"Fagosoma Cierre de ensayo" para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

El objetivo general de este protocolo es visualizar la formación de fagosomas, así como el sitio preciso del cisma del fagosoma en 3D, en macrófagos vivos, utilizando la Florescencia de Reflexión Interna Total, o Microscopía TIRF. Este método combina la microscopía TIRF con la epifluorescencia para monitorizar la localización paso a paso de dos proteínas fluorescentes diferentes durante la extensión del pseudópodo y la fusión de la punta. La técnica proporciona un método sistemático para determinar el ángulo crítico y obtener una señal TIRF que es crucial para sacar conclusiones sobre el cerca de la membrana plasmática.

El día antes de la sesión de microscopio TIRF, encienda la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados para permitir un calentamiento homogéneo de la platina del microscopio. A la mañana siguiente, usando 100 microlitros de PBS, suplementado con 0.1% de BSA para lavar 7x10 a la sexta oveja glóbulos rojos o SRBC por plato de 35 milímetros con fondo de vidrio dos veces. Después de la segunda centrifugación, resuspender las células en 500 microlitros de IGG de conejo anti-SRBCs, a una concentración subaglutinante, en PBS suplementado con 0,1% de BSA por 5 microlitros de células, e incubar las células durante 30 minutos con una rotación lenta.

Al final de la incubación, lavar los SRBC dos veces en PBS más BSA, y resuspender las células en 2 mililitros de medio de microscopía libre de suero a 37 grados Celsius por placa. A continuación, trate platos con fondo de cristal de 35 milímetros con 2 mililitros de lisina poli-L al 0,1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguidos de dos lavados con 2 mililitros de PBS. Para la fijación no covalente de los SRBC, vierta 2 mililitros de las células opsonizadas IGG en cada una de las placas recubiertas de polilisina y centrifugue las muestras en una centrífuga de rotor oscilante.

Deseche los sobrenadantes y lave las partículas una vez con 2 mililitros de PBS más 10% de BSA. A continuación, incubar las partículas con 2 milímetros de PBS fresco más 10%BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguidos de tres lavados con 2 mililitros de PBS. Después del último lavado, reemplace el PBS con 2 mililitros de medio de microscopía libre de suero a 37 grados centígrados.

Coloque una placa recubierta de SRBC en la platina del microscopio. A continuación, raspe las células transfectadas de interés del fondo de la placa de cultivo y pipetee las células unas cuantas veces para lograr una suspensión unicelular. Agregue las células transfectadas a la placa recubierta de SRBC.

Inicie el software de adquisición en vivo. Encuentre una célula que exprese las proteínas marcadas con fluorescencia y ajuste la posición de la placa para que una célula de interés esté en el centro del campo. Adquiera 500 imágenes en diferentes ángulos de cero a 5% en incrementos de 0,01 grados, a una longitud de onda de excitación.

Para determinar el ángulo crítico para que la luz incidente se refleje totalmente en la interfaz vidrio-medio y genere una onda evanescente, abra la secuencia de imágenes en el software de imagen adecuado. Seleccione una región de interés en la célula con fluorescencia uniforme. A continuación, en la pestaña Imagen, seleccione Pilas y Trazar perfil del eje Z.

Para trazar la intensidad de fluorescencia media del perfil del eje z medida en la región de interés con la función de los ángulos en el eje x. Cualquier valor de ángulo en el eje x, superior al ángulo crítico, se puede utilizar durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF. A continuación, en el software de adquisición en vivo, utilice el editor de protocolos para establecer los parámetros de la adquisición.

Incluyendo el número de secuencias de adquisición de bucles, los canales fluorescentes y su intensidad láser, el ángulo TIRF y el tiempo de exposición. Establezca el movimiento Z del objetivo para alcanzar el plano del modo de epifluorescencia. A continuación, en el modo de epifluorescencia, establezca el ángulo TIRF en 1 y el movimiento Z del objetivo de nuevo al plano TIRF.

A continuación, obtenga una imagen de la célula en el modo LED de luz brillante. Ahora, encuentre una célula de interés con un nivel moderado de expresión de proteínas marcadas con fluorescencia, involucrada en la fagocitosis con un SRBC, y mueva la célula al centro del campo. Tenga en cuenta que dicha célula se puede identificar por una membrana plasmática extendida alrededor de la partícula.

Introduzca el número de fotogramas en la pestaña Recuento de bucles para iniciar una adquisición de streaming de 500 a 1.000 fotogramas. Si es necesario, cambie la intensidad del láser y el tiempo de exposición para adaptarse a los diferentes niveles de fluorescencia en la célula. Para generar dos secuencias de imágenes separadas correspondientes a los dos canales, abra las secuencias en el software imagine y haga clic en la pestaña Imagen.

En el menú Hyperstacks, seleccione Apilar a Hyperstack. A continuación, en la ventana emergente, introduzca xyctz para el Pedido, el número de fluorocromos utilizados para los Canales, el número de Cortes en el eje z, el número de imágenes dividido por el número de canales en Fotogramas y Escala de grises para el Modo de visualización. A continuación, divide los canales.

Aquí, se muestra una película representativa de microscopía TIRF de células vivas de un ensayo de cierre de fagosomas en 264,7 macrófagos brutos que envuelven un SRBC opsonizado IGG. A medida que las puntas de los pseudópodos se oponen a la cubierta de vidrio alrededor del SRBC, se detecta un anillo de F-actina en el área TIRF que se estrecha progresivamente hasta cerrarse. Paralelamente, la señal borrosa de F-actina detectada por la epifluroescencia, después de desplazar la etapa tres micras por encima del área TIRF corresponde a la despolimerización en la base de la copa fagocítica.

Después de tres minutos, el SRBC está totalmente internalizado, como lo confirman las imágenes de luz transmitida. Con este método, se puede demostrar la presencia de actina en la base de la copa fagocítica, donde se produce la exocitosis focal de los compartimentos intracelulares. Después de su adquisición, una célula puede ser procesada para microscopía electrónica correlativa, o toda la población celular puede ser fijada y congelada procesada para la microscopía de inmunofluorescencia clásica.

Es importante tener en cuenta que la fagocitosis es muy sensible a la temperatura y, por lo tanto, la temperatura dentro de la cámara de calentamiento y el medio de la placa de cultivo debe mantenerse a una temperatura constante de 37 grados centígrados durante todo el procedimiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo opsonizar partículas, cubrir los deslizamientos de la cubierta con las partículas, determinar los ángulos críticos para la microscopía TIRF y obtener imágenes de la localización de proteínas de interés durante la fagocitosis de células vivas.