Name: Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a evaluar la eficacia y toxicidad de ARN dirigidos contra la producción del VIH-1 utilizando células HEK 293T. Este método permite identificar candidatos terapéuticos mediante un cribado rápido y simultáneo de múltiples diseños moleculares.

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El trabajo presentado aquí fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (otorga DCB-120266, PPP-133377 y 348967 a HBF-AG).

1. Las células y transfecciones <ol><li> Cultura células HEK 293T en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Preparar una suspensión 2 x 10 5 células / ml en el medio de cultivo celular. Añadir 500, 100 y 1.000 l de la suspensión celular a cada pocillo de 24 pocillos, placas de 96 pocillos y 12 pocillos, para la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente (Figura 2A). </li><li> Hacer girar suavemente las placas y se incuban O / N a 37 ° C con 5% de CO2. Se cultivan las células a 50-70% de confluencia. </li><li> De acuerdo con un plan de la transfección, se preparan diluciones de ARN de prueba y sus controles en tubos de 1,5 ml (micro ejemplo, la Figura 2B). <ol><li> Para el ensayo de la producción viral, preparar una 10 ng / l de dilución de un plásmido de expresión del VIH-1 y añadir 10 l a cada tubo. Siguiente preparar 5 M diluciones de ARN de ensayo y un control negativo RNA. Añadir 2,5 o 10 l de cada dilución de ARN de ensayo y de control negativo a los tubos correspondientes para 25 ó 100 nM concentraciones finales. </li><li> Para el ensayo de viabilidad celular, preparar 5 M diluciones de ARN de prueba y un 10 mg / ml de dilución de la RNA control positivo, de bajo peso molecular de poli I: C. Añadir 2 l de ARN de ensayo o diluciones de ARN de control positivo a los tubos correspondientes para 100 nM o concentraciones finales ml 200 g /, respectivamente. </li><li> Para el ensayo de la activación inmune, añadir 20 l de RNA de ensayo o las diluciones de ARN de control positivo preparados en la etapa 1.3.2. a los tubos correspondientes para 100 nM o 200 mg / ml concentración final, respectivamente. Nota: Para las pruebas de ARN plásmidos de expresión, preparar 10 ng diluciones / l en lugar de las 5 micras diluciones de ARN de ensayo, dando cantidades finales de 25 y 100 ng para el paso 1.3.1. y 100 ng para los pasos 1.3.2. y 1.3.3. </li></ol></li><li> Añadir 50, 25 o 75 l de DMEM a cada tubo para la transfección viral producción, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente. Para los ensayos de producción viral, llevar las células y los tubos de transfección preparados a un nivel 3 de laboratorio bio-seguridad (BSL3) antes del siguiente paso. </li><li> Añadir 2 l de la secuencialmente reactivo de transfección a los tubos de transfección y se incuba de 15 a 20 min para permitir que los complejos a la forma. Ver la Tabla de materiales para el reactivo de transfección específico a utilizar. </li><li> Añadir toda la mezcla de transfección de cada tubo micro gota a gota a las posiciones correspondientes en las placas de cultivo celular. Hacer girar suavemente y se incuban las placas durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> Medir el VIH-1 de producción (sección 2), la viabilidad celular (sección 3) y la activación inmune (sección 4) en las placas de cultivo celular (Figura 2C). </li></ol> 2. Ensayo de la producción viral <ol><li> Eliminar las placas de cultivo celular de 24 pocillos de la incubadora y agitar suavemente las placas en el interior del cultivo celular BSL3capucha. Transferir 150 l de sobrenadante de cada pocillo a un pocillo correspondiente en una placa de 96 pocillos de fondo plano, que se utiliza para cuantificar la producción de VIH-1. Nota: ensayos de cuantificación virales comunes incluyen la medición de la expresión de la proteína de la cápside del VIH-1 (p24) por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) 20, la cuantificación de ARN viral mediante transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 21 y la medición de la actividad de la enzima de VIH-1 RT. Los pasos 2.2 a 2.5 explicar los métodos para cuantificar VIH-1 RT actividad 13,15,16. </li><li> Transferencia de 5 l de sobrenadante a los pocillos correspondientes en una placa de 96 pocillos, que contiene 25 l de un cóctel viral interrupción 15 (Tabla 1). Incubar la mezcla durante 5 min a TA y la transferencia de la placa a una estación de trabajo radiactividad. Nota: El paso 2.2. sólo es necesario si una estación de trabajo radiactividad no está disponible en el laboratorio NBS3. Si las placas no tienen que ser retirados de laNBS3 laboratorio, continúe en el paso 2.3. y añadir 50 l de cóctel de interrupción radiactivo / viral (Tabla 1) en lugar de los 25 l de cóctel radiactivo. </li><li> Preparar un cóctel radiactiva 15 (Tabla 1), y añadir 25 l a cada pocillo de sobrenadante viral y cóctel de interrupción. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Punto 5 l de la mezcla de reacción en las casillas correspondientes en una fibra de vidrio Di Etil amino etil (DEAE) Filtermat de papel y permitir que las gotas se sequen durante 10 min. Detectar la mezcla de reacción en cada otra cuadrado, de manera que no hay dos muestras Boarder directamente entre sí. Esto ayuda a evitar el cruce entre las muestras para determinar las cuentas por minuto (cpm) en el paso 2.6. </li><li> Lavar los papeles 5X para 5 min con tampón 2x citrato de sodio salino (SSC) (Tabla 1), seguido de dos lavados de 1 min con 95% de etanol. Permitir que los papeles se sequen y sellan en bolsas de muestra. </li><li> Clip bolsas de muestras containing el papel Filtermat en un casete e inserte el cassette en un contador de centelleo de microplacas. Poner el contador a leer cpm de 32P con la fecha de referencia que establece el lote de [32P] dTTP utilizado en el experimento. Seleccione el que las muestras de leer Cómo utilizar el mapa plato y activar el contador. </li><li> Para cualquier método de cuantificación viral, dividir los valores obtenidos para cada ARN de ensayo por el control negativo adyacente y multiplicar este valor por 100 para obtener el porcentaje de inhibición de producción de VIH-1 para cada réplica de los ARN de prueba. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo a diferentes concentraciones se proporciona en la Figura 3. </li></ol> 3. ensayo de viabilidad de la célula <ol><li> Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora y se añaden 20 l de 5 mg / ml de MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio) diluido en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada pocillo. Se incuban las placas fo 3 horas a 37 ° C. </li><li> Añadir 150 ml de isopropanol acidificado con detergente (1% NP-40, HCl 4 mM en isopropanol) a cada pocillo e incubar las placas durante 2 horas a RT. </li><li> Determinar la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro de microplacas. </li><li> Calcular el metabolismo de MTT relativa para cada ARN de control positivo de la prueba y dividiendo el valor obtenido para cada muestra por su control de transfección adyacente. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo y un control positivo se proporciona en la Figura 4. </li></ol> 4. Ensayo de Activación Inmune <ol><li> Retire las placas de 12 pocillos de la incubadora y aspirar el medio de cultivo. Lavar suavemente las células dos veces con DPBS y añadir 70 l de tampón de lisis frío 22 (incluyendo inhibidores de la proteasa y de fosfatasa, la Tabla 1) a cada pocillo. Se incuban las placas durante 10 minutos en hielo. </li><li> Transferir lisados ​​celulares para microtubos y rápido congelarlos por inmersión de latubos en nitrógeno líquido. Dejar que las muestras se descongelen y se repiten durante 2 ciclos de congelación y descongelación más para un total de 3. </li><li> Centrifugar los lisados ​​durante 15 min a 4 ° C, 15.700 xg, para sedimentar los residuos celulares. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos micro y determinar la concentración de proteína usando el método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24. </li><li> Resolver 75 g de proteína de cada muestra en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y la transferencia a una membrana de nitrocelulosa como se ha descrito previamente 25,26. </li><li> Después de la electroforesis y la transferencia a una membrana, revelar bandas de proteínas mediante la incubación de la membrana en Ponceau S (Tabla 1) durante 1 min seguido de lavado en agua doblemente destilada. Usar las bandas y la escalera de proteína como una guía para cortar la membrana en 80 y 55 kDa. Nota: En el paso 4.4 muestras se pueden ejecutar en 16 x 18 cm 2 geles abajo a 34 kDa, de manera que es fácil de cortar la membrana en las posiciones especificadas y no cortar a través de labandas de interés. Por otra parte, varios geles se pueden ejecutar con las mismas muestras para evitar el corte de la membrana. </li><li> Lavar la tinción Ponceau S con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabla 1). Añadir TBST con leche no grasa al 5% para cubrir completamente las membranas. Se incuban las membranas a temperatura ambiente con agitación durante 1 hr. </li><li> Se incuban las membranas de O / N en TBST con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y los anticuerpos se diluyó a 1 en 1000 contra ADAR1 (110 y 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), y fosfo-IRF3 (47 kDa), para las piezas superior, media e inferior de la membrana, respectivamente. </li><li> Lavar las membranas 5X para 5 min con TBST y se incuban en TBST con leche 5% sin grasa y de cabra anti-conejo anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (diluido a 1 en 5000) durante 1 hora. </li><li> Lavar las membranas 5x durante 5 min con TBST y aplicar la solución de electroquimioluminiscencia (ECL) para visualizar las bandas en las películas según las instrucciones del fabricante. </li><li> Después de visualizar las bandas de proteína en las películas, lavar las piezas intermedias de la membrana durante 10 min con una solución de anticuerpo de extracción. Se incuban las membranas O / N en TBST con BSA al 3% y anticuerpos contra PKR total de (a 1 en 500) y IRF3 (a 1 de cada 1.000), por el medio y piezas inferiores, respectivamente. Repita los pasos 4.8. y 4.9. utilizando marcado con peroxidasa de cabra anti-ratón en lugar del anticuerpo secundario anti-conejo para la membrana de PKR (medio). </li><li> Lavar la pieza inferior de la membrana 5x durante 5 min con TBST y se incuba la membrana en TBST con BSA al 3% durante 1 hora con un anticuerpo contra actina (diluido a 1 en 5000). Repita los pasos 4.8. y 4.9. utilizando marcado con peroxidasa de cabra anti-ratón en lugar del anticuerpo secundario anti-conejo. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo y un control positivo se proporciona en la Figura 5. Ver la Tabla de materiales para los anticuerpos específicos para ser utilizados. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de la producción de VIH-1 descrito se realizó utilizando células HEK293T (Figura 2) y es similar a los ensayos utilizados para la detección de VIH-1 RNA de ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, siRNA 30, y ARN U1i sitios 11,31 objetivo. El uso de diferentes métodos para cuantificar la producción de VIH-1, la mayoría de estudios han medido la producción viral 48 horas después de la co-transfección de un plásmido de expresión de VIH-1 con los ARN candidatos...

Una limitación de los actuales tratamientos para el VIH-1 es que deben ser administrados crónicamente para prevenir la progresión de la enfermedad. Trasplante de VIH-1 resistentes a los linfocitos T, o células madre hematopoyéticas, tiene el potencial de proporcionar el control a largo plazo del VIH-1 de replicación en ausencia de la terapia con medicamentos 1,2 y también puede ser un enfoque eficaz para alcanzar una cura de VIH-1 3. Una forma de hacer que las células resistentes al VIH-1 de replicación es insertar uno o más genes que codifican anti-VIH-1 ARN o péptidos en células de un individuo infectado durante un trasplante autólogo 4. Varios genes candidatos anti-VIH-1 han sido diseñados con algunos ensayos clínicos que entran en combinaciones de dos o tres 5 6, para prevenir el desarrollo de resistencia del VIH-1 a un solo gen. Anti-VIH-1 ARN se encuentran entre los mejores candidatos para la terapia génica de combinación debido a su bajo potencial para provocar respuestas inmunes y porquese transcriben a partir de secuencias de genes muy cortos. Algunos ARN anti-VIH-1 se han diseñado para actuar sobre la entrada y la integración viral. Sin embargo, la mayoría de los anti-VIH-1 ARN diana pasos posteriores a la integración en el ciclo de vida viral (Figura 1). Inhibidores de la post-integración incluyen ARN señuelo, apuntando a los VIH-1 proteínas reguladoras Tat o Rev 1, y ARN antisentido basados ​​en, dirigidos a diferentes sitios en el VIH-1 ARN, como las ribozimas 7, 8 y shRNAs U1i ARNs 9. Los métodos que se han utilizado para comparar la eficacia de los anti VIH-1 ARN incluyen la supervisión de la replicación viral en las células transducidas con genes que codifican para los ARN candidatos y medición de la producción viral en células transfectadas transitoriamente con plásmidos que expresan ARN candidatos y un plásmido de expresión del VIH-1 10 -13. Hemos utilizado anteriormente un ensayo de producción de VIH-1 para detectar el VIH-1 RNA para el nuevo ribozima sitios diana 13-15. Estos métodos ya se han refinado para optimizar el formato de un ARNmolécula de interferencia expresa a partir de ADN plásmido como un shRNA o entregada como un ARNsi sintético 16. El ensayo mide la producción de virus maduros a partir de células 293T de riñón embrionario (HEK) humanos, y se puede utilizar para comparar los efectos de los inhibidores que se dirigen a pasos posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1 (Figura 1). Para inhibidores que se dirigen a los pasos de pre-integración, se necesitan ensayos alternativos, tales como un ensayo de infectividad celular TZM-bl 17 para evaluar la eficacia antiviral. Las principales preocupaciones de seguridad para la entrega de los anti-VIH-1 ARN en la clínica incluyen los posibles efectos fuera de la meta de ARN o proteínas humanas, y la activación de sensores inmune innata. Para evaluar la toxicidad de anti-HIV-1 siRNAs, hemos utilizado un ensayo de viabilidad celular en diferentes líneas celulares 16. También se midió la activación de los sensores inmunes de ARN bicatenario, ARN proteína quinasa activada por R (PKR) y Toll like receptor 3 (TLR3), así como exsión del gen de interferón estimulado, p150 ADAR1. Estos ensayos se pueden usar para confirmar que la eficacia de anti-HIV-1 ARN no se debe a efectos indirectos sobre la viabilidad celular o la activación inmune sensor. También son útiles en la exclusión de los ARN candidatos con los potenciales efectos tóxicos de un mayor desarrollo. En los siguientes protocolos, procedimientos para identificar nuevos ARN terapéuticas y optimizar el formato de los existentes se describen. Los métodos son útiles para los inhibidores de la post-integración basadas ARN de detección de VIH-1 de replicación y pueden ser adaptados a la pantalla de otros inhibidores de la post-integración, tales como pequeñas moléculas de direccionamiento Rev exportación mediada por ARN viral 18 o CRISPR / sistemas de Cas diseñados para dirigir integrada VIH-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, 96 pocillos, 24 pocillos, 6 pocillos.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Poly I:C de bajo peso molecular</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>reactivo de transfección para ARN sintético</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>reactivo de transfección para plásmidos de expresión de</td></tr> <tr>ARN<td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>plantilla de ARN poli(A)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 cebador de ADN</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE filtermat paper&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo de microplacas</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microplacas</td><td>Bio-rad 1706930</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis comprimidos tampón Roche</td><td></td><td>4693159001, 4906837001</td><td>inhibidores de la proteasa y la fosfatasa</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reactivo</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Gel cámara de funcionamiento</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Célula de transferencia semiseca</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>escalera de proteínas EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Solución de extracción de anticuerpos</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>PI32106</tr><tr><td>Anticuerpo</td><td></td><td></td> ADAR1 <td>del Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>anticuerpo phospho-T446-PKR Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>phospho-S396-IRF3</td><td>Señalización celular</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo</td><td></td><td></td> PKR <td>del Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>Anticuerpo IRF3</td><td>Señalización celular</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de actina</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Cabra con peroxidasa anti-conejo</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Cabra con peroxidasa anti-ratón</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la eficacia y la toxicidad de los arn del vih-1 orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Las terapias de ARN pequeño dirigidas a los pasos posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1 se encuentran entre los principales candidatos para la terapia génica y tienen el potencial de ser utilizadas como terapias farmacológicas para la infección por el VIH-1. Los inhibidores posteriores a la integración incluyen ribozimas, ARN de horquilla corta (sh), ARN interferentes pequeños (si), ARN de interferencia U1 (U1i) y aptámeros de ARN. Muchos de ellos se han identificado mediante ensayos de cotransfección transitoria con un plásmido de expresión del VIH-1 y algunos han avanzado a ensayos clínicos. Además de las medidas de eficacia, se ha evaluado el potencial de los ARN pequeños para afectar a la expresión de los ARN humanos, alterar el crecimiento y/o la diferenciación celular y provocar respuestas inmunitarias innatas. En los protocolos aquí descritos, se describen un conjunto de ensayos de transfección transitoria diseñados para evaluar la eficacia y la toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1. Hemos utilizado estos ensayos para identificar nuevas ribozimas y optimizar el formato de los shRNAs y siRNAs dirigidos al ARN del VIH-1. Los métodos proporcionan un conjunto rápido de ensayos que son útiles para el cribado de nuevos ARN anti-VIH-1 y podrían adaptarse para cribar otros inhibidores de la replicación del VIH-1 después de la integración.

Un esquema general de los procedimientos se muestra en la Figura 2 con un plan de transfección ejemplo para tres ARN de prueba y un ARN de control proporcionada en la Figura 2B. Para los ensayos de producción y la viabilidad celular virales, La lectura para cada construcción de prueba es normalizada a un control negativo. Las réplicas se transfectan en conjuntos, de modo que cada ARN de ensayo se normalizó a su control negativo adyacente. Esto se hace pa...

Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

El objetivo general de este procedimiento es comparar la eficacia y la toxicidad de nuevos ARN que dirigen la producción del VIH-1. Este método puede ayudar a identificar nuevas moléculas de ARN para la terapia génica o farmacológica contra el VIH-1, como ARN de interferencia cortos o ARN de horquilla cortos, ribozimas y atrayentes de ARN. La principal ventaja de esta técnica es que varios diseños nuevos de ARN pueden evaluarse simultáneamente con un tiempo de respuesta rápido.Aunque este método fue diseñado para evaluar nuevos fármacos de ARN o terapias génicas contra el VIH, también puede aplicarse a otros sistemas, como moléculas pequeñas o tareas de CRISPR. Tuvimos la idea original de este método cuando estábamos preparando experimentos para analizar un gran número de ribozimas en busca de efectos anti-VIH. Para comenzar, prepare una suspensión de células de riñón embrionario humano 293T a dos veces 10 a la quinta células por mililitro en DMEM con 10%FPS y 1%penicilina estreptomicina.Añada 500, 100 y 1.000 microlitros de la suspensión celular a cada uno de los pocillos de placas de 24, 96 y 12 pocillos para los ensayos de producción viral, viabilidad celular y activación inmune, respectivamente. Agite suavemente las placas e incúbelas durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono hasta alcanzar una confluencia del 50% al 70%. Para el ensayo de producción viral, prepare una dilución de 10 nanogramos por microlitro de un plásmido de expresión de VIH-1 y añada 10 microlitros a cada tubo de ensayo.A continuación, prepare diluciones de cinco micromolares de ARN de prueba y un ARN de control negativo. Luego, agregue 2,5 microlitros u 10 microlitros de cada dilución de ARN de prueba y del control negativo a los tubos correspondientes para obtener concentraciones finales de 25 nanomolares o 100 nanomolares. Para el ensayo de viabilidad celular, prepare diluciones de cinco micromolares de ARN de prueba y una dilución de 10 miligramos por mililitro del ARN de control positivo, poli(I:C) de bajo peso molecular. Agregue dos microlitros de las diluciones de ARN de prueba o del ARN de control positivo a los tubos correspondientes para obtener concentraciones finales de 100 nanomolares o 200 microgramos por mililitro, respectivamente.Para el ensayo de activación inmune, agregue 20 microlitros de las diluciones de ARN de prueba o de ARN de control positivo, preparadas como se indicó para el ensayo de viabilidad celular, a los tubos correspondientes para concentraciones finales de 100 nanomolares o 200 microgramos por mililitro, respectivamente. Luego, agregue 50, 25 o 75 microlitros de DMEM a cada tubo de transfección destinado a los ensayos de producción viral, viabilidad celular y activación inmune, respectivamente. Para los ensayos de producción viral, lleve las células y los tubos de transfección preparados a un laboratorio de nivel de bioseguridad tres, o BSL-3, antes del siguiente paso.Añada dos microlitros del reactivo de transfección secuencialmente a los tubos de transfección e incube de 15 a 20 minutos para permitir la formación de complejos. Añada toda la mezcla de transfección de cada microtubo gota a gota a las posiciones correspondientes en las placas de cultivo celular. Agite suavemente y luego incube las placas durante 48 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.Para realizar el ensayo de producción viral, después de retirar las placas de cultivo celular de 24 pocillos del incubador, transfiéralas a la campana de cultivo celular BSL-3. Agite suavemente las placas y luego transfiera 150 microlitros del sobrenadante de cada pocillo a un pocillo correspondiente en una placa de fondo plano de 96 pocillos que se utilizará para cuantificar la producción de VIH-1. Transfiera cinco microlitros del sobrenadante a los pocillos correspondientes en una placa de 96 pocillos que contiene 25 microlitros de un cóctel de ruptura viral.Después de incubar la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente, transfiera la placa a una estación de trabajo con radioactividad. A continuación, prepare un cóctel radiactivo y agregue 25 microlitros a cada pocillo del sobrenadante viral y del cóctel de ruptura. Incube las placas a 37 grados Celsius durante dos horas.Coloque cinco microlitros de la mezcla de reacción en los cuadrados correspondientes de una placa de filtro de fibra de vidrio/DEAE, y deje secar las manchas durante 10 minutos. Lave los papeles cinco veces con buffer 2x SSC, durante cinco minutos cada vez, seguido de dos lavados de un minuto con etanol al 95 %. Deje secar los papeles antes de sellarlos en bolsas para muestras.Corte las bolsas de muestra que contienen el papel de filtro en forma de cassette e inserte el cassette en un contador de centelleo de microplaca. Luego, inicie el contador. Para cualquier método de cuantificación viral, divida los valores obtenidos para cada ARN de prueba por el control negativo adyacente y multiplique este valor por 100 para obtener el porcentaje de inhibición de la producción de VIH-1 para cada réplica de los ARN de prueba.Para realizar un ensayo de viabilidad celular, después de retirar las placas de 96 pocillos del incubador, añada 20 microlitros de MTT al cinco miligramos por mililitro y DPBS a cada pocillo. A continuación, incube las placas durante tres horas a 37 grados Celsius. Añada 150 microlitros de isopropanol acidificado con detergente a cada pocillo e incube las placas a temperatura ambiente durante dos horas.Luego, utilice un espectrofotómetro de microplacas para determinar la absorbancia a 570 nanómetros. Calcule el metabolismo relativo de MTT para cada control positivo y ARN de prueba dividiendo el valor obtenido para cada muestra por su control de transfección adyacente. Para el ensayo de activación inmune, después de retirar las placas de 12 pocillos del incubador, aspire el medio de cultivo y use DPBS para lavar suavemente las células dos veces.Luego, agregue 70 microlitros de tampón de lisis frío que contenga inhibidores de proteasa y fosfatasas a cada pocillo e incube las placas en hielo durante 10 minutos. Transfiera los lisados celulares a microtubos y congélelos rápidamente sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Después de permitir que las muestras se descongelen, repita el ciclo de congelación-descongelación otras dos veces, para un total de tres ciclos de congelación-descongelación.A continuación, centrifugue los lisados a 15.700 ×g y 4 grados Celsius durante 15 minutos para sedimentar los restos celulares. Luego, tras la electroforesis y la transferencia a una membrana, revele las bandas proteicas incubando la membrana en Ponceau S durante un minuto. A continuación, lávela con agua doblemente destilada.Utilice las bandas y la escalera de proteínas como guía para cortar la membrana en 80 y 55 kilodalton. A continuación, use TBS con 0,05 % de TWEEN 20 o TBST para eliminar la tinción con Ponceau S. Añada TBST con 5 % de leche descremada para cubrir completamente las membranas e incúbelas a temperatura ambiente con agitación durante una hora.Transfiera las membranas a TBST con BSA al 3 % y anticuerpos diluidos 1:1.000 para ADAR, PKR fosforilado e IRF3 fosforilado para las secciones superior, media e inferior de la membrana, respectivamente. Incube a 4 grados Celsius con agitación durante la noche. A la mañana siguiente, lave las membranas con TBST cinco veces durante cinco minutos cada vez, antes de transferirlas a TBST con leche descremada al 5 % y anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo marcados con peroxidasa en una dilución de 1:5.000 durante una hora.Después de visualizar las bandas proteicas en las películas, use una solución de eliminación para lavar las partes media e inferior de la membrana durante 10 minutos, antes de incubar la parte media de la membrana en anticuerpos contra PKR y la parte inferior en anticuerpos contra IRF3. Como control positivo, detecte la membrana inferior con anticuerpos contra Actina según el protocolo descrito en el texto. A continuación se muestra un esquema general de los ensayos con un ejemplo de plan de transfección para tres ARN de prueba y un ARN de control.Para los ensayos de producción viral y viabilidad celular, la señal de cada constructo de prueba se normaliza respecto a un control negativo. Mediante el ensayo de producción de VIH-1 en células transfectadas con un plásmido que expresa la cepa NL4-3 del VIH-1, se calculó el porcentaje de actividad de la transcriptasa inversa en células co-transfectadas con uno de los siARN mostrados aquí, en comparación con células transfectadas con un siARN sin sentido sustrato largo del Dicer, con el fin de identificar la longitud óptima de las moléculas de interferencia de ARN dirigidas a un sitio conservado en el ARN del VIH-1. Utilizando los siARN más eficaces identificados, se determinó el porcentaje de metabolismo de MTT en las células transfectadas.A lo largo del ARN bicatenario, el poli(I:C) redujo la viabilidad celular solo en la dosis más alta. No se observó una reducción significativa en la viabilidad celular para los siARN dirigidos al sitio 1498 del ARN del VIH-1, independientemente de su longitud. Como se demuestra aquí mediante blot de Western, el mismo conjunto de ARN se evaluó en el ensayo de activación inmune.Bajo condiciones en las que el poli(I:C) activó la expresión de ADAR1-p150 e indujo la fosforilación de PKR e IRF3, no se observó ningún efecto significativo sobre los marcadores de inactivación para ninguno de los ARN de prueba. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete días, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar preparaciones de alta calidad de ARN y ADN para la transfección.Además, para incluir los controles negativos y positivos adecuados. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la infección por VIH de células transducidas pueden utilizarse para evaluar la eficacia y toxicidad a largo plazo de posibles candidatos anti-VIH. Tras su desarrollo, esta técnica nos permitió identificar un sitio diana accesible y conservado en el ARN del VIH y optimizar los formatos de ribozimas, shARN y siARN dirigidos contra él.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo tamizar rápidamente nuevos candidatos de ARN dirigidos a la producción del VIH para evaluar su eficacia mediante el ensayo de producción viral, y su toxicidad potencial utilizando los ensayos de activación inmune y viabilidad celular. No olvide que trabajar con el VIH y nucleótidos radiomarcados puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como utilizar laboratorios certificados de seguridad biológica y de radiactividad, al realizar este procedimiento.

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Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

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