Name: Fagosoma Cierre de ensayo para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a visualizar la formación y cierre de fagosomas en macrófagos vivos mediante microscopía TIRF en tres dimensiones. Este método permite estudiar la dinámica de la respuesta inmune con alta resolución.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, París, Francia) por las discusiones iniciales sobre el enfoque experimental y al Dr. Jamil Jubrail por leer el manuscrito. Nadège Kambou y Susanna Borreill son reconocidas por realizar experimentos con el método en nuestro laboratorio. Este trabajo ha contado con el apoyo de subvenciones del CNRS (Programa ATIP), Ville de Paris y de la Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), de la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 incluyendo una beca doctoral para FMA) a FN, y de la Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS) incluyendo una beca doctoral para JM.

Nota: El plásmido utilizado Lifeact-mCherry es una especie de regalo del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, París, generada tras 17. 1. Células y transfección Nota: los macrófagos RAW264.7 se cultivan a sub confluencia en medio completo (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 50 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina y 10% de FCS ( fetal Calf Serum)) en una placa de 100 mm. Ellos son transfectadas con plásmidos que codifican las proteínas etiquetadas con fluorescencia mediante electroporación. Rutinariamente aproximadamente 5-6 x 10 6 células se transfectaron con 20 g o 10 g de plásmido para cada transfección o co-transfección respectivamente. Tenga en cuenta que otros medios de transfección basados ​​en la electroporación o lipofección se pueden utilizar como enfoques alternativos. <ol><li> Raspar las células con un levantador de células y volver a suspender en 10 ml de medio de cultivo pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Centrifugar lasuspensión celular 300 xg, 5 min a temperatura ambiente en el rotor de ángulo de balanceo. </li><li> Precalentar 10 ml de medio completo suplementado con 10 g / ml de gentamicina a 37 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de &quot;tampón de lavado A&quot; del kit de la electroporación. </li><li> Centrifugar la suspensión de células 300 xg, 5 min a temperatura ambiente en rotor de ángulo de balanceo. </li><li> Mientras tanto preparar la mezcla de ADN a temperatura ambiente: 120 l 2x tampón B, 20 g de ADN plasmídico que codifica la proteína de interés, csp 240 l de H2O </li><li> Después de la centrifugación, desechar todo el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en la mezcla de ADN y la transferencia en cubetas de electroporación de 4 mm. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Electroporate a 250 V, 900 mF. </li><li> Inmediatamente resuspender las células en el pre-calentado (37 ° C) medio completo suplementado con gentamicina y la placa de lasm en una placa de 100 mm. </li><li> Se incuban las células transfectadas durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> A la mañana siguiente, sustituir el medio completo con 10 ml de medio de microscopía libre de suero (RPMI 1640 sin rojo fenol, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 50 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina). </li></ol> 2. Opsonización de glóbulos rojos Nota: Como modelo de destino de partículas para los macrófagos, se utilizan células rojas de la sangre de oveja (SRBC). Por lo general, se utiliza alrededor de 7 x 10 6 SRBCs por 35 mm placa de fondo de cristal. <ol><li> Lavar los SRBC con 100 l de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato) /0.1% de BSA (albúmina de suero bovino) y se centrifuga (600 xg, 4 min). </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender los SRBC en 100 l de 1x PBS / 0,1% de BSA y centrifugar (600 xg, 4 min). </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender los SRBC en 1 x PBS / 0,1% BSA con IgG de conejo anti-SRBCa una concentración sub-aglutinantes. Utilizar 500 l de solución que contenía anticuerpo / 5 l de eritrocitos de cordero. Nota: La concentración sub-aglutinantes de anticuerpos corresponde a la concentración más baja que no induce aglutinación detectado como la formación de una red. En general, la concentración sub-aglutinantes es de 8,2 g / ml. <ol><li> Determinar la concentración de IgG anti-SRBC necesarios para opsonizar los SRBC mediante un ensayo de hemaglutinación. En serie diluir la IgG anti-SRBC (acciones a 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 en una microplaca. Añadir 2 x 10 6 eritrocitos de cordero en cada pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante varias horas. </li></ol></li><li> Incubar a RT durante 30 minutos con rotación lenta. </li><li> Después de dos lavados en 1X PBS / 0,1% BSA como se describe anteriormente, resuspender las SRBC opsonizadas-IgG (IgG-SRBC) en medio de microscopía libre de suero pre-calentado (2 ml / placa). </li></ol> 3. Revestimiento de poli-lisina de Cubreobjetos <ol><li> Mientras tanto, El tratamiento de los platos inferiores mm de vidrio 35 con 2 ml de 0,01% de poli-L-lisina para 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los platos dos veces con 2 ml de 1x PBS. </li></ol> 4. Fijación no covalente de los eritrocitos de cordero sobre el vidrio platos de fondo <ol><li> Verter 2 ml de suspensión de SRBC por mm de vidrio 35 plato de fondo. </li><li> Se centrifuga con un rotor que hace pivotar a 500 xg durante 2 min en placas de fondo de vidrio 35 mm. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar una vez con 2 ml de 1x PBS / 10% de BSA. </li><li> Incubar las partículas durante 30 minutos con 2 ml de 1x PBS / 10% de BSA por placa. </li><li> Lavar los platos tres veces con 2 ml de 1x PBS. </li><li> Reemplazar 1x PBS con 2 ml de pre-calentado (37 ° C) medio de microscopía libre de suero. </li></ol> 5. La fagocitosis visualizaron por TIRFM <ol><li> Microscopio Nota: TIRFM se realizó con un microscopio equipado con un objetivo de inmersión en aceite (N 100X, NA1.49), una cámara de calentamiento con CO 2, y dos cantarLe cámaras de detección de fotones EMCCD (multiplicador de electrones Charge Coupled Device) junto con una lente de 1.5X. <ol><li> El día antes de la sesión de microscopio TIRF, encender la cámara de calentamiento a 37 ° C para permitir un calentamiento homogéneo de la platina del microscopio. </li></ol></li><li> Determinación del ángulo crítico Nota: El software ImageJ Color Profiler se utiliza para procesar flujos de imágenes TIRF. <ol><li> Coloque un plato de cristal inferior 35 mm que contiene SRBC opsonizado con medio libre de suero microscopía bajo el microscopio. </li><li> Raspar las células y resuspender en el medio antes de la adición de ellos (100 - 500 l) en el plato. </li><li> Utilice el software &quot;Adquisición Live&quot; para controlar el microscopio y realizar la excitación con una nm 491 y / o un láser de 561 nm para identificar las células que expresan las proteínas etiquetadas con fluorescencia. </li><li> Identificar una célula que expresa las proteínas etiquetadas con fluorescencia. </li><li> Colocarlo en el centro del campo y adquirir 500 imedades en una longitud de onda de excitación, con diferentes ángulos a partir de 0º hasta 5º, con un incremento de 0.01º (Figura 2A). Los ángulos se cambian automáticamente por el sistema de microscopio. </li><li> Determinar el ángulo crítico permitiendo que la luz incidente se refleja totalmente en la interfase vidrio / medio y generar la onda evanescente. El uso de software ImageJ Color Profiler, abra la secuencia de imágenes haciendo clic en &quot;Archivo&quot;, &quot;Abrir&quot; y seleccione el archivo. </li><li> Seleccionar una región de interés (ROI), con la herramienta rectangular, en la célula con una fluorescencia uniforme (Figura 2B amarillo 1). </li><li> Trazar el &quot;perfil del eje Z&quot; intensidad media de fluorescencia medida en el retorno de la inversión con la función de los ángulos sobre el eje X haciendo clic en la pestaña &quot;Imagen&quot;, &quot;pilas&quot; en el menú desplegable y &quot;Lote Z-eje Perfil&quot; abajo (Figura 2B rojo 2). Nota: El ángulo crítico es el ángulo que conduce a la maximo de fluorescencia antes de una fuerte disminución de la fluorescencia. </li><li> Utilice cualquier valor del ángulo en el eje x superior a el ángulo crítico durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF como ejemplo 2.00 (Figura 2C). </li></ol></li><li> adquisiciones <ol><li> El uso de software en vivo Adquisición, configurar los parámetros de adquisición con el módulo &quot;Protocolo Editor&quot; (Figura 3A). <ol><li> Crear un protocolo con un &quot;bucle&quot; que comprende &quot;Canales&quot; Multi adquisición para adquirir la señal fluorescente de proteínas de interés en la región TIRF. Introducir el ángulo TIRF (por ejemplo 2,00), el tiempo de exposición (por ejemplo 50 ms) y la intensidad del láser (por ejemplo 50%) (Figura 3B 1). </li><li> Introducir un &quot;movimiento Z&quot; del objetivo del 3 m por encima de la región TIRF para obtener la adquisición de señales de epifluorescencia con la función &quot;Multi Canales&quot;. Introduzca un ángulo por debajo tél ángulo crítico (como ejemplo 1.00), el tiempo de exposición (50 ms) y la intensidad del láser (50%) (Figura 3B, 2 y 3). </li><li> A continuación añadimos una &quot;z movimiento&quot; del micras objetivo 3 a continuación, para volver en la región TIRF (Figura 3B 4). Añadir una &quot;instantánea&quot; de la célula en la luz brillante del LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5). </li></ol></li><li> Encuentra una célula de interés con un nivel moderado de expresión de la proteína marcada con fluorescencia que inicia la fagocitosis de SRBC mediante la extensión de la membrana plasmática alrededor de la partícula. </li><li> Colocarlo en el centro del campo. </li><li> Empezar a emitir adquisición de 500 - 1.000 marcos. En la pestaña &quot;cuenta de bucles&quot;, introduzca &quot;750 marcos&quot; (Figura 3B 1). Nota: El software ImageJ Color Profiler se utiliza para procesar flujos de imágenes TIRF. </li><li> Abrir las imágenes de la secuencia en el software Image J haciendo clic&quot;Archivo&quot;, &quot;Abrir&quot; y elegir el archivo. </li><li> Separar los canales haciendo clic en la pestaña &quot;Imagen&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; del menú desplegable y en &quot;Pila de HyperStack&quot; función. Complete la ventana que ha aparecido: Orden: xyctz; Canal (c): número de canales (por ejemplo: &quot;2&quot; si tiene dos fluorocromos); Rebanadas (z): número de cortes en el eje Z (por ejemplo: &quot;1&quot; si no hay movimiento en el eje z); Marcos (t): número de imágenes divididas por el número de canales; Modo de visualización: Escala de grises. Nota: Dos secuencias de imagen separados se generan, correspondientes a los dos canales diferentes. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptors+in+homeostasis+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptors in homeostasis and immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Scott, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+hydrolysis+directs+actin+remodeling+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis.</a> J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).</li>
<li>Schlam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+enables+phagocytosis+of+large+particles+by+terminating+actin+assembly+through+Rac%2FCdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Nat Commun. 6, 8623(2015).</li>
<li>Marion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF-kappaB+Signaling+Protein+Bcl10+Regulates+Actin+Dynamics+by+Controlling+AP1+and+OCRL-Bearing+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles.</a> Dev Cell. 23, 954-967 (2012).</li>
<li>Loovers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phagocytosis+in+Dictyostelium+by+the+inositol+5-phosphatase+OCRL+homolog+Dd5P4%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4.</a> Traffic. 8, 618-628 (2007).</li>
<li>Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+cytokinesis%3A+do+cells+use+common+tools+to+cut+and+to+eat%3F+Highlights+on+common+themes+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences.</a> Traffic. 14, 355-364 (2013).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+12%2C+Unit+12.29%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Curr Protoc Cytom. , (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li>
<li>Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-actin+cross-talk+contributes+to+phagosome+formation+and+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure.</a> Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo experimental descrito aquí propone un método inédito para seguir en tiempo real y en células vivas, con alta resolución, la formación de un fagosoma y en particular su cierre. Hay que discutir varios aspectos técnicos. En primer lugar, el ensayo es muy sensible a la temperatura. Es muy importante comprobar que la cámara de calentamiento está a 37 °C y que todos los medios, dispositivos o células se mantienen dentro de la cámara para evitar cambios de temperatura que puedan perjudicar la eficiencia de la fago...

La fagocitosis es un función de la célula importante que comienza con el reconocimiento y la unión de material a receptores de superficie, que entonces conduce a la internalización y la degradación del material ingerido. Mientras que los eucariotas unicelulares, como el moho Dictyostelium discoideum amebas y utilizan para la alimentación de la fagocitosis de las bacterias, organismos superiores han evolucionado con células profesionales. Los macrófagos o células dendríticas son la primera línea de defensa contra los patógenos en diversos tejidos y órganos, y son cruciales para activar el sistema inmune adaptativo a través de la presentación de antígenos y la producción de citoquinas 1-4. Bajo ciertas circunstancias fagocitosis se puede realizar por las células fagocíticas no profesionales, por ejemplo, células endoteliales y epiteliales. Este proceso es importante para mantener la homeostasis durante el desarrollo y en la edad adulta para recambio de tejido normal y de remodelación. fagocitos Por último, especializadas tales como células de Sertoli en los testículos o de la retinacélulas epiteliales pigmentarias son extremadamente potentes fagocitos 5. La formación de un fagosoma donde la degradación de microorganismos o restos celulares se produce comienza con la agrupación de receptores fagocíticas en la superficie de la célula fagocítica. los eventos de señalización siguientes agrupación de receptores opsónicos tales como receptores de Fc (FcR) o receptores del complemento (CRS) han sido bien caracterizados. Sin embargo, también hay numerosos receptores no opsónicos incluyendo los receptores tipo Toll (TLRs), lectinas, receptores de manosa y receptores scavenger. Estos receptores reconocen determinantes en la superficie de las partículas tales como manosa o fucosa residuos, la fosfatidilserina, y lipopolisacáridos 1,6-9. reconocimiento de patógenos o restos de células implica la unión a y la agrupación de varios tipos de receptor fagocítico, que luego conducen a la intensa y transitoria remodelación de actina. En paralelo exocitosis, focal de compartmen intracelularts contribuye a la liberación de tensión de la membrana y es importante para la fagocitosis eficaz de partículas grandes. Los eventos de señalización que conducen a la actina polimerización y la deformación de la membrana fueron disecados en modelos experimentales que han activado un único receptor de fagocitosis. Durante la fagocitosis mediada por FcR, hay una intensa polimerización de actina que se rige por las pequeñas GTPasas (Rac, Cdc42). Entre sus efectores, la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) conduce a la activación de la proteína actina-Related 2/3 compleja (Arp2 / 3) que nuclea los filamentos de actina 1,2,4,10. La producción local de, 5-bisfosfato (PI (4,5) P2) fosfatidilinositol-4 es crucial para la polimerización de actina inicial que impulsa la formación de pseudópodos. Se requiere su conversión a PI (3,4,5) P 3 para la extensión de pseudópodos y el cierre fagosoma 11. Varias vías contribuyen a la desaparición de PI (4,5) P 2. En primer lugar el desprendimiento de Kina fosfato fosfatidilinositolses (PIPKIs) del PI detenciones fagosoma (4,5) P2 síntesis. En segundo lugar, puede ser fosforilada y consumida por la clase I PI3K quinasas (PI3K) y convertido en PI (3,4,5) P 3 12. El papel de las fosfatasas y fosfolipasas también se ha implicado en el PI (4,5) P2 hidrólisis y eliminación de F-actina durante la fagocitosis en células de mamíferos y en Dictyostelium 13,14. La fosfolipasa C (PLC) δ hidroliza PI (4,5) P 2 en diacilglicerol y fosfato de tris inositol-1,4,5-. El OCRL fosfatasa PI (4,5) P 2 y PI (3,4,5) P 3 (síndrome oculocerebrorenal de Lowe) también ha sido implicado en la formación de fagosoma. formación local precisa de F-actina y su despolimerización está estrechamente regulada en el espacio y el tiempo y hemos demostrado que el reclutamiento de los compartimentos intracelulares es importante entregar localmente la fosfatasa OCRL, contribuyendo así a la despolimerización de la actina local en la base de la copa de fagocitosis <sup&gt; 13,15. Para ello, se utilizó el dispositivo experimental descrito aquí. El mecanismo y moleculares jugadores necesarios para el cierre fagosoma y escisión de la membrana aún bien definidos debido a las dificultades en la visualización y el control de la sede de cierre fagosoma. Hasta hace poco, se observó fagocitosis en células fijadas o que viven que internalizan las partículas en su cara dorsal o en sus lados, por lo que la visualización oportuna del sitio de cierre fagosoma difícil. Además, los métodos de fijación pueden provocar la retracción de las membranas y el sesgo de los resultados sobre la extensión de pseudópodos y cierre. Por el contrario, el ensayo que hemos establecido y describir aquí nos permite visualizar la extensión de pseudópodos y la etapa de cierre de la fagocitosis en células vivas 13, basado en microscopía de reflexión interna total (TIRFM) 16. Esta técnica óptico utiliza una onda evanescente para excitar fluoróforos en un área delgada en la interfaz entre un modo transparentetapa (cubreobjetos) y un (medio de cultivo celular) de líquido. El grosor de la profundidad de excitación es de alrededor de 100 nm desde la superficie sólida, que permite la visualización de los eventos moleculares cerca de la membrana plasmática. TIRFM permite una alta relación de señal a fondo, y limita la fluorescencia fuera de foco recogido y la citotoxicidad debido a la iluminación de las células. Aprovechando TIRFM, desarrollamos el &quot;ensayo de cierre fagosoma&quot; en el que los cubreobjetos se activan con poli-lisina y luego recubiertas con células rojas de la sangre opsonizadas-IgG (IgG-SRBC). Los macrófagos que expresan proteínas transitoriamente marcado con fluorescencia de interés se dejan engullir las IgG-SRBC. Mientras que las células se separan las partículas objetivo que están no covalentemente unido a la superficie del vidrio, las puntas de los seudópodos pueden ser observados y registrados en el modo de TIRF. adquisiciones TIRF se combinan con adquisiciones en el modo de epifluorescencia, después de cambiar la etapa 3 m por encima, lo que permite la visualization de la base de la copa de fagocitosis. La adición de fármacos farmacológicos tales como los que la inhibición de la actina o dynamin durante el proceso también es posible diseccionar más el proceso a nivel molecular. El protocolo se describe en detalle aquí es de una línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 y partículas opsonizadas, pero prácticamente, puede ser adaptado a cualquier otra célula fagocítica y con otros objetivos tales como perlas. Este método permitirá una mejor caracterización de la regulación en el tiempo y en el espacio de los jugadores moleculares implicados en la extensión de pseudópodos y el cierre fagosoma durante varios procesos de fagocíticas.

<table><tbody><tr><td>Glóbulos rojos anti-ovejas IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina fracción de choque térmico, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Elevador</td><td>de células Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas 4 mm</td><td>Proyecto de célula</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094 Kit de</td><td></td></tr><tr><td>electrotampón</td> a temperatura ambiente <td>Proyecto de célula</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultivo celular tratada con TC</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Generador de impulsos Gene X-cell</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Solución de gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm sin recubrimiento 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Caja</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Objetivo de inmersión en aceite (N 100X, NA1.49), cámara de calentamiento con CO2, una cámara de detección de fotón único EMCCD (Electron Dispositivo de carga acoplada multiplicadora) y una</td></tr><tr><td>solución de poli-L-lisina con lente 1.5X 0.1%</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Dilución al 0.01% en agua&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio GLUTAMAX&nbsp; Suplemento</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio, sin rojo fenol (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Glóbulos rojos de oveja (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conservado en tampón Alsever a 4 & grados; C antes de usar</td></tr></tbody></table>

&quot;fagosoma cierre de ensayo&quot; para visualizar fagosoma formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente microscopía (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

La fagocitosis es un mecanismo utilizado por células especializadas para internalizar y eliminar microorganismos o desechos celulares. Se basa en reordenamientos profundos del citoesqueleto de actina que es la fuerza impulsora para la extensión de la membrana plasmática alrededor de la partícula. Además, la absorción eficiente de material grande se basa en la exocitosis focal de los compartimentos intracelulares. Este proceso es altamente dinámico y se ha descrito que numerosos actores moleculares tienen un papel durante la formación de copas fagocíticas. Sin embargo, la regulación precisa en el tiempo y el espacio de todas estas moléculas sigue siendo difícil de alcanzar. Además, el último paso del cierre del fagosoma ha sido muy difícil de observar porque la inhibición por interferencia de ARN o mutantes negativos dominantes a menudo resulta en la formación de copas fagocíticas estancadas. 
Hemos establecido un enfoque experimental dedicado utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) combinada con epifluorescencia para monitorear paso a paso la extensión de los pseudópodos y sus puntas en un fagosoma que crece alrededor de una partícula ligeramente unida a un cubreobjetos. Este método nos permite observar, con alta resolución, las puntas de los pseudópodos y su fusión durante el cierre del fagosoma en células vivas para dos proteínas diferentes marcadas con fluorescencia al mismo tiempo.

El sistema experimental descrito en este manuscrito se representa esquemáticamente en la Figura 1. Macrófagos RAW264.7 transfectadas que expresan las proteínas de interés fusionado a una etiqueta fluorescente se colocan en contacto con ovejas opsonizado-IgG glóbulos rojos (SRBC) que se fijaron de forma no covalente en el cubreobjetos. Los macrófagos pueden separar el SRBC del cubreobjetos para envolverlo. El microscopio TIRF utilizado permite la adquisición simultánea de...

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

El objetivo general de este protocolo es visualizar la formación del fagosome, así como el sitio preciso de la fisión del fagosome en 3D, en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia por reflexión interna total, o microscopía TIRF. Este método combina la microscopía TIRF con epifluorescencia para monitorear paso a paso la localización de dos proteínas fluorescentes diferentes durante la extensión de los pseudópodos y la fusión de sus extremos. La técnica proporciona un método sistemático para determinar el ángulo crítico y obtener una señal TIRF, lo cual es fundamental para extraer conclusiones sobre los eventos cercanos a la membrana plasmática.El día anterior a la sesión con el microscopio TIRF, encienda la cámara de calentamiento a 37 grados Celsius para permitir un calentamiento homogéneo de la platina del microscopio. A la mañana siguiente, use 100 microlitros de PBS, suplementado con 0,1 % de BSA, para lavar dos veces 7x10 a la 6ª células sanguíneas rojas de oveja o SRBCs por cada placa de fondo de vidrio de 35 milímetros. Después de la segunda centrifugación, re suspenda las células en 500 microlitros de IgG de conejo anti-SRBCs, a una concentración subaglutinante, en PBS suplementado con 0,1 % de BSA por cada 5 microlitros de células, e incube las células durante 30 minutos con una rotación lenta.Al final de la incubación, lave los eritrocitos de sangre de carnero dos veces en PBS más BSA y re suspenda las células en 2 mililitros de medio de microscopía libre de suero a 37 grados Celsius por placa. A continuación, trate las placas de fondo de vidrio de 35 milímetros con 2 mililitros de poli-L-lisina al 0,1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados con 2 mililitros de PBS. Para la fijación no covalente de los eritrocitos de sangre de carnero, vierta 2 mililitros de las células opsonizadas con IGG en cada una de las placas recubiertas con polilisina y centrifugue las muestras en una centrífuga con rotor oscilante.Deseche los sobrenadantes y lave las partículas una vez con 2 mililitros de PBS más 10% de BSA. A continuación, incube las partículas con 2 mililitros de PBS fresco más 10% de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con 2 mililitros de PBS. Después del último lavado, reemplace el PBS con 2 mililitros de medio de microscopía sin suero a 37 grados Celsius.Coloque un plato recubierto con GRBS sobre la platina del microscopio. A continuación, raspe las células transfectadas de interés desde el fondo del plato de cultivo y pipetee las células varias veces para obtener una suspensión de células individuales. Añada las células transfectadas al plato recubierto con GRBS.Inicie el software de adquisición en vivo. Localice una célula que exprese las proteínas marcadas con fluorescencia y ajuste la posición del platillo para que una célula de interés quede en el centro del campo. Adquiera 500 imágenes en diferentes ángulos desde cero hasta el 5 % en incrementos de 0,01 grados, a una longitud de onda de excitación.Para determinar el ángulo crítico para que la luz incidente se refleje totalmente en la interfaz vidrio-medio y genere una onda evanescente, abra la secuencia de imágenes en el software de imagen adecuado. Seleccione una región de interés en la célula con fluorescencia uniforme. Luego, en la pestaña Imagen, seleccione Pilas y Perfil del eje Z.Para trazar el perfil del eje z de la intensidad media de fluorescencia medida en la región de interés en función de los ángulos en el eje x. Cualquier valor de ángulo en el eje x, superior al ángulo crítico, puede utilizarse entonces durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF. A continuación, en el software de adquisición en vivo, utilice el editor de protocolos para establecer los parámetros de la adquisición.Incluya el número de secuencias de adquisición de bucles, los canales fluorescentes y su intensidad de láser, el ángulo de TIRF y el tiempo de exposición. Ajuste el movimiento en Z del objetivo para alcanzar el plano del modo de epifluorescencia. Luego, en el modo de epifluorescencia, establezca el ángulo de TIRF en 1 y el movimiento en Z del objetivo de regreso al plano de TIRF.Luego, obtenga una imagen de la célula en el modo de luz brillante con LED. Ahora, busque una célula de interés con un nivel moderado de expresión de proteína marcada con fluorescencia, que esté realizando fagocitosis con un GRSE, y mueva la célula al centro del campo. Tenga en cuenta que dicha célula puede identificarse por una membrana plasmática extendida alrededor de la partícula.Introduzca el número de fotogramas en la pestaña Recuento de bucles para iniciar una adquisición continua de 500 a 1.000 fotogramas. Si es necesario, ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para adaptarse a los diferentes niveles de fluorescencia en la célula. Para generar dos secuencias de imágenes separadas correspondientes a los dos canales, abra las secuencias en el software de imagen y haga clic en la pestaña Imagen.En el menú Hyperstacks, seleccione Pila a Hyperstack. Luego, en la ventana emergente, ingrese xyctz para el Orden, el número de fluorocromos utilizados para los Canales, el número de Cortes en el eje z, el número de imágenes dividido por el número de canales en Cuadros y Escala de grises para el Modo de visualización. A continuación, separe los canales.Aquí se muestra una película representativa de microscopía TIRF en células vivas de un ensayo de cierre de fagocito en macrófagos 264.7 en crudo que internalizan un GRB opsonizado con IGG. A medida que las puntas de los pseudópodos opuestos al cubreobjetos de vidrio alrededor del GRB se acercan, se detecta un anillo de F-actina en el área TIRF que se estrecha progresivamente hasta cerrarse. Paralelamente, la señal borrosa de F-actina detectada por epifluorescencia, tras desplazar la platina tres micrómetros por encima del área TIRF, corresponde a la despolimerización en la base de la copa fagocítica.Después de tres minutos, los SRBC están totalmente internalizados, como se confirma mediante imágenes de luz transmitida. Mediante este método, se pueden demostrar los focos de actina en la base de la copa fagocítica, donde ocurre la exocitosis focal de los compartimentos intracelulares. Después de su adquisición, una célula puede procesarse adicionalmente para microscopía electrónica correlativa, o bien toda la población celular puede fijarse y congelarse para su posterior procesamiento mediante microscopía de inmunofluorescencia clásica.Es importante tener en cuenta que la fagocitosis es muy sensible a la temperatura, por lo tanto, la temperatura dentro de la cámara de calentamiento y del medio del cultivo debe mantenerse constantemente a 37 grados Celsius durante todo el procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo opsonizar partículas, recubrir cubreobjetos con las partículas, determinar los ángulos críticos para la microscopía TIRF e imaginar la localización de las proteínas de interés durante la fagocitosis en células vivas.

phagosome-closure-assay-to-visualize-phagosome-formation-three

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015). Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de...

Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos en neuronas corticales. Un marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensible al pH emite fluorescencia tras la fusión de vesículas, con excitación selectiva...

Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos 

Basado en polarización reflexión interna total microscopía de fluorescencia (pTIRFM) permite la detección en tiempo real de la dinámica de la membrana celular. En este artículo se describe la implementación del pTIRFM para el estudio de la remodelación de la membrana durante la exocitosis regulada. La técnica es generalizable a otros procesos en biología celular que directa o indirectamente implican cambios en la forma de la membrana.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Este artículo proporciona un método para investigar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma, utilizando una construcción de sinaptobrevina2-pHluorin y Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total. También se reporta la estrategia desarrollada para el procesamiento de imágenes y análisis de datos.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Aprende a visualizar la formación y cierre de fagosomas en macrófagos vivos mediante microscopía TIRF en tres dimensiones. Este método permite estudiar la dinámica de la respuesta inmune con alta resolución.

Fagosoma Cierre de ensayo para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM) (Video) | JoVE Journal

"Fagosoma Cierre de ensayo" para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Explorar más videos