Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos
28 de julio de 2016
Este protocolo describe el enriquecimiento rápido de leucocitos a partir de pequeñas muestras de sangre para una posterior determinación específica de la actividad de la peroxidasa halogenante dentro de las células. El método puede aplicarse a material humano y no humano y puede contribuir a la evaluación de nuevos marcadores inflamatorios.
El objetivo general de este método de depleción de eritrocitos es lograr un enriquecimiento rápido y sencillo de leucocitos a partir de una muestra pequeña de sangre. Muchas de las ventajas de esta técnica son que es económica, confiable y rápida. Además, puede aplicarse a muestras de sangre humana y no humana.
Antes de comenzar el procedimiento de lisis, ajuste la pipeta para la administración de agua a dos mililitros y la pipeta para el PBS a cinco mililitros. Luego coloque matraces abiertos con agua y PBS bajo una campana de flujo laminar a temperatura ambiente. Dado que la lisis hipotónica es un proceso crítico en cuanto al tiempo, todo debe prepararse previamente.
Además, el procedimiento de lisis siempre debe realizarse de la misma manera para obtener resultados compatibles. A continuación, transfiera 100 microlitros de cada muestra de sangre a un tubo cónico de 15 mililitros. Y agregue dos mililitros de agua destilada a cada muestra, mezclando en vórtex a velocidad media.
Deje reposar las células durante 60 segundos, luego agregue cinco mililitros de PBS. Mezcle las muestras mediante vortex. A continuación, recupere las células por centrifugación y deseche los sobrenadantes.
Invierta los tubos y golpee las aberturas sobre una toalla de papel para eliminar la mayor cantidad posible de líquido. A continuación, repita el procedimiento de lisis hipotónica tal como se acaba de demostrar. Después de obtener un precipitado seco por segunda vez, re-suspenda cada muestra en 500 microlitros de HBSS, hasta obtener una solución homogénea.
Y transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros sobre hielo. Para comprobar la especificidad de la peroxidasa en las muestras tras la tinción con amino fenol fluoresceína, o APF, primero agregue cinco microlitros del inhibidor de hemo peroxidasa, 4-ABAH, a las muestras correspondientes y realice una incubación de 15 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, agregue cinco microlitros de la solución de trabajo de APF a cada tubo y vortexee suavemente las células en velocidad media.
Incube todas las muestras a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, agregue cinco microlitros de la solución de trabajo de peróxido de hidrógeno a cada muestra y vortexe suavemente los tubos. Después de 60 minutos a 37 grados Celsius, centrifugue las células y retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar los pellets.
Finalmente, volver a suspender las células en 250 microlitros de HBSS y almacenar las muestras en la oscuridad hasta su análisis, para evitar el desvanecimiento por luz. Aquí se muestra un ejemplo representativo de las poblaciones de leucocitos tras la lisis hipotónica y la tinción con APF, tal como se acaba de demostrar. Al graficar el tamaño celular frente a la granularidad, puede observarse la marcada reducción de los eritrocitos, con la población de glóbulos rojos y restos celulares representando solo el 22 % de los eventos.
Además, la distribución de intensidad de la fluorescencia derivada del APF facilita una clara discriminación de los eritrocitos y linfocitos negativos para peroxidasa, con una oxidación moderada de APF observada en los monocitos y eosinófilos positivos para peroxidasa, y una oxidación robusta de peroxidasa exhibida por los neutrófilos. Una vez dominada, esta técnica puede aplicarse a hasta 50 muestras de sangre en paralelo si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción con anticuerpos, para identificar los subconjuntos celulares de interés.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los estudios con animales pequeños exploraran el papel de la actividad halogenante de la MPO y la EPO en modelos animales de enfermedades inflamatorias crónicas.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este protocolo describe un método rápido y sencillo para enriquecer leucocitos a partir de muestras pequeñas de sangre, aplicable tanto a materiales humanos como no humanos. La técnica es rentable y confiable, facilitando la evaluación de nuevos marcadores inflamatorios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Biología celular
Antecedentes
- El enriquecimiento de leucocitos es fundamental para estudiar las respuestas inmunitarias.
- Los métodos tradicionales pueden ser lentos y complejos.
- Este método tiene como objetivo simplificar el proceso.
- Puede utilizarse tanto con muestras de sangre humana como no humana.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo rápido de enriquecimiento de leucocitos.
- Evaluar la actividad de peroxidasa halogenante en leucocitos.
- Contribuir a la identificación de marcadores inflamatorios.
Métodos Utilizados
- Preparación de pipetas para la administración de agua y PBS.
- Uso de una cabina de flujo laminar para el procesamiento de muestras.
- Lisis hipotónica para la eliminación de eritrocitos.
- Ejecución del procedimiento de lisis sensible al tiempo.
Resultados principales
- Enriquecimiento exitoso de leucocitos a partir de muestras pequeñas de sangre.
- Evaluación confiable de la actividad de peroxidasa.
- Factibilidad para muestras humanas y no humanas.
- Potencial para evaluar nuevos marcadores inflamatorios.
Conclusiones
- El método es eficiente y rentable.
- Mejora el estudio de las respuestas inmunitarias.
- Investigaciones futuras pueden basarse en este protocolo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite un enriquecimiento rápido y estandarizado de leucocitos a partir de muestras pequeñas de sangre, apoyando los esfuerzos iniciales de descubrimiento en la investigación de enfermedades inflamatorias. Al cuantificar la actividad peroxidasa halogenante de la MPO y la EPO, proporciona una lectura mecanicista para la validación de dianas y la reducción de riesgos en las vías. La compatibilidad del método con la citometría de flujo y la tinción con anticuerpos facilita su integración en flujos de trabajo de cribado y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la actividad de peroxidasa específica de los leucocitos para validar la mieloperoxidasa (MPO) y la eosinófilo peroxidasa (EPO) como dianas terapéuticas en la inflamación crónica.
- Valor operativo: Requiere un volumen mínimo de muestra (50–100 µL), lo que permite muestreos repetidos en modelos animales pequeños para estudios longitudinales de interacción con la diana.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Combina la tinción con APF con citometría de flujo para generar lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia de la producción de HOCl/HOBr, facilitando la estandarización del ensayo.
- Valor operativo: Permite el procesamiento de alto rendimiento de hasta 50 muestras en paralelo, apoyando campañas de cribado escalables.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la actividad de la peroxidasa de los leucocitos con procesos inflamatorios relevantes para la enfermedad, lo que apoya la alineación de biomarcadores en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Funciona con sangre humana y de roedores, lo que permite una continuidad translacional entre especies en la validación de objetivos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, particularmente en programas de inmunología y enfermedades inflamatorias.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de la actividad peroxidásica específica de enzimas en poblaciones purificadas de leucocitos.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles mediante la fluorescencia de APF y la citometría de flujo, lo que permite evaluar el efecto de compuestos sobre la actividad peroxidásica.
- Análisis: Genera datos medibles de intensidad de fluorescencia que permiten comparar subpoblaciones de células peroxidásicas positivas (neutrófilos, monocitos, eosinófilos) en condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Relaciona la actividad peroxidásica con los mecanismos de enfermedades inflamatorias, favoreciendo la continuidad preclínica cuando se combina con la tinción de marcadores de superficie celular.
- Reutilización Empresarial: El enriquecimiento estandarizado de leucocitos y la detección basada en APF conforman una plataforma reutilizable para múltiples programas dirigidos a objetivos inflamatorios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de dianas al aislar la actividad de peroxidasa en linajes específicos de leucocitos.
- Valor operativo: Ofrece un protocolo de bajo costo y rápido que requiere un instrumental mínimo (centrífuga, vórtex, citómetro de flujo).
- Valor estratégico: Reduce los plazos de desactivación de riesgos biológicos al permitir una evaluación rápida e iterativa de la modulación de la diana en muestras de leucocitos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de inhibidores de MPO/EPO al proporcionar datos tempranos de actividad funcional obtenidos de células fisiológicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de leucocitos, citometría de flujo y química de sondas fluorescentes.
- Depende del acceso a centrífugas, vortex, campanas de flujo laminar y citómetros de flujo con canales de fluorescencia adecuados.
- Necesita la estandarización de las soluciones de trabajo de APF y peróxido de hidrógeno entre laboratorios para obtener resultados reproducibles.
- La adaptación a especies no humanas requiere la validación de la expresión de peroxidasas y la eficiencia de tinción con APF en los subconjuntos objetivo de leucocitos.
- Se limita a la detección de actividad peroxidasa halogenante; no mide otras funciones de los leucocitos a menos que se combine con ensayos adicionales.
