La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

El objetivo general de este protocolo es cuantificar las proporciones y los niveles absolutos de las transcripciones de las variantes de empalme de STAT3 en eosinófilos. Este método puede abordar preguntas clave en el campo de la regulación del empalme, como la coasociación de eventos de empalme distal y la identificación de condiciones que pueden hacer que las proporciones de empalme en tándem difieran. La principal ventaja de esta técnica son los estándares de plásmidos que permiten la adquisición de datos absolutos y relativos de qPCR para poder determinar las proporciones y los niveles generales de cuatro transcripciones de STAT3.

En nuestro caso, queremos saber cómo cambian las cuatro variantes de STAT3 S alfa, S beta, delta S alfa y delta S beta cuando los eosinófilos son estimulados por citocinas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la composición de eosinófilos STAT3, también se puede aplicar a otros tipos de células para los que se puede obtener ADNc. Debido a que S y delta S varían en solo tres nucleótidos, tuvimos que sacrificar la eficiencia para lograr la especificidad en cualquiera de los estándares, los estándares para cada variante.

En este protocolo, el ADNc preparado a partir de eosinófilos humanos se utiliza como molde para amplificar las variantes de empalme de STAT3. Después de crear los plásmidos como se describe en el protocolo de texto, prepare las reacciones de secuenciación para secuenciar plásmidos de varias colonias. Cada reacción de 20 microlitros debe contener tres microlitros de tampón de reacción de secuenciación, dos microlitros de mezcla de reacción de secuenciación, 12 microlitros de agua ultrapura, un microlitro de plásmido y dos microlitros de cebador de secuenciación.

Cuando se disponga de los resultados de la secuenciación, evaluar los electroforetogramas de los plásmidos que codifican cada variante; S alfa, S beta, delta S alfa y delta S beta. Mida la concentración de ADN plasmídico puro en nanogramos por microlitro y calcule el número de copias por microlitro. Comience este procedimiento preparando una serie de dilución de uno en 10 de los plásmidos STAT3 utilizando agua ultrapura.

Con aproximadamente 10 al octavo a 10 al tercer ejemplar por microlitro. Mida la concentración de la muestra más concentrada. Utilice los plásmidos diluidos para preparar cuatro mezclas no objetivo como controles negativos para cada variante de empalme a razón de 10 a la sexta copia por microlitro para cada variante.

Prepare una mezcla objetivo con concentraciones iguales de las cuatro plantillas, cada una de 10 a la sexta copia por microlitro. Prepare soluciones de pares de cebadores para cada variante de empalme con 60 microlitros de cebadores, cada uno a una concentración de siete micromolares, para una concentración final de 560 nanomolares en la muestra. Diluya la ADN polimerasa, mezcla de tinte de unión al ADN de doble cadena, de siete a cinco con agua pura.

Configure el ensayo en una placa de PCR de 96 pocillos siguiendo esta plantilla. Primero agregue a cada pocillo 21 microlitros de la ADN polimerasa diluida, mezcla de colorante de unión al ADN de doble cadena. A continuación, añade dos microlitros de mezcla de cebador y dos microlitros de plantilla.

A cada pozo de control sin plantilla, agregue dos microlitros de agua filtrada en lugar de plantilla. Configure las reacciones por duplicado para evaluar la repetibilidad. Sellar la placa qPCR con una cubierta adhesiva y centrifugar durante cinco minutos a 1.200 g a 12 grados centígrados.

Encienda la máquina de qPCR e inserte la placa de qPCR sellada. Si utiliza el sistema de PCR en tiempo real ABI, configure el experimento como se demuestra. Haga clic en Archivo, Nuevo, Siguiente, seleccione nuevo Detector, luego proporcione un nombre y elija un Informante y un Extintor.

Configure un nuevo detector para cada variante de empalme. Seleccione Siguiente y configure los estándares como se le solicite en la página Configurar placa de muestra, asegurándose de que las cantidades se ingresen en la tabla y se seleccionen los detectores adecuados. Haga clic en Finalizar.

Configure el programa de ciclo de PCR adecuado. Asegúrese de que la lectura de fluorescencia para determinar los valores umbral del ciclo se produzca durante el paso de 72 grados Celsius de cada ciclo. Seleccione Ejecutar.

Una vez finalizada la ejecución, haga clic en la pestaña Resultados, pestaña Gráfico de amplificación. Evalúe el gráfico de amplificación de salida para evaluar la calidad de los datos. Un gráfico exponencial indica una amplificación fiable.

Exporta los resultados a un software de hoja de cálculo. El análisis de los datos, tal y como se describe en el protocolo de texto, es clave para saber si el ensayo requiere una mayor optimización en aras de la reproducibilidad. El ADNc para este ensayo se prepara a partir de eosinófilos tratados con citocinas para promover la transcripción.

Prepare diluciones en serie de dos alícuotas de ADNc de muestra con un rango de dilución de uno a uno en 1, 024. Configure el ensayo en una placa de 96 pocillos con reacciones de 25 microlitros, como se demostró para analizar la especificidad del cebador, pero con varias concentraciones de cebadores para pan STAT3 y un gen GUSB. En esta tabla se muestra una plantilla.

Inserte la placa de PCR sellada en la máquina de qPCR. Configure el experimento utilizando el software, añadiendo un nuevo detector para GUSB y utilizando el programa de ciclo de PCR adecuado. Posteriormente, los resultados se utilizan para calcular el valor del ciclo umbral para cada muestra, tal como se describe en el protocolo de texto.

Para comenzar este procedimiento, compare los valores del ciclo umbral obtenidos en qPCR relativa para el gen de mantenimiento GUSB y diluya el ADNc en consecuencia con agua ultrapura para asegurarse de que todas las concentraciones estén dentro de un orden de magnitud. Configure los ensayos de qPCR absoluta de las muestras en placas de 96 pocillos. Siga esta plantilla para S alfa y S beta y esta plantilla para delta S alfa y delta S beta.

Lleve a cabo los ensayos como se muestra anteriormente y repita los ensayos al menos una vez. A continuación, configure una placa qPCR absoluta de 96 pocillos con reacciones de 25 microlitros utilizando cebadores pan STAT3 a 400 micromolares y una mezcla de los cuatro plásmidos o un solo plásmido siguiendo esta plantilla. Sellar la placa qPCR con una cubierta adhesiva y centrifugar durante cinco minutos a 1.200 g a 12 grados centígrados.

Inserte la placa de PCR sellada en la máquina de qPCR y configure el experimento como se muestra anteriormente, agregando un nuevo detector para pan STAT3. Configure los mismos parámetros de ciclo que para la qPCR relativa. Después de repetir el ensayo al menos una vez, analice los resultados tal como se describe en el protocolo de texto.

Los datos de qPCR de buena calidad generarán un gráfico de amplificación sigmoidal que significa un aumento exponencial de las transcripciones en el transcurso del ciclo. Estos datos se obtuvieron a partir de qPCR de dos diluciones seriadas de plásmido que contenían STAT3 S alfa. Cada par de líneas de color representa los niveles de fluorescencia de las muestras diluidas duplicadas en el transcurso de 40 ciclos.

Las curvas estándar generadas para los plásmidos del calibrador de plantilla indicarán la eficiencia de la amplificación. En esta curva para STAT3 S alfa, la eficiencia de amplificación fue de 83.9%Para evaluar la congruencia de los niveles de STAT3, se midieron los valores absolutos de cada una de las cuatro variantes de empalme, así como el nivel de STAT3 total. Idealmente, tanto la regresión lineal como la pendiente deben estar cerca de uno.

Los datos absolutos de qPCR se presentan como gráficos circulares para mostrar sus proporciones de las cuatro variantes de empalme de STAT3 en el transcurso del tratamiento con citocinas. La combinación de datos absolutos y relativos de qPCR demostró que los niveles de todas las variantes de empalme de STAT3 aumentaron después de la estimulación con las citocinas IL3 y TNF alfa, con niveles máximos a las seis horas. La agrupación de los datos de todos los puntos de tiempo reveló un sesgo pequeño pero significativo para la coasociación de los eventos de empalme beta y delta S.

Una vez optimizados, los ensayos basados en esta técnica se pueden realizar en cuatro horas si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar en condiciones estériles para evitar la contaminación. Las decisiones de empalme que incluyen o excluyen un codón representan el 20% de la variación de empalme en el cuadro.

Nuestro protocolo debe ser fácilmente adaptable a la cuantificación de dichas variaciones. Después de su desarrollo, esta técnica permitió a Mao Zhang trabajar con mi grupo en el grupo de Li-Shan Rue para controlar los experimentos de reexpresión de STAT3 en células de linfoma ABC. Estos experimentos demostraron que se requiere una mezcla de variantes S y delta S para la supervivencia celular en cultivo.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar qPCR absoluta y relativa y las condiciones apropiadas para distinguir y cuantificar las diferencias sutiles de empalme.