Name: Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de Vibrio parahaemolyticus Y Otros Vibrio Especies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a evaluar un medio cromogénico novedoso para detectar Vibrio parahaemolyticus con mayor sensibilidad y especificidad que los métodos convencionales. Esta técnica mejora la seguridad alimentaria y el monitoreo microbiológico ambiental.

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Damos las gracias a M. Channey, E. Chau, y K. Tomas por su colaboración en el proyecto. El Proyecto de abastecimiento fueron financiados parcialmente por California Polytechnic State University.

1. Medios y cultivo de cepas microbianas NOTA: Use técnicas asépticas en todos los experimentos. Utilizar materiales estériles. Esterilizar todos los recipientes, herramientas y reactivos antes de su uso. Autoclave todos los materiales de desecho antes de su eliminación, ya que se consideran de riesgo biológico. temperatura del autoclave y el tiempo de combinación es ≥121 ° C x ≥15 min para todos los procedimientos siguientes. <ol><li> Para hacer ~ 1 l de agar tríptico de soja (TSA), primero agregar 1 L de agua desionizada en un matraz de 2 litros Erlenmeyer que contiene una barra de agitación magnética. Utilice un matraz que es al menos dos veces mayor que el volumen final. Añadir 30 g de polvo de caldo de soja tríptico y 20 g de agar gránulos en el matraz. NOTA: El uso agar al 2% en lugar del 1,5% para limitar el enjambre de algunas especies de Vibrio. <ol><li> Mezclar bien activando el agitador. Mientras se agita, encender la calefacción a hervir la mezcla. Retirar el matraz de la estufa tan pronto como la mezcla comience a hervir. Cubra THe matraz con un papel de aluminio. Tape el papel de aluminio para fijarlo al matraz antes de autoclave. </li><li> Para hacer caldo de soja tríptico (TSB), omita el agar de la receta en el paso 1.1. NOTA: Puede utilizar botellas en lugar de un matraz Erlenmeyer. </li><li> Para hacer agar de soja tríptico suplementado con cloruro de sodio 2% o NaCl (TSAS), añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. Para hacer caldo de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl (OSP), omitir el agar, añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. </li></ol></li><li> Para hacer agar de infusión de cerebro y corazón (BHI), suspender 37 g de polvo BHI y 15 g de gránulos de agar en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación para disolver el polvo. Autoclave. Omitir el agar para hacer caldo BHI. </li><li> Para hacer agar TCBS, suspender 89 g del polvo TCBS en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación y se deja hervir durante 1 minuto para disolver completamente el polvo. No esterilizar en autoclave. </li><li> Para todos los medios de agar, enfriar el agar caliente a 45-50 ° C en un baño de agua. Organizar placas de Petri vacías en pilas de cinco a seis placas. A partir de la parte inferior de la pila, se vierte el agar fundido en cada placa de Petri para llegar hasta la mitad. Cierre la tapa de la placa de Petri después de verter. Dejar que el agar se solidifique al permitir que las placas reposar a temperatura ambiente. <ol><li> Utilice las placas de agar al día siguiente o después de 12 horas. Almacenar las placas utilizadas en un refrigerador hasta por dos semanas. Antes de usar, eliminar los platos de la nevera y se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 15 min. NOTA: agar de un litro hace ~ 45 placas de agar. Permitir a las placas de agar se seque lo suficiente en el día de la preparación, y se equilibran a temperatura ambiente después de almacenamiento en frío para reducir eficazmente la propagación de las colonias. </li></ol></li><li> Obtener placas de agar chocolate y cromogénico y equilibrar a temperatura ambiente antes de cada experimento. </li><li> Subcultura de los 54 cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 da cada pocosys. <ol><li> Use un asa de siembra estéril para transferir las culturas a partir de una solución madre congelada o un lote anterior a los medios no selectivos como el BHI, TSB / TSA o agar chocolate. Crecer halófilas Vibrio spp. en los OSP / TSAS. </li><li> Para comprobar la pureza de la cultura, racha todas las cepas en un patrón que permita la observación de colonias aisladas. Por ejemplo, utilizar un patrón de rayas de tres fases para diluir una gran cantidad de bacterias a menor cantidad, con el tiempo produciendo colonias aisladas. </li></ol></li><li> Incubar las placas al revés a 35-37 ° C durante un máximo de 48 horas. Para Campylobacter spp., Incubar los tubos o placas en un frasco de tapa cerrado que contiene una bolsa de gas para producir un ambiente microaerofílico. Observe morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar. NOTA: Incubar todas las placas al revés para evitar que las gotas de agua condensadas formadas en la parte inferior de la tapa caiga sobre la colOnies. </li></ol> 2. Las especies Determinación por PCR <ol><li> Llevar a cabo TLH-PCR para confirmar la identidad de V. cepas parahaemolyticus. Use cebadores TLH -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GCA GAA CTG 3&#39;) y -R tlh (5 &#39;TCG ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) para amplificar un fragmento de 450 pb del gen de la hemolisina termolábil 20 . <ol><li> Use un asa de siembra estéril para transferir algunas colonias aisladas de cada V. parahaemolyticus cepa de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> culturas centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Hervir la suspensión durante 3 min para dar lisado celular. NOTA: V. parahaemolyticus es fácil de ser lisadas. Por lo tanto no se requiere reactivo de lisis. También es posible utilizar un poco de colonia directamente como la plantilla. </li><li> Realizar PCR en una reacción de 25 l-volumen. Preparar una mezcla de reacción que contiene una concentración final de 1 x tampón de PCR, 1.5 mM MgCl2, 100 mM de cada dNTP, 1 mM de cada cebador, 1 U de Taq polimerasa y 1 l de lisado celular. Después de la preincubación a 94 ° C durante 5 min, ejecute 35 ciclos de amplificación de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 60 seg 21. </li><li> alícuotas de carga de amplicón 5-l en 1,5% geles de agarosa. Encienda la fuente de alimentación para iniciar la electroforesis. Visualizar la presencia o ausencia de amplicones bajo iluminación UV después de la tinción con bromuro de etidio. </li></ol></li></ol> 3. Crecimiento en medios selectivos y diferenciales <ol><li> Dos a cuatro días antes del experimento, racha todas las cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 en medio no selectivo (TSAS, BHI o agar chocolate) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante 48 horas. Comprobar la pureza de los cultivos mediante la observación de morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar. </li><li> Transferir algunas colonias aisladas a partir del paso 3.1 en 5 ml de caldo. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas. Nota: El uso colonias jóvenes, que son menos de cuatro días de edad, para preparar cultivos de una noche en todos los experimentos. </li><li> Racha de un asa de siembra de cultivos de una noche en medios selectivos y diferenciales (TCBS y agar cromogénico) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. </li><li> Registrar el crecimiento global de todas las cepas mediante el examen tanto de la densidad de cultivo en el plato y el tamaño de las colonias aisladas. Registre el color de las colonias bajo la luz ambiental y / o UV. Tenga en cuenta otras características de la colonia aislada, como la elevación, el margen y la forma. </li></ol> 4. Ensayo de recuperación <ol><li> Seleccionar un subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abarcan diferentes serotipos y orígenes de aislamiento <shasta&gt; 22. Inocular cultivos jóvenes de las placas en 5 ml de TSB. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Llevar a cabo un método de recuento en placa estándar de los cultivos de una noche como se describe a continuación. <ol><li> Vórtice para mezclar bien los cultivos de la noche. Hacer una 10 veces o dilución 10 -1 mediante la transferencia de 100 l de cultivo de una noche en un tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. </li><li> Utilizar una punta de pipeta para transferir 100 l del tubo de dilución 10 -1 a otro tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. Esto constituye dilución 10 -2. Repita el proceso de forma secuencial para obtener una dilución 10 -7. </li><li> El uso de los 10 -4 a 10 -7 tubos de dilución, la placa de 100 l cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,. NOTA: El factor de dilución (df) de la placa se convierte en 10 -5-10 -8, respectivamente. </li><li> Difundir las alícuotas de manera uniforme en tél agar superficie. NOTA: Es muy bien utilizar el mismo esparcidor por cepa en el mismo medio, siempre que la alícuota más diluida se extiende primero (es decir, de 10 -8-10 -5). No utilice el mismo esparcidor para diferentes medios. </li><li> Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. Recuento de las colonias en las placas. Ignorar placas de apoyo colonias que son demasiado numerosos para contar (TNTC) o menor que 25. Calcular CFU / ml de acuerdo con lo siguiente: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Dónde N = el número de células en el tubo sin diluir, expresado como UFC / ml o CFU / g C = el número total de colonias contadas en las placas que dan 25-300 colonias 1 = el número de placa (s) donde las colonias contadas son de la más baja df n2 = número de placa (s) donde son colonias contadas a partir de la dilución de 10 veces subsecuente ref = factor de dilución más baja (es decir, la dilución más concentrada) </li></ol></li><li> Comparar CFU / ml entre los diferentes medios de comunicación. Utilice UFC / ml en TSAS como el 100%, se calcula el% de recuperación de V. parahaemolyticus cultiva en el agar cromogénico y TCBS. </li></ol> Ensayo 5. Competencia <ol><li> Elegir un subconjunto de cepas que muestran diferentes morfologías de colonias en el agar cromogénico y TCBS. NOTA: De esta manera, será posible contar las colonias se originaron de V. Sólo parahaemolyticus, a pesar de la presencia de otras especies en el inóculo. <ol><li> Elija una V. parahaemolyticus cepa que produce las colonias de color turquesa y cian esperados en TCBS y el agar cromogénico, respectivamente. </li><li> Elija un no V. parahaemolyticus y Vibrio una especie no que no crecen en cualquiera de estos medios, o tienen diferentes color de la colonia. NOTA: Por ejemplo, V. metschnikovii crece muy débilmente on TCBS y no creció en el agar cromogénico. Shigella sonnei no crece en TCBS pero produce colonias de color magenta en el agar cromogénico. </li></ol></li><li> Después de la selección de las cepas anteriores, preparar caldos de cultivo durante la noche utilizando colonias aisladas cultivadas en medios no selectivos. <ol><li> Hacer cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. metschnikovii mediante la transferencia de algunas colonias aisladas de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Hacer cultivos de una noche de Shigella sonnei mediante la transferencia de unas pocas colonias aisladas de agar BHI a 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li></ol></li><li> Para cada cepa, lleve a cabo una serie de dilución similar a los pasos 4.2.1 y 4.2.2. Placa de diluciones apropiadas sobre TSAS o BHI para determinar CFU / ml de cultivo de una noche, utilizando la ecuación de muestra en el paso 4.2.5. NOTA: Por lo general, 100 l de la dilución 10 -5 a la 10 -7tubos de obras para la mayoría de las culturas. Utilice los valores de UFC / ml para respaldar calcular la cantidad exacta de las células utilizadas en el siguiente paso. Los valores de UFC / ml calculados se obtienen después de la incubación, aunque los pasos siguientes se llevan a cabo en la misma fecha que la Etapa 5.3. </li><li> El uso de los cultivos de la noche y los tubos de dilución en los pasos 5.2 y 5.3, mezclar diferentes cantidades de una V. cepa parahaemolyticus y un no V. especies parahaemolyticus. Por ejemplo, la mezcla de 500 l de la tubo de dilución 10 -5 de V. parahaemolyticus con 500 l de los cultivos de una noche de V. metschnikovii. NOTA: Esta mezcla simula alto fondo microflora. Para simular un fondo bajo microflora, mezclar 500 l cada uno del tubo de dilución 10 -5 de ambas especies. </li><li> Spread 100 l de la mezcla de cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,. </li><li> Después de la incubación a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas, contar las colonias de V. parahaemolyticus y la no V. especies parahaemolyticus con base en su diferencia en el crecimiento y la morfología de las colonias en el agar cromogénico y TCBS. NOTA: Por ejemplo, si la no V. parahaemolyticus especies no crecen en el agar cromogénico y TCBS, todas las colonias serán de V. parahaemolyticus. Si la no V. parahaemolyticus especie crece en ambos medios, sólo las colonias de color turquesa en colonias TCBS y cian en agar cromogénico serán de V. parahaemolyticus. La no V. especies parahaemolyticus pueden o no pueden exhibir la morfología de colonia similar a V. parahaemolyticus en TSAS. <ol><li> Si la no V. especies parahaemolyticus crece de manera similar a V. parahaemolyticus en este medio no selectivo, divida el recuento de colonias por dos para obtener el número de V. parahaemolyticus solamente. Comparar el recuento de colonias real con la frecuencia esperada derivada del Paso 5.3. </li></ol></li></ol> 6. EFFECTS de Oyster Los homogeneizados <ol><li> Pesar ≥50 g de carne de molusco ≥12 moluscos incluida la carne y el licor. <ol><li> Añadir la misma cantidad de PBS a la carne de la ostra y el licor. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 90 seg. Esto constituye el 2 -1 diluida homogeneizado de ostras. </li><li> Añadir 100 g de 2 -1 homogeneizado ostra diluido a 400 g de PBS. Utilice una escala para medir el peso, no por volumen. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 1 min. Autoclave el homogeneizado de ostras. NOTA: Este será el homogeneizado de ostras utilizado para clavar. </li></ol></li><li> Repetir el ensayo de recuperación (Paso 4) en presencia de homogeneizado de ostras. <ol><li> Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l de V. parahaemolyticus cultivos de una noche cultivados en TSB a ella. Determinar la cantidad real de V. parahaemolyticus células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2. </li></ol></li><li> Repscomer el ensayo de la competencia (Paso 5) en presencia de homogeneizado de ostras. <ol><li> Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l cada uno de los cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. no parahaemolyticus a ella. Determinar la cantidad real de bacterias Las células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2 </li></ol></li><li> Mezclar las células bacterianas con homogeneizado de ostras bien mediante el uso de un homogeneizador. NOTA: Después de mezclar, el homogeneizado de ostra que contiene las células añadidas intencionadamente se llama claveteado homogeneizado de ostras. </li><li> Hacer diluciones del homogeneizado de ostras de púas para obtener 10 -1 a 10 -3 tubos de dilución de acuerdo con los procedimientos descritos en la etapa 4.2.2. Spread 100 l de cada dilución en el cromogénico TCBS y TSAS agar,. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. </li><li> Comparar el recuento de colonias en agar cromogénico real y TCBS con el exse sospecha vienen del recuento de colonias deduce de Pasos 6.2.1 y 6.3.1. NOTA: Por ejemplo, si un tubo de V. parahaemolyticus cultivo durante la noche contiene 10 8 CFU / ml, un inóculo de 100 l significa que 10 7 células se añaden a la 500-g de homogeneizado de ostras, produciendo 5 x 10 4 células / g. Después de la dilución y de las planchas, teniendo la placa df = 10 -2 debería producir 500 colonias; mientras que el tener df = 10 -3 debería producir 50 colonias. Estos son los recuentos de colonias esperados. </li></ol>

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</ol>

Algunos medios fueron proporcionados generosamente por Hardy Diagnostics, Santa María, CA. Thorsen realizó este estudio mientras estudiaba en la Universidad Estatal Politécnica de California. Actualmente es empleado de Hardy Diagnostics.

Este estudio se centra en el desarrollo de medios de cultivo y evaluación. Convencionalmente, el TCBS es selectivo y diferencial medio utilizado para el aislamiento y la detección de V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. 12 vulnificus. Sin embargo, se ha informado de limitaciones para este medio, tales como la incapacidad para diferenciar V. cholerae de otras especies de Vibrio. La sacarosa y el indicador de pH son los agentes de diferenciación de TCBS. Por lo tant...

Como miembro del género Vibrio, V. parahaemolyticus es una bacteria Gram-negativas, no formadoras de esporas, curvada, en forma de barra. Se presenta una alta movilidad en ambos ambientes líquidos y semisólidos. La mayoría V. parahaemolyticus cepas no son patógenos para los seres humanos, sin embargo, los subtipos patógenos han causado epidemias y pandemias, por lo tanto, esta especie se considera que es un importante patógeno de transmisión alimentaria en muchos países 1,2. La incidencia de la infección por Vibrio en los EE.UU. ha mostrado una tendencia al alza desde el año 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus es la especie más frecuentemente reportado que causan enfermedades en los EE.UU. 4,5. Otras especies clínicamente relevantes incluyen V. Alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Un pequeño porcentaje de las enfermedades es causada por múltiples especies simultáneamente. V. parahaemolyticus es una i naturalesnhabitant de agua marina y, por tanto, ampliamente distribuido en aguas marinas en todo el mundo, incluyendo los estuarios. La especie fue descubierta en 1950 después de un brote de intoxicación alimentaria en Japón. En los EE.UU., la especie fue aislada por primera vez en el agua de mar, sedimentos y moluscos en la región de Puget Sound 6,7. Filtradores en los hábitats marinos, como los moluscos bivalvos, pueden albergar V. parahaemolyticus como parte de su flora natural 8. Como tal, V. infecciones parahaemolyticus en humanos a menudo están relacionados con el consumo de mariscos contaminados, especialmente los mariscos crudos o poco cocidos. Una ruta menos común de entrada se produce cuando herida abierta se expone al agua del mar, lo que lleva a una infección cutánea. La mayoría V. cepas parahaemolyticus no causan enfermedad en humanos, sin embargo, ciertos subtipos que albergan los factores de virulencia como hemolisina directa termoestable (TDH) son patógenas. Los síntomas más frecuentes de transmisión alimentaria V. infección son parahaemolyticusdiarrea y dolor abdominal, seguido de náuseas, vómitos y fiebre. También se informa de dolor de cabeza y escalofríos. El período de incubación promedio es de 15 horas, pero puede ser de hasta 96 horas después del consumo de una cantidad suficiente de cepas patógenas 9. La enfermedad dura de dos a tres días. Los síntomas de la gastroenteritis causada por V. parahaemolyticus son en gran medida auto-limitante y, por tanto, un tratamiento especial no es necesario. Los casos leves de gastroenteritis pueden ser tratados eficazmente mediante rehidratación oral. Más enfermedades graves se pueden tratar con antibióticos tales como la tetraciclina o la ciprofloxacina 10. La tasa de mortalidad es de alrededor del 2% de los casos de gastroenteritis, pero puede ser tan alta como 29% para aquellos que desarrollan infección del torrente sanguíneo o septicemia. Cualquier persona que consume mariscos o tiene una herida abierta expuesta al agua de mar está en riesgo de V. infección parahaemolyticus. La forma más grave de enfermedades, septicemia que amenaza la vida, es más común en una subpoblación con co médico subyacentenditions 11, que incluyen el alcoholismo, enfermedad hepática, diabetes, enfermedad renal, enfermedad maligna, y otras condiciones que conducen a una respuesta inmune debilitado. Cabe destacar que este grupo de personas es también un riesgo mayor de contraer enfermedades graves causadas por V. vulnificus, que se puede encontrar en los hábitats naturales similares a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus se aísla de forma rutinaria usando agar sales de sacarosa tiosulfato-citrato-biliares (TCBS) como un medio selectivo y diferencial. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina puede preceder el aislamiento en agar TCBS. presuntas colonias en TCBS se prueban aún más en una serie de pruebas bioquímicas y / o ensayos moleculares dirigidas a la presencia de genes específicos de cada especie. Métodos basados en PCR se utilizan a menudo para confirmar la identidad de V. parahaemolyticus mediante la amplificación del gen de la hemolisina termolábil, tlh 12. Independientemente de la choice de los métodos de confirmación, es importante tener un medio eficaz para aislar y diferenciar V. parahaemolyticus de otros vibrios marinos en el primer lugar. TCBS rutinariamente se ha utilizado para diferenciar las especies dentro del género Vibrio, según su capacidad para fermentar la sacarosa 12. Reacción de fermentación positiva se acompaña de un cambio de color del indicador de pH de bromotimol azul. V. colonias parahaemolyticus son bastante distintiva en TCBS, exhibiendo color de azul a verde. Sin embargo, este medio no puede diferenciar fácilmente V. alginolyticus y V. cholerae. especies de Proteus sacarosa-fermentación pueden producir colonias de color amarillo que se asemejan V. V. cholerae o Alginolyticus 13. El aislamiento inicial en TCBS, V. parahaemolyticus también se han identificado erróneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, y Pseudomonas spp 14. Las cepas con ferm sacarosa retardadaentación puede ser confundida con otra sacarosa no fermentadores Vibrio 13, que incluye V. parahaemolyticus. TCBS se encontró que no es sensible frente a Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, entre otros. Varias otras especies producen colonias verdes a grises que son potencialmente confundirse con V. V. parahaemolyticus o 15 vulnificus. Como resultado de ello, es deseable desarrollar medios de cultivo alternativa con mejor sensibilidad y especificidad hacia la detección y el aislamiento de V. parahaemolyticus y otras especies estrechamente relacionadas. Varias alternativas de medios de comunicación se han desarrollado recientemente. Además de la inclusión de agentes selectivos, la mayoría incorporan sustratos cromogénicos para diferenciar especies en base a sus actividades enzimáticas diferenciales. Por ejemplo, indoxilo-β-glucósido y de indoxilo-β-galactósido se han utilizado como los sustratos cromogénicos para diferenciar V. paracahaemolyticus colonias (que aparecen de color verde azulado) de las de V. cholerae (púrpura) debido a sus capacidades diferenciales para producir β-glucosidasa y β-galactosidasa 16. Diferentes formulaciones de agar cromogénico desarrolladas por varios grupos han sido evaluados y se informó para llevar a cabo de forma comparable a o mejor que TCBS 17,18,19. Una ventaja de usar un medio cromogénico es que la coloración del medio circundante es mínimo lo que facilita el aislamiento de colonias particulares. En este estudio, se evaluó la capacidad de un medio cromogénico de nueva formulación para detectar y aislar V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus; con un enfoque especial en su capacidad para diferenciar V. parahaemolyticus de otras especies.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo/Equipo</agar fuerte></td> Fisher Scientific DF0140-15-4 puede usar otras marcas Autoclave Cualquier polvo de BHI Fisher Scientific DF0418-17-7 puede usar otras marcas Blender Any para mezclar carne de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ostra</td>CampyGen gas <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td>generador Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>para proporcionar una atmósfera microaerofílica; puede utilizar otras marcas</td></tr><tr><td>Placas de agar chocolate</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>puede utilizar otras marcas</td></tr><tr><td>Reactivos comunes de PCR (dNTPs, MgCl2, Taq Polimerasa)</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>o utilizar perlas de PCR (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>puede utilizar otras marcas</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>puede utilizar otras marcas</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de agar HardyChrom Vibrio Hardy</td><td>Diagnostics</td><td>G319</td><td>Este estudio evalúa este medio</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bucles de inoculación</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>En este estudio se utilizó un tamaño de 10 microlitros NaCl</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>puede usar otras marcas</td></tr><tr><td>Ostras</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>puede usar otras marcas</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>puede usar otras marcas</td></tr><tr><td>Pipeta y puntas</td><td>Cualquier</td><td></td><td>punta esterilizada</td></tr><tr><td>Imprimadores para tlh</td><td>IDT</td> Escala de ADN <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>esparcidor</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>Se pueden usar perlas en su lugar</td></tr><tr><td>Batidora</td><td>Stomacher Stomacher</td><td>400</td><td>Las muestras se homogeneizaron a 200 rpm durante 30 segundos. Se puede utilizar otro homogeneizador.</td></tr><tr><td>Bolsas de filtro estériles para licuadoras</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS polvo</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>Este estudio evalúa este medio</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polvo TSB</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>puede utilizar otras marcas</td></tr><tr><td>Gabinete de visualización UV</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Emitir luz</td></tr> <tr>UV de onda larga<td>Baño de agua</td><td>Any</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Fuentes</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Especies y cepas bacterianas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aeromonas hydrophila</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Candida albicans</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Proteus mirabilis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salmonella Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Shigella boydii</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Shigella flexneri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Shigella sonnei</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrio alginolyticus</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. cholerae (los serotipos incluyen O139, O1, non O1, El Tor biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. damsela</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. fisheri</td><td>Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. fluvialis</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. furnissii </td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. hollisae</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. metschnikovii</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. mimicus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. parahaemolyticus (los serotipos incluyen O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Medio Ambiente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. proteolyticus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. vulnificus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; vibrio parahaemolyticus</em&gt; y otros<em&gt; vibrio</em&gt; especies

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Infecciones transmitidas por los alimentos en los EE.UU. causada por especies de Vibrio han mostrado una tendencia al alza. En el género Vibrio, V. parahaemolyticus es responsable de la mayoría de las infecciones -asociado Vibrio. Por lo tanto, la diferenciación precisa entre Vibrio spp. y la detección de V. parahaemolyticus es de vital importancia para garantizar la seguridad de nuestro suministro de alimentos. Aunque las técnicas moleculares son cada vez más comunes, métodos de cultivo a dependiendo todavía de forma rutinaria hecho y que se consideran métodos estándar en determinadas circunstancias. Por lo tanto, un nuevo medio de agar cromogénico fue probado con el objetivo de proporcionar un mejor método para el aislamiento y la diferenciación de Vibrio spp clínicamente relevante. El protocolo compara el límite de sensibilidad, especificidad y de detección para la detección de V. parahaemolyticus entre el nuevo medio cromogénico y un medio convencional. Varios V. parahaemolyticus cepas (n = 22) de reSe han usado presentar diversos serotipos y de la fuente de origen. Ellos fueron identificados previamente por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), y verificado aún más en nuestro laboratorio por TLH-PCR. En por lo menos cuatro ensayos separados, estas cepas se inocularon en el agar y tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa cromogénicos (TCBS) de agar, que es el medio recomendado para el cultivo de esta especie, seguido de incubación a 35-37 ° C durante 24 h -96. Tres V. parahaemolyticus cepas (13,6%) no crecieron de manera óptima en TCBS, no obstante, exhibieron colonias de color verde si había crecimiento. Dos cepas (9,1%) no dieron los esperados cian colonias en el agar cromogénico. V. no cepas parahaemolyticus (n = 32) también se probaron para determinar la especificidad de la agar cromogénico. Entre estas cepas, 31 no crecieron o exhibieron otras morfologías de colonias. La recuperación media de V. parahaemolyticus en el chromogenic agar fue de ~ 96,4% en relación con agar de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl. En conclusión, el nuevo agar cromogénico es un medio eficaz para detectar V. parahaemolyticus y para diferenciarlo de otros vibrios.

En este estudio, 54 cepas microbianas fueron ensamblados, que incluyó 22 cepas dentro de la V. especies parahaemolyticus, Vibrio otras 19 especies, y 13 especies de Vibrio no (Tabla 1). La mayoría V. cepas parahaemolyticus se recibieron ya sea de la FDA, CDC u otros departamentos de salud estatales. Representan diversos serotipos y fuentes de aislamiento. Estas cepas fueron identificadas previamente por los organismos...

La detección y el aislamiento de especies de Vibrio clínicamente relevantes requieren medios de cultivo selectivos y diferenciales. Este estudio evaluó la capacidad de un nuevo medio cromogénico para detectar e identificar V. parahaemolyticus y otras especies relacionadas. Se encontró que el nuevo medio tenía mejor sensibilidad y especificidad que el medio convencional.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la sensibilidad y especificidad de un nuevo medio cromogénico para detectar y aislar Vibrio parahaemolyticus en comparación con medios convencionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología de alimentos y ambiental, como por ejemplo, ¿cuál es la prevalencia de especies de Vibrio en alimentos y en ambientes de recolección? La principal ventaja de nuestro procedimiento es que se pueden utilizar muchos aislados bacterianos, incluso en presencia de una matriz alimentaria.Antes de cultivar las bacterias, esterilice en autoclave todos los medios de agar. Luego enfríe el agar a 45-50 grados Celsius en un baño de agua. Cuando el agar esté listo, coloque placas de Petri vacías en pilas de cinco a seis placas.Luego, comenzando desde la parte inferior de la pila, vierta el agar fundido en cada placa hasta que esté aproximadamente a la mitad, reemplazando las tapas después de verter. Deje que el agar solidifique a temperatura ambiente durante al menos 12 horas. Para preparar los cultivos de cepas microbianas, cuando el agar esté listo, utilice un asa de inoculación estéril para transferir los cultivos a las placas de agar no selectivo apropiadas, rayando las bacterias en un patrón que permita la observación de colonias aisladas.Una vez que se hayan sembrado todas las colonias, incubar los cultivos boca abajo a 35-37 grados Celsius durante un máximo de 48 horas, excepto para las especies de Campylobacter, que deben incubarse en un frasco con tapa cerrada que contenga una bolsa de gas para crear un ambiente microaerofílico. Observar la morfología de las colonias al final de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que presenten una morfología similar.Para hacer crecer las colonias de interés en medios selectivos y diferenciales, transfiera algunas colonias aisladas a cinco mililitros del caldo apropiado y vuelva a incubar los cultivos a 35-37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Al día siguiente, raye con un asa una porción de los cultivos nocturnos en al menos una placa de agar Thiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa, o TCBS, y en al menos una placa de agar cromogénico, e incube hasta por 96 horas a 35-37 grados Celsius. Al final de la incubación, examine tanto la densidad del crecimiento en la placa como el tamaño de las colonias aisladas para determinar el crecimiento general de las cepas, registre el color de las colonias a luz ambiente o UV, según corresponda, y anote cualquier otra característica importante de las colonias.Para realizar un ensayo de recuperación, inocule cultivos jóvenes de Vibrio parahaemolyticus en cinco mililitros de caldo de soya triptica, suplementado con dos por ciento de cloruro de sodio, o TSBS, y coloque los tubos a 35-37 grados Celsius durante 16-24 horas. Al día siguiente, agite los cultivos nocturnos mediante vortex y prepare diluciones de uno por 10 a la menos uno hasta uno por 10 a la menos siete de las bacterias en PBS. Utilizando las diluciones de uno por 10 a la menos cuatro hasta uno por 10 a la menos siete, plaque uniformemente 100 microlitros de cada dilución en placas individuales de agar cromogénico, TCBS y agar de soya triptica suplementado con dos por ciento de cloruro de sodio, o TSAS.Incubar todas las placas a 35-37 grados Celsius durante un máximo de 96 horas. Luego, contar las colonias, ignorando las placas que presentan colonias en número demasiado elevado para contar o que contienen menos de 25 colonias. Para realizar un ensayo de competencia, seleccionar una cepa de V. Parahaemolyticus que produzca colonias turquesa esperadas en TCBS y colonias cian en agar cromogénico, y una no-V.Especies de Parahaemolytius que no crece en ninguno de los medios o que presenta un color de colonia diferente. Transfiera algunas colonias aisladas de V. Parahaemolyticus y V. Metschnikovii de un agar TSAS a cinco mililitros de TSBS para una incubación de 16 a 24 horas a 35-37 grados Celsius. Transfiera algunas colonias aisladas de Shigella sonnei de agar Infusión Cerebro Corazón, o BHI, a cinco mililitros de caldo BHI durante 16 a 24 horas a 35-37 grados Celsius.Al día siguiente, realice una dilución seriada para cada cepa, sembrando las diluciones en placas de agar no selectivo para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro de los cultivos nocturnos. A continuación, utilice los cultivos nocturnos y los tubos de dilución para mezclar diferentes volúmenes de una cepa de V. parahaemolyticus y una especie no V. parahaemolyticus, y extienda 100 microlitros de la mezcla bacteriana sobre placas individuales de agar cromogénico, TCBS y TSAS.Después de hasta 96 horas a 35-37 grados Celsius, cuente las colonias según sus diferencias en crecimiento y morfología en las placas cromogénicas y TCBS. Para evaluar los efectos de los homogenatos de ostra sobre el crecimiento bacteriano en medios selectivos y diferenciales, primero pese al menos 50 gramos de carne de ostra de al menos 12 moluscos, incluyendo la carne y el líquido. Luego, agregue una masa igual de PBS a los tejidos de ostra y mezcle la mezcla a alta velocidad durante 90 segundos.A continuación, agregue 100 gramos del homogenato de ostra diluido a 400 gramos de PBS y mezcle la solución a alta velocidad durante un minuto. Luego, esterilice el homogenato en autoclave. Después de enfriar, agregue 100 microlitros de cada cultivo de V. Parahaemolyticus y no-V.Agregue el cultivo de Parahaemolyticus a la suspensión de ostras y utilice un homogeneizador para mezclar las células bacterianas con el homogenato de ostra. Prepare diluciones de uno por diez a la menos uno hasta uno por diez a la menos tres del homogenato de ostra enriquecido en PBS, como se muestra, aplicando 100 microlitros de cada dilución en placas individuales de cromogénico, TCBS y TSAS. Después de 96 horas a 35-37 grados Celsius, compare los conteos reales de colonias en los geles cromogénico y TCBS con los conteos esperados deducidos del recuento estándar de placas realizado en los cultivos de sobrenoche.Para determinar el crecimiento y la morfología de las colonias de las cepas utilizadas en este estudio, las bacterias se cultivaron en medios selectivos y diferenciales. El TCBS es el medio convencional utilizado para el aislamiento de algunas especies de Vibrio, incluyendo V. Parahaemolyticus de color turquesa y V. Cholerae de color amarillo. El uso de un medio cromogénico para seleccionar especies de Vibrio clínicamente relevantes a partir de muestras alimentarias y ambientales da como resultado la formación de colonias de V. Parahaemolyticus de color cian y V. Cholerae de color magenta.Se observan colonias de V.Parahaemolyticus cultivadas en placas de agar cromogénico en presencia de homogenato de ostra en números similares a los obtenidos en medios no selectivos, lo que sugiere que el límite de detección del medio cromogénico es comparable al de los medios no selectivos, incluso en presencia de una matriz alimentaria. Tampoco se ve afectado el crecimiento y recuperación de V.Parahaemolyticus por la presencia de una especie no V. Parahaemolyticus, una característica esencial para medios diferenciales y selectivos, ya que las muestras ambientales contienen diversas especies de Vibrio en altos números, especialmente tras un procedimiento de enriquecimiento.Además, la comparación entre los agar TCBS y los agar cromogénicos mediante PCR de hemolisina termolábil revela una mayor sensibilidad y especificidad para el agar cromogénico, lo que indica un mejor desempeño general de este medio diferencial y selectivo para la detección e identificación de V. parahaemolyticus. Una vez dominado, todo el procedimiento, incluyendo las pruebas y los tiempos de incubación de aproximadamente 50 cepas, puede completarse en un plazo de 30 días si se realiza adecuadamente. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar etiquetar cuidadosamente todas las culturas y utilizar técnicas asépticas en todo momento.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR de colonia para responder preguntas adicionales, como, ¿Lleva este aislado específico un gen de virulencia? Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la seguridad alimentaria y la salud pública exploraran la detección de especies de Vibrio en mariscos y en el ambiente estuarino. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un recuento estándar en placa y de cómo evaluar la sensibilidad, especificidad y límite de detección de un medio de crecimiento.No olvide que trabajar con patógenos y medio caliente puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar ropa protectora, cubrir cualquier herida abierta y separar los desechos biopeligrosos al realizar este procedimiento.

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

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Fuente: Heering, J., et al., Inducción de diferenciación celular e imágenes unicelulares de células nadadoras y enjambres de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017).Este video demuestra la preparación de células de enjambre de una colonia de Vibrio parahaemolyticus para imágenes de fluorescencia. Las bacterias están diseñadas genéticamente para expresar una proteína marcada con fluoróforo que se localiza unipolarmente en las células nadadoras y bipolarmente en las células de enjambre...

Preparación de células de enjambre de Vibrio parahaemolyticus para imágenes

Fuente: Yeung, M., et al. Desarrollo de un medio de agar cromogénico más sensible y específico para la detección de Vibrio parahaemolyticus y otras especies de Vibrio . J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra un método basado en cultivos para identificar especies de Vibrio , destacando el agar cromogénico como una alternativa más precisa al agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa o TCBS de uso común. El agar cromogénico proporciona una diferenciación superior de las cepas de Vibrio al...

Un nuevo medio cromogénico para la detección rápida de especies de Vibrio

Fuente: Brumfield, K. D., et al., Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar biotipos de aislados clínicos y ambientales de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demuestra la prueba Voges-Proskauer (VP) para diferenciar entre tres biotipos de Vibrio cholerae: clásico, tipo salvaje El Tor y variante El Tor. Cada cultivo se inocula en un medio que contiene glucosa, se incuba y se trata con α-naftol e hidróxido potásico para detectar la presencia de acetoína. Un...

Ensayo Voges-Proskauer para la diferenciación de biotipos de Vibrio cholerae

Aquí se presenta un protocolo que implica la concentración integrada, el enriquecimiento y la detección colorimétrica de puntos finales de patógenos transmitidos por los alimentos en grandes volúmenes de agua agrícola.  El agua se filtra a través de hisopos de Moore modificados (MMS), enriquecidos con medios selectivos o no selectivos, y la detección se realiza mediante dispositivos analíticos basados en papel (μPAD) incrustados con sustratos colorimétricos indicativos de bacterias.

Colorimétrico Papel a base de Detección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp,. Y<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; De grandes volúmenes de agua en la agricultura

Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio.

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Aislados Clínicos y Ambientales

Este protocolo permite la microscopía monocelular de los nadadores diferencialmente distintos de Vibrio parahaemolyticus y células swarmer. El método produce una población de células swarmer fácilmente disponibles para el análisis de células individuales y cubre la preparación de cultivos celulares, inducción de diferenciación de swarmer, preparación de muestras y análisis de imágenes.

Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer y Swarmer

Se presenta un protocolo para el desarrollo de un biosensor electroquímico de ADN que comprende un electrodo de carbono nanopartículas modificadas, serigrafiados oro, estabilizado con ácido del poliláctico para la detección de Vibrio parahaemolyticus .

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.

Aplicación del sistema inteligente de detección de fagos y pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento y lar índice de resistencia a los antimicrobianos

Aprende a evaluar un medio cromogénico novedoso para detectar Vibrio parahaemolyticus con mayor sensibilidad y especificidad que los métodos convencionales. Esta técnica mejora la seguridad alimentaria y el monitoreo microbiológico ambiental.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de Vibrio parahaemolyticus Y Otros Vibrio Especies (Video) | JoVE Journal

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de

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