La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

El objetivo general de este protocolo es cuantificar las proporciones y los niveles absolutos de los transcritos de las variantes de empalme de STAT3 en eosinófilos. Este método puede abordar preguntas clave en el campo de la regulación del empalme, como la coasociación de eventos de empalme distales y la identificación de condiciones que puedan provocar diferencias en las proporciones de empalme en tándem. La principal ventaja de esta técnica es el uso de estándares de plásmido, que permiten obtener datos absolutos y relativos de qPCR, lo que nos posibilita determinar las proporciones y los niveles generales de cuatro transcritos de STAT3.

En nuestro caso, deseamos aprender cómo cambian las cuatro variantes de STAT3: S alfa, S beta, delta S alfa y delta S beta, cuando los eosinófilos son estimulados por citocinas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la composición de STAT3 en eosinófilos, también puede aplicarse a otros tipos celulares de los cuales se pueda obtener ADNc. Dado que S y delta S difieren en solo tres nucleótidos, tuvimos que sacrificar eficiencia para lograr especificidad en los estándares de cada variante.

En este protocolo, se utiliza ADNc preparado a partir de eosinófilos humanos como molde para amplificar las variantes de empalme de STAT3. Después de crear los plásmidos según se describe en el protocolo escrito, prepare reacciones de secuenciación para secuenciar plásmidos de varias colonias. Cada reacción de 20 microlitros debe contener tres microlitros de tampón para reacción de secuenciación, dos microlitros de mezcla para reacción de secuenciación, 12 microlitros de agua ultrapura, un microlitro de plásmido y dos microlitros de cebador de secuenciación.

Cuando estén disponibles los resultados de secuenciación, evalúe los electroferogramas de los plásmidos que codifican cada variante: S alfa, S beta, delta S alfa y delta S beta. Mida la concentración de ADN plasmídico puro en nanogramos por microlitro y calcule el número de copias por microlitro. Inicie este procedimiento preparando una serie de diluciones 1:10 de los plásmidos STAT3 utilizando agua ultrapura.

Con aproximadamente de 10 a la octava hasta 10 a la tercera copias por microlitro. Mida la concentración de la muestra más concentrada. Utilice los plásmidos diluidos para preparar cuatro mezclas de no blanco como controles negativos para cada variante de empalme, a 10 a la sexta copias por microlitro para cada variante.

Prepare una mezcla objetivo con concentraciones iguales de las cuatro plantillas, cada una a 10 a la sexta copias por microlitro. Prepare soluciones de pares de cebadores para cada variante de empalme con 60 microlitros de cebadores, cada uno a una concentración de siete micromolar, para obtener una concentración final de 560 nanomolar en la muestra. Diluya la polimerasa de ADN y la mezcla de colorante de unión al ADN bicatenario siete a cinco con agua pura.

Prepare el ensayo en una placa PCR de 96 pocillos siguiendo esta plantilla. Primero agregue a cada pocillo 21 microlitros de la mezcla diluida de polimerasa de ADN y colorante de unión al ADN bicatenario. Luego agregue dos microlitros de la mezcla de cebadores y dos microlitros de la plantilla.

A cada pocillo de control sin molde se le añaden dos microlitros de agua filtrada en lugar del molde. Prepare las reacciones por duplicado para evaluar la repetibilidad. Selle la placa de qPCR con una cubierta adhesiva y centrifugue durante cinco minutos a 1,200 g a 12 grados Celsius.

Encienda la máquina de qPCR e inserte la placa de qPCR sellada. Si utiliza el sistema de PCR en tiempo real de ABI, configure el experimento como se muestra. Haga clic en Archivo, Nuevo, Siguiente, seleccione Nuevo Detector, luego proporcione un nombre y elija un Reportero y un Apagador.

Configure un detector nuevo para cada variante de empalme. Seleccione Siguiente y configure los estándares según se indica en la página Configurar placa de muestras, asegurándose de que las cantidades se ingresen en la tabla y de que se seleccionen los detectores adecuados. Haga clic en Finalizar.

Configure el programa de ciclado de PCR adecuado. Asegúrese de que la lectura de fluorescencia para determinar los valores de ciclo umbral ocurra durante el paso de 72 grados Celsius de cada ciclo. Seleccione Iniciar.

Cuando finalice la corrida, haga clic en la pestaña Resultados y luego en la pestaña Gráfico de amplificación. Evalúe el gráfico de amplificación de salida para determinar la calidad de los datos. Un gráfico exponencial indica una amplificación confiable.

Exporte los resultados a un software de hoja de cálculo. El análisis de los datos, tal como se describe en el protocolo escrito, es fundamental para determinar si el ensayo requiere una optimización adicional con el fin de garantizar su reproducibilidad. El ADNc para este ensayo se prepara a partir de eosinófilos tratados con citocinas para promover la transcripción.

Prepare diluciones seriadas de dos alícuotas de ADNc muestrales con un rango de dilución de uno a uno en 1,024. Configure el ensayo en una placa de 96 pocillos con reacciones de 25 microlitros como se demostró para analizar la especificidad de los cebadores, pero con varias concentraciones de cebadores para STAT3 pan y un gen de referencia GUSB. Se muestra una plantilla en esta tabla.

Introduzca la placa PCR sellada en la máquina de qPCR. Configure el experimento utilizando el software, agregando un nuevo detector para GUSB y usando el programa de ciclado de PCR apropiado. Posteriormente, los resultados se utilizan para calcular el valor del ciclo umbral para cada muestra, como se describe en el protocolo escrito.

Para comenzar este procedimiento, compare los valores de ciclo umbral obtenidos en la qPCR relativa para el gen de referencia GUSB y diluya el ADNc en consecuencia con agua ultrapura para asegurar que todas las concentraciones estén dentro de un orden de magnitud. Prepare los ensayos de qPCR absoluta de las muestras en placas de 96 pocillos. Siga esta plantilla para S alfa y S beta y esta plantilla para delta S alfa y delta S beta.

Realice los ensayos como se indicó previamente y repita los ensayos al menos una vez. A continuación, prepare una placa de qPCR absoluta de 96 pocillos con reacciones de 25 microlitros utilizando cebadores pan-STAT3 a 400 micromolar y una mezcla de los cuatro plásmidos o un plásmido individual siguiendo esta plantilla. Selle la placa de qPCR con una cubierta adhesiva y centrifugue durante cinco minutos a 1.200 ×g a 12 grados Celsius.

Coloque la placa PCR sellada en la máquina de qPCR y configure el experimento como se indicó previamente, agregando un nuevo detector para pan STAT3. Configure los mismos parámetros de ciclado que para la qPCR relativa. Después de repetir el ensayo al menos una vez, analice los resultados según se describe en el protocolo escrito.

Unos datos de qPCR de buena calidad generarán un gráfico de amplificación sigmoideo que indica un aumento exponencial de los transcritos a lo largo de los ciclos. Estos datos se obtuvieron mediante qPCR de dos diluciones seriadas de un plásmido que contiene STAT3 S alfa. Cada par de líneas de color representa los niveles de fluorescencia de muestras duplicadas diluidas a lo largo de 40 ciclos.

Las curvas estándar generadas para los plásmidos calibradores de la plantilla indicarán la eficiencia de la amplificación. En esta curva para STAT3 S alfa, la eficiencia de amplificación fue del 83,9%. Con el fin de evaluar la congruencia de los niveles de STAT3, se midieron los valores absolutos de cada una de las cuatro variantes de empalme, así como el nivel de STAT3 total. Idealmente, tanto la regresión lineal como la pendiente deberían estar cercanas a uno.

Los datos absolutos de qPCR se presentan como gráficos de pastel para mostrar las proporciones de los cuatro variantes de empalme de STAT3 durante el tratamiento con citocinas. La combinación de los datos absolutos y relativos de qPCR demostró que los niveles de todos los variantes de empalme de STAT3 aumentaron tras la estimulación con las citocinas IL3 y TNF alfa, alcanzando su punto máximo a las seis horas. La agrupación de los datos de todos los puntos temporales reveló un sesgo pequeño pero significativo hacia la coasociación de los eventos de empalme beta y delta S.

Una vez optimizados, los ensayos basados en esta técnica pueden realizarse en cuatro horas si se llevan a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en condiciones estériles para prevenir la contaminación. Las decisiones de empalme que incluyen o excluyen un codón representan el 20 % de la variación de empalme en fase.

Nuestro protocolo debería ser fácilmente adaptable para la cuantificación de tales variaciones. Tras su desarrollo, esta técnica permitió a Mao Zhang colaborar con mi grupo y con el grupo de Li-Shan Rue para controlar experimentos de rebote tras silenciamiento de variantes de STAT3 en células de linfoma ABC. Estos experimentos demostraron que se requiere una mezcla de variantes S y delta S para la supervivencia celular en cultivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar qPCR absoluta y relativa, y de las condiciones adecuadas para distinguir y cuantificar diferencias sutiles de empalme.