado puede revelar las proteínas de baja abundancia, pero puede causar proteínas altamente expresadas como MS2-CP-SBP-GFP sean excesivamente manchada y puede enmascarar las proteínas que rodean en sus proximidades. Además, se puede producir un alto fondo. Siga cuidadosamente la reacción, y añadir la solución de parada en el momento apropiado. </li><li> Cortar las bandas del gel y transferirlas a tubos de 1,5 ml. Conservar las muestras a -20 ° C, o envían para la extracción de proteínas y la digestión con tripsina seguido de análisis por LC-MS / MS 32. </li><li> Como un enfoque proteómico alternativa para excluir la etapa de separación de gel, digerir material eluido de la etapa 1.24 en lalución utilizando tripsina y sujeto a análisis por LC-MS / MS 33. Nota: La omisión de la SDS-PAGE separación simplifica el protocolo y aumenta el rendimiento. Sin embargo, las muestras pueden contener trazas de detergente NP-40, que inhibe el análisis de espectrometría de masas. Para superar este problema, realice los siguientes pasos: <ol><li> Ejecutar la proteína en SDS-PAGE al 31 durante 10 - 15 min. </li><li> Cortar la parte entera del carril (es decir, donde se encuentran las proteínas). Nota: La muestra de proteína puede incluir una cantidad significativa de la proteína MS2-CP-SBP que pueden oscurecer las señales de las proteínas de baja abundancia. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Varios métodos utilizan el aislamiento de ARNm específicos para identificar sus proteínas asociadas 11,34 35. Estos métodos se aplican in vitro y in vivo en estrategias para sondear las interacciones ARN-proteína. Los procedimientos in vitro Incubar exógenamente transcritos de ARN con lisado celular para capturar las prácticas comerciales restrictivas y aislar los complejos de RNP 36,37. Un enfoque eficaz de este tipo fue presentado recientemente, lo q...

Proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) representan aproximadamente el 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 y aproximadamente el 15% de las proteínas de mamíferos 3-5. Ellos están implicados en muchos procesos celulares, tales como el procesamiento del mRNA post-transcripcional y regulación, la traducción, la biogénesis de ribosomas, ARNt y aminoacilación modificación, remodelación de la cromatina, y mucho más. Un subgrupo importante de las prácticas comerciales restrictivas son las proteínas de unión a ARNm (6,7 mRNPs). En el curso de la maduración del ARNm, diferentes prácticas comerciales restrictivas se unen la transcripción y median su procesamiento nuclear, la exportación fuera del núcleo, localización celular, la traducción y la degradación de 6-8. Por lo tanto, el conjunto distinto de las prácticas comerciales restrictivas unidos a una transcripción en particular en cualquier punto de tiempo determina su procesamiento y en última instancia su destino. La identificación de las prácticas comerciales restrictivas asociadas con un ARNm podría mejorar significativamente nuestra comprensión de los procesos que subyacen a su regulación post-transcripcional. diversa genética, Métodos microscópicos, bioquímicos y bioinformática se han utilizado para identificar proteínas implicadas en la regulación del mRNA (revisado en 9-11). Sin embargo, sólo unos pocos de estos métodos permiten la identificación de proteínas asociadas con un ARNm diana particular. Es de destacar el sistema híbrido de levadura Tres (Y3H), que utiliza el ARNm de interés como cebo para cribar una biblioteca de expresión en células de levadura. Los clones positivos se observan generalmente a través de una expresión de selección de crecimiento o reportero 12-14. La ventaja clave de este método es el gran número de proteínas que se pueden escanear en un ambiente celular y la capacidad de medir la fuerza de la interacción de ARN-proteína. Las desventajas incluyen la relativamente gran número de resultados falsos positivos debido a la unión no específica, y el alto potencial de resultados falsos negativos debido, en parte, a un mal plegamiento de la proteína de fusión de la presa o el ARN cebo. Una alternativa al enfoque genético es purifi afinidadcación de ARN con sus proteínas asociadas. Poli A que contiene ARNm se puede aislar mediante el uso de oligo dT columnas, y sus proteínas asociadas son detectados por espectrometría de masas. La interacción ARN-proteína se conserva en su contexto celular mediante reticulación, lo que hace que los enlaces covalentes de corto alcance. El uso de la columna de oligo dT da una visión global de todo el proteoma que está asociado con cualquier poli A que contiene ARNm 3,5,15. Sin embargo, esto no proporciona una lista de proteínas que están asociadas con un ARNm particular. Muy pocos métodos disponibles para llevar a cabo tal identificación. El método PAIR implica la transfección de ácido nucleico con la complementariedad con el ARNm diana 16,17. El ácido nucleico también se une a un péptido, que permite la reticulación de las prácticas comerciales restrictivas en las cercanías de la sitio de interacción. Después de la reticulación, el ácido RBP-péptido-nucleico puede ser aislado y sometido a análisis de la proteómica. Recientemente, una metodología basada en el aptámero estabaaplicado con éxito a extractos de líneas celulares de mamíferos 18. Un aptámero de ARN con afinidad mejorada a la estreptavidina se desarrolló y se fusiona a una secuencia de interés (elemento AU-rico (ARE) en este caso). El ARN aptamer-ARE se une a perlas de estreptavidina y se mezcla con lisado de células. Las proteínas que asocian con la secuencia ARE se purificaron y se identifican por espectrometría de masas (MS). Aunque este método detecta asociaciones que se producen fuera de los ajustes celulares (es decir, in vitro), es probable que ser modificado en el futuro con el fin de introducir los aptámeros en el genoma y por lo tanto permitir el aislamiento de proteínas asociadas con el ARNm mientras que en el medio celular (es decir, in vivo). En la levadura, donde las manipulaciones genéticas están bien establecidos, el método rápido (desarrollado en el laboratorio del Prof. Jeff Gerst) proporciona una visión de las asociaciones in vivo 19. RaPID combina la MS2- específico y fuerte unión de la proteína de cubierta de MS2 (CP) a la secuencia de ARN MS2, y del dominio de unión a estreptavidina (SBP) a la estreptavidina perlas conjugadas. Esto permite la purificación eficiente de mRNAs etiquetados-MS2 a través de perlas de estreptavidina. Además, la expresión de 12 copias de bucles de MS2 permite que hasta seis MS2 CPs de unirse simultáneamente a la ARN y aumentar la eficiencia de su aislamiento. Por lo tanto, este protocolo se sugirió que permita la identificación de nuevas proteínas de ARNm-asociado una vez que las muestras eluidas se sometieron a análisis por espectrometría de masas proteómica. Recientemente hemos utilizado RaPID para identificar nuevas proteínas asociadas con la levadura ARNm pMP1 20. PMP1 ARNm se había demostrado que se asocia con la membrana del RE y fue encontrado su región 3 &#39;no traducida (UTR) ser un determinante importante en esta asociación 21. Por lo tanto, las prácticas comerciales restrictivas que se unen pMP1 3 &#39;UTR es probable que desempeñen un papel importante en su localización. Rápida seguida de cromatógrafo de líquidosy-espectrometría de masas / espectrometría de masas (LC-MS / MS) dio lugar a la identificación de muchos nuevas proteínas que interactúan con pMP1 20. En esto, proporcionamos un protocolo detallado de la metodología RaPID, controles importantes que hay que hacer, y sugerencias técnicas que pueden mejorar el rendimiento y la especificidad.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Fenol ácido (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Fenol ácido: Cloroformo (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilo Fluoruro (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de soja</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Promega</td><td>M610A</td> Ribonucleasa<td></td></tr><tr><td>&nbsp; Inhibidor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0,4-0,6 mm de diámetro&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levadura</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptona</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Tampón de muestra Laemmli (LSB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M Tris-Hcl pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerol, 0,04% azul de bromofenol.</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lisis de fenol caliente <td>10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% SDS&nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Acetato de sodio pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% y 70% Etanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>libre de RNasa</tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lisis <td>RaPID 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Heparina, 1 mM Ditiothreitol (DTT), 1 mM Fenilmetilsulfonilo Fluoruro (PMSF), 10 y micro; g/ml de Leupeptina, 10 &micro; g/ml de Aprotinina, 10 &micro; g/ml Inhibidor de tripsina de soja, 10 y micro; g/ml de pepstatina, 20 U/ml de DNasa I, 100 U/ml de ribonucleasa&nbsp; Inhibidor.</td></tr><tr>2x Tampón <td></td><td></td><td>de inversión de reticulación</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM TDT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lavado RaPID <td>20 mM Tris-HCl pH 7,5,&nbsp; 300 mM NaCl, 0,5% NP-40</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>Para la detección de proteínas en geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>SD medio selectivo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l Levadura base nitrogenada sin aminoácidos ni sulfato de amonio, 5 g/l Sulfato de amonio, 2% de glucosa, 350 mg/l Treonina, 40 mg/l Metionina, 40 mg/l Adenina, 50 mg/l Lisina, 50 mg/l Triptófano, 20 mg/l Histidina, 80 mg/l Leucina, 30 mg/l Tirosina, 40 mg/l Arginina</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)</td><td>Regalo de Kinzy TG. (UMDNJ, Facultad de Medicina Robert Wood Johnson)</td><td>1:5.000</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3.000</td></tr><tr><td>Anti conejo IgG-HRP conjugado</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10.000</td></tr></tbody></table>

nuevas proteínas de unión a arn aislamiento por la metodología rapid

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Las proteínas de unión al ARN (RBP) desempeñan un papel importante en todos los aspectos del metabolismo y la regulación del ARN. Su identificación es un reto importante en la biología moderna. Solo unos pocos métodos in vitro e in vivo permiten la identificación de RBP asociados con un ARNm diana en particular. Sin embargo, sus principales limitaciones son la identificación de RBPs en un entorno no celular (in vitro) o el aislamiento de baja eficiencia del ARN de interés (in vivo). Se diseñó una metodología de purificación e identificación de proteínas de unión al ARN (RaPID) para superar estas limitaciones en la levadura y permitir el aislamiento eficiente de las proteínas asociadas in vivo. Para lograr esto, el ARN de interés se marca con bucles MS2 y se coexpresa con una proteína de fusión de una proteína de unión a MS2 y una proteína de unión a estreptavidina (SBP). A continuación, las células se someten a reticulación y se lisan, y los complejos se aíslan mediante perlas de estreptavidina. Las proteínas que se copurifican con el ARN marcado se pueden determinar mediante espectrometría de masas. Recientemente hemos utilizado este protocolo para identificar nuevas proteínas asociadas con el ARNm PMP1 asociado a ER. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado de RaPID y discutimos algunas de sus limitaciones y ventajas.

RaPID permite el aislamiento de un ARN diana específico con sus proteínas asociadas. Crítica para su éxito es mantener el ARN intacto tanto como sea posible, obteniendo de esta manera una cantidad suficiente de proteínas. Para determinar la eficacia y la calidad de aislamiento de ARN, el norte de análisis se lleva a cabo (Figura 1A). el análisis del Norte tiene la ventaja de que depende directamente de la eficiencia y la calidad de la rápida. Por lo tanto, las cantidades...

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar eficientemente ARN específico junto con las proteínas que se asocian con el ARN in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el metabolismo y la regulación del ARN, como cuál es el conjunto distinto de FBPs unido a un transcrito particular. La principal ventaja de esta técnica es la alta eficiencia de aislamiento, lo que permite la posterior identificación de proteínas asociadas a ARNm novedosas.La metodología rápida utiliza una cepa de levadura que coexpresa ARNm marcado con MS2 y una proteína de fusión compuesta por una proteína fijadora de MS2 y una proteína fijadora de estreptavidina. Cultive 500 mililitros de células de levadura a 30 grados Celsius en medio selectivo de dextrosa sintética o medio SD hasta un OD600 de 0,8 a 1,0. Cuando las células estén listas, centrifugue a 3000 × g durante 4 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.Lave las células con PBS y centrifugue nuevamente. Descarte el sobrenadante y re-suspenda las células en un volumen igual de SD sin metionina. Incube de 45 a 60 minutos a 30 grados centígrados para inducir la expresión de la proteína de fusión.Después de 45 a 60 minutos, separe 10 mililitros de las células para la extracción de ARN y utilice las células restantes para la purificación rápida. Para comenzar este procedimiento, añada a las células 1,35 mililitros de formaldehído al 37%, hasta una concentración final de 0,1%, con el fin de entrecruzar los complejos ARN-proteína. Continúe incubando a 30 grados Celsius durante 10 minutos.Para detener el entrecruzamiento, agregue 26,5 mililitros de glicina 2,5 molar hasta una concentración final de 0,125 molar e incube a 30 grados Celsius durante 3 minutos. A partir de este momento, mantenga todo en hielo y trabaje rápidamente para minimizar la degradación del ARN. Centrifugue las células a 3000 × g durante 4 minutos a 4 grados Celsius.Deseche el sobrenadante, agregue 45 mililitros de PBS frío y centrifugue nuevamente. Retire el sobrenadante y re-suspenda las células en 5 mililitros de tampón de lisis rápida que contenga una alta concentración de inhibidores de RNasa. Divida la suspensión celular en alícuotas de 500 microlitros en tubos microcentrífugos con tapa roscada y agregue aproximadamente 400 miligramos de perlas de vidrio enfriadas a cada alícuota.Lise las células en un homogeneizador con perlas durante tres minutos. Coloque inmediatamente el lisado sobre hielo. Transfiera el lisado a nuevos tubos de microcentrífuga.Corte la parte superior de una jeringa de 5 mililitros y colóquela sobre un tubo vacío de 15 mililitros para usarla como adaptador para tubos con tapón roscado. Utilice una aguja caliente para perforar un orificio pequeño en la parte inferior de cada tubo y colóquelos encima de los tubos de 15 mililitros adaptados. Centrifugue los conjuntos de tubos a 3000 ×g durante un minuto a 4 °C para eluir el lisado hacia los tubos de 15 mililitros.Transfiera el flujo pasante de cada tubo de 15 mililitros a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 grados Celsius para eliminar los restos celulares. Reúna el sobrenadante de todos los tubos de 1,5 mililitros en un solo tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 y 1/100 del volumen del lisado para el aislamiento de ARN y proteína, respectivamente.Inicie el procedimiento rápido para aislar complejos de ARN y proteínas añadiendo 300 microgramos de avidina al lisado celular. Incube durante 30 minutos a 4 grados Celsius con rotación constante. Mientras el lisado celular se incuba con avidina, pre-lave las perlas de estreptavidina, transfiera aproximadamente 300 microlitros de la suspensión de perlas de estreptavidina a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, centrifugue la preparación y luego elimine el sobrenadante superior, lo que dará como resultado 250 microlitros de perlas.Añada 1 mililitro de tampón de lisis rápida a las perlas y centrifugue a 660 × g durante 2 minutos a 4 grados Celsius. Retire el sobrenadante y lave nuevamente con tampón de lisis rápida. Para bloquear las perlas, añada 0,5 mililitros de tampón de lisis rápida, 0,5 mililitros de albúmina sérica bovina (BSA) y 10 microlitros de ARNt de levadura e incube durante 1 hora a 4 grados Celsius con rotación constante.Lave las perlas dos veces con 1 mililitro de tampón de lisis rápida. Añada 250 microlitros de las perlas de estreptavidina prelavadas al lisado que contiene avidina e incube durante 1 hora a 4 grados Celsius con rotación constante. Este tiempo de incubación representa un equilibrio entre proporcionar tiempo suficiente para la unión y minimizar las posibilidades de degradación del ARN.Después de una hora, centrifugue a 660 veces G durante 2 minutos a 4 grados Celsius para eliminar las perlas de estreptavidina. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 y 1/100 del volumen del lisado para el aislamiento de ARN y proteína, respectivamente.Añada 1 mililitro de tampón de lisis rápida a las perlas. Mezcle mediante pipeteo, transfiera a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 660 ×g durante 2 minutos a 4 grados Celsius. Lave tres veces más con tampón de lisis rápida.Después del último lavado con tampón de lisis rápida, retire el sobrenadante, agregue 1 mililitro de tampón de lavado rápido y rote durante 5 minutos a 4 grados Celsius. Centrifugue y lave 2 veces más con tampón de lavado rápido. Lave las perlas con 1 mililitro de PBS y centrifugue como antes.Elimine el sobrenadante, agregue a las perlas 120 microlitros de PBS y rote durante 5 minutos en un rotador. Centrifugue como antes y recoja todo el sobrenadante para la extracción de ARN y proteínas como muestra de lavado. Para eluir el ARN y las proteínas asociadas al ARN, agregue 120 microlitros de biotina 6 milimolar en PBS a las perlas e incube durante 45 minutos a 4 grados Celsius con rotación constante.Centrifugar las perlas y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar nuevamente la muestra eluida y transferir la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para asegurar que no haya arrastre de perlas. Tomar muestras para la extracción de ARN o proteína.Para determinar la eficiencia de aislamiento y la calidad del ARN, se realizó un análisis Northern para dos ARN marcados: PMP1 y FPR1, procedentes de la lisis de células por vertido, lisis celular rápida y tras la elución con biotina. Los ARN ribosomales se detectaron mediante tinción con bromuro de etidio, y la ausencia de ARN ribosomales en la muestra eluida indica la rigurosidad de la purificación.La rigurosidad y especificidad de la purificación quedan demostradas además por la ausencia de señal de un ARNm sin etiqueta en las muestras de elución. La señal aparente en la banda de FPR1, que no tiene el tamaño de ACT1, es un residuo de la hibridación previa con la sonda MS2L. Aunque el ARN de entrada está algo más degradado en comparación con el ARN purificado mediante el protocolo de Fenol Caliente, se aísla una cantidad significativa de ARN etiquetado de longitud completa de forma específica, como lo revela la señal intensa en las fracciones de elución.Las muestras de proteínas pueden analizarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción con plata antes del análisis de proteómica. La proteína de fusión MS2-CP-GFP-SBP, indicada por la flecha, demuestra una carga proteica equitativa. Los asteriscos indican bandas con intensidades diferenciales que posteriormente se recortaron del gel para el análisis mediante espectrometría de masas.Al realizar este procedimiento, es importante usar guantes, asegurar un área de trabajo limpia, preparar las soluciones con agua libre de RNAsa y trabajar de forma rápida y eficiente para reducir el tiempo del protocolo. No olvide que trabajar con reactivos como el fenol y el formaldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana química, al llevar a cabo este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar de manera eficiente y efectiva el ARN de fayn-tress y su cuerpo asociado.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de ARN (RNA-Seq) para detectar los ARN que se unen al transcrito de interés.

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y...

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

En este video, describimos la evolución sistemática de ligandos mediante el método de enriquecimiento exponencial (SELEX) para identificar secuencias específicas de unión a ARN para una proteína diana de interés. La proteína se incuba con un gran grupo de secuencias de ARN aleatorias, y las secuencias de ARN de unión a proteínas se aíslan, se amplifican por PCR y se secuencian para identificar sus sitios de unión a proteínas.

Ensayo de unión in vitro basado en SELEX para identificar interacciones ARN-proteína

Este manuscrito describe un enfoque para aislar RNPs afines seleccionados formados en células eucariotas a través de un enriquecimiento específico dirigido a oligonucleótidos. Demostramos la aplicabilidad de este enfoque mediante el aislamiento de un RNP afín unido a la región no traducida retroviral 5' que está compuesta por DHX9/ARN helicasa A.

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

La especificidad de la secuencia es fundamental para la regulación genética. Las proteínas reguladoras que reconocen secuencias específicas son importantes para la regulación genética. Definir sitios de unión funcional para tales proteínas es un problema biológico desafiante. Aquí se describe un enfoque iterativo para la identificación de un sitio de unión para una proteína de unión al ARN y es aplicable a todas las proteínas de unión al ARN.

Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN

Aquí, presentamos un método in vitro optimizado para descubrir, cuantificar y validar interactores de proteínas de secuencias específicas de ARN, utilizando extracto de proteína total de células humanas, perlas de estreptavidina recubiertas con ARN biotinilado y análisis de espectrometría de masas.

Un análisis extraíble cuantitativo optimizado de proteínas de unión al ARN utilizando ARN biotinilado corto

Aprende a aislar ARN específico y sus proteínas asociadas in vivo mediante la metodología RaPID en levadura. Esta técnica permite identificar nuevas proteínas ligadas al ARN con alta eficiencia.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

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