"Fagosoma Cierre de ensayo" para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

El objetivo general de este protocolo es visualizar la formación del fagosome, así como el sitio preciso de la fisión del fagosome en 3D, en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia por reflexión interna total, o microscopía TIRF. Este método combina la microscopía TIRF con epifluorescencia para monitorear paso a paso la localización de dos proteínas fluorescentes diferentes durante la extensión de los pseudópodos y la fusión de sus extremos. La técnica proporciona un método sistemático para determinar el ángulo crítico y obtener una señal TIRF, lo cual es fundamental para extraer conclusiones sobre los eventos cercanos a la membrana plasmática.

El día anterior a la sesión con el microscopio TIRF, encienda la cámara de calentamiento a 37 grados Celsius para permitir un calentamiento homogéneo de la platina del microscopio. A la mañana siguiente, use 100 microlitros de PBS, suplementado con 0,1 % de BSA, para lavar dos veces 7x10 a la 6ª células sanguíneas rojas de oveja o SRBCs por cada placa de fondo de vidrio de 35 milímetros. Después de la segunda centrifugación, re suspenda las células en 500 microlitros de IgG de conejo anti-SRBCs, a una concentración subaglutinante, en PBS suplementado con 0,1 % de BSA por cada 5 microlitros de células, e incube las células durante 30 minutos con una rotación lenta.

Al final de la incubación, lave los eritrocitos de sangre de carnero dos veces en PBS más BSA y re suspenda las células en 2 mililitros de medio de microscopía libre de suero a 37 grados Celsius por placa. A continuación, trate las placas de fondo de vidrio de 35 milímetros con 2 mililitros de poli-L-lisina al 0,1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados con 2 mililitros de PBS. Para la fijación no covalente de los eritrocitos de sangre de carnero, vierta 2 mililitros de las células opsonizadas con IGG en cada una de las placas recubiertas con polilisina y centrifugue las muestras en una centrífuga con rotor oscilante.

Deseche los sobrenadantes y lave las partículas una vez con 2 mililitros de PBS más 10% de BSA. A continuación, incube las partículas con 2 mililitros de PBS fresco más 10% de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con 2 mililitros de PBS. Después del último lavado, reemplace el PBS con 2 mililitros de medio de microscopía sin suero a 37 grados Celsius.

Coloque un plato recubierto con GRBS sobre la platina del microscopio. A continuación, raspe las células transfectadas de interés desde el fondo del plato de cultivo y pipetee las células varias veces para obtener una suspensión de células individuales. Añada las células transfectadas al plato recubierto con GRBS.

Inicie el software de adquisición en vivo. Localice una célula que exprese las proteínas marcadas con fluorescencia y ajuste la posición del platillo para que una célula de interés quede en el centro del campo. Adquiera 500 imágenes en diferentes ángulos desde cero hasta el 5 % en incrementos de 0,01 grados, a una longitud de onda de excitación.

Para determinar el ángulo crítico para que la luz incidente se refleje totalmente en la interfaz vidrio-medio y genere una onda evanescente, abra la secuencia de imágenes en el software de imagen adecuado. Seleccione una región de interés en la célula con fluorescencia uniforme. Luego, en la pestaña Imagen, seleccione Pilas y Perfil del eje Z.

Para trazar el perfil del eje z de la intensidad media de fluorescencia medida en la región de interés en función de los ángulos en el eje x. Cualquier valor de ángulo en el eje x, superior al ángulo crítico, puede utilizarse entonces durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF. A continuación, en el software de adquisición en vivo, utilice el editor de protocolos para establecer los parámetros de la adquisición.

Incluya el número de secuencias de adquisición de bucles, los canales fluorescentes y su intensidad de láser, el ángulo de TIRF y el tiempo de exposición. Ajuste el movimiento en Z del objetivo para alcanzar el plano del modo de epifluorescencia. Luego, en el modo de epifluorescencia, establezca el ángulo de TIRF en 1 y el movimiento en Z del objetivo de regreso al plano de TIRF.

Luego, obtenga una imagen de la célula en el modo de luz brillante con LED. Ahora, busque una célula de interés con un nivel moderado de expresión de proteína marcada con fluorescencia, que esté realizando fagocitosis con un GRSE, y mueva la célula al centro del campo. Tenga en cuenta que dicha célula puede identificarse por una membrana plasmática extendida alrededor de la partícula.

Introduzca el número de fotogramas en la pestaña Recuento de bucles para iniciar una adquisición continua de 500 a 1.000 fotogramas. Si es necesario, ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para adaptarse a los diferentes niveles de fluorescencia en la célula. Para generar dos secuencias de imágenes separadas correspondientes a los dos canales, abra las secuencias en el software de imagen y haga clic en la pestaña Imagen.

En el menú Hyperstacks, seleccione Pila a Hyperstack. Luego, en la ventana emergente, ingrese xyctz para el Orden, el número de fluorocromos utilizados para los Canales, el número de Cortes en el eje z, el número de imágenes dividido por el número de canales en Cuadros y Escala de grises para el Modo de visualización. A continuación, separe los canales.

Aquí se muestra una película representativa de microscopía TIRF en células vivas de un ensayo de cierre de fagocito en macrófagos 264.7 en crudo que internalizan un GRB opsonizado con IGG. A medida que las puntas de los pseudópodos opuestos al cubreobjetos de vidrio alrededor del GRB se acercan, se detecta un anillo de F-actina en el área TIRF que se estrecha progresivamente hasta cerrarse. Paralelamente, la señal borrosa de F-actina detectada por epifluorescencia, tras desplazar la platina tres micrómetros por encima del área TIRF, corresponde a la despolimerización en la base de la copa fagocítica.

Después de tres minutos, los SRBC están totalmente internalizados, como se confirma mediante imágenes de luz transmitida. Mediante este método, se pueden demostrar los focos de actina en la base de la copa fagocítica, donde ocurre la exocitosis focal de los compartimentos intracelulares. Después de su adquisición, una célula puede procesarse adicionalmente para microscopía electrónica correlativa, o bien toda la población celular puede fijarse y congelarse para su posterior procesamiento mediante microscopía de inmunofluorescencia clásica.

Es importante tener en cuenta que la fagocitosis es muy sensible a la temperatura, por lo tanto, la temperatura dentro de la cámara de calentamiento y del medio del cultivo debe mantenerse constantemente a 37 grados Celsius durante todo el procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo opsonizar partículas, recubrir cubreobjetos con las partículas, determinar los ángulos críticos para la microscopía TIRF e imaginar la localización de las proteínas de interés durante la fagocitosis en células vivas.