Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de Vibrio parahaemolyticus Y Otros Vibrio Especies

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la sensibilidad y especificidad de un nuevo medio cromogénico para la capacidad de detectar y aislar Vibrio parahaemolyticus en comparación con los medios convencionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología alimentaria y ambiental, como ¿cuál es la prevalencia de las especies de Vibrio en los entornos alimentarios y de cosecha? La principal ventaja de nuestro procedimiento es que se pueden utilizar muchos aislados bacterianos, incluso en presencia de una matriz alimentaria.

Antes de cultivar las bacterias, autoclave todos los medios de agar. Luego enfríe el agar a 45 a 50 grados centígrados en un baño de agua. Cuando el agar esté listo, coloque las placas de Petri vacías en pilas de cinco a seis placas.

Luego, comenzando desde el fondo de la pila, vierta el agar fundido en cada plato hasta aproximadamente la mitad de su capacidad, reemplazando las tapas después de verter. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante al menos 12 horas. Para configurar los cultivos de cepas microbianas, cuando el agar esté listo, utilice un circuito de inoculación estéril para transferir los cultivos a las placas de agar no selectivas adecuadas, trazando las bacterias en un patrón que permita la observación de colonias aisladas.

Cuando todas las colonias hayan sido colocadas, incube los cultivos boca abajo a 35 a 37 grados Celsius durante un máximo de 48 horas, excepto para las especies de Campylobacter, que deben incubarse en un frasco de tapa cerrada que contenga una bolsa de gas para producir un ambiente microaerófilo. Observar la morfología de la colonia al final de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiban una morfología de colonia similar.

Para hacer crecer las colonias de interés en medios selectivos y diferenciales, transfiera algunas colonias aisladas a cinco mililitros del caldo apropiado y reincube los cultivos a 35 a 37 grados centígrados durante 16 a 24 horas. Al día siguiente, coloque un bucle de los cultivos durante la noche en al menos una placa de agar de tiosulfato-citrato-biliares-sacarosa, o TCBS, y al menos una placa de agar cromogénico durante un máximo de 96 horas de incubación a 35 a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, examine tanto la densidad de cultivo en la placa como el tamaño de las colonias aisladas para determinar el crecimiento general de las cepas, registrando el color de las colonias bajo luz ambiental o ultravioleta, según corresponda, y anotando cualquier otra característica importante de las colonias.

Para realizar un ensayo de recuperación, inocule cultivos jóvenes de Vibrio parahaemolyticus en cinco mililitros de caldo de soja tríptico, suplementado con cloruro de sodio al dos por ciento, o TSBS, y coloque los tubos a 35 a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Al día siguiente, vórtice los cultivos durante la noche y configure una vez 10 por el negativo, por uno por 10 por las siete diluciones negativas de las bacterias en PBS. Usando las diluciones de uno por 10 a menos cuatro a uno por 10 a menos siete diluciones, coloque uniformemente 100 microlitros de cada dilución en agar de soja cromogénico, TCBS y tríptico individual suplementado con agar de cloruro de sodio al dos por ciento, o TSAS.

Incube todas las placas a 35 a 37 grados centígrados durante un máximo de 96 horas. Luego cuente las colonias, ignorando las placas que contienen colonias demasiado numerosas para contarlas o que contienen menos de 25 colonias. Para realizar un ensayo de competencia, seleccione una cepa de V. Parahaemolyticus que produzca las colonias de turquesa esperadas en TCBS y colonias de cian en agar cromogénico, y una cepa no V.

Especie de Parahaemolytius que no crece en ninguno de los dos medios o exhibe un color de colonia diferente. Transfiera algunas colonias aisladas de V. Parahaemolyticus y V. Metschnikovii de una agricultura TSAS, a cinco mililitros de TSBS para una incubación de 16 a 24 horas a 35 a 37 grados Celsius. Transfiera algunas colonias aisladas de Shigella sonnei del agar Brain Heart Infusion, o BHI, a cinco mililitros de caldo BHI durante 16 a 24 horas a 35 a 37 grados Celsius.

Al día siguiente, realice una dilución en serie para cada cepa, colocando las diluciones en placas de agar no selectivas para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro de los cultivos nocturnos. A continuación, utilice los cultivos nocturnos y los tubos de dilución para mezclar diferentes volúmenes de una cepa de V. Parahaemolyticus y una no V. Parahaemolyticus y esparció 100 microlitros de la mezcla bacteriana en placas individuales de agar cromogénicas, TCBS y TSAS.

Después de un máximo de 96 horas a 35 a 37 grados centígrados, cuente las colonias en función de sus diferencias de crecimiento y morfología en las placas cromogénica y TCBS. Para evaluar los efectos de los homogeneizados de ostras sobre el crecimiento bacteriano en medios selectivos y diferenciales, primero se deben pesar al menos 50 gramos de carne de ostra de al menos 12 moluscos, incluyendo la carne y el licor. Luego agregue una masa igual de PBS a los tejidos de ostra y mezcle la mezcla a alta velocidad durante 90 segundos.

A continuación, agregue 100 gramos del homogeneizado de ostra diluido a 400 gramos de PBS y mezcle la mezcla a alta velocidad durante un minuto. A continuación, autoclave el homogeneizado. Después de enfriar, agregue 100 microlitros de cada V.Parahaemolyticus y no V.Parahaemolyticus durante la noche.

Parahaemolyticus cultiva la lechada de ostras y utiliza un homogeneizador para mezclar las células bacterianas con el homogeneizado de ostras. Hacer una vez 10 a la negativa una a una vez 10 a la negativa tres diluciones del homogeneizado de ostra enriquecida en PBS como se demuestra, esparciendo 100 microlitros de cada dilución en placas cromogénicas individuales, TCBS y TSAS. Después de 96 horas a 35 a 37 grados Celsius, compare los recuentos reales de colonias en los agares cromogénicos y TCBS con los recuentos de colonias esperados deducidos del conteo en placa estándar realizado en los cultivos nocturnos.

Para determinar el crecimiento y la morfología de las colonias de las cepas utilizadas en este estudio, las bacterias se cultivaron en medios selectivos y diferenciales. El TCBS es el medio convencional utilizado para el aislamiento de algunas especies de Vibrio, incluyendo el V. Parahaemolyticus turquesa y el V. Cholerae amarillo. El uso de medio cromogénico para seleccionar especies de Vibrio clínicamente relevantes a partir de muestras de alimentos y ambientales da como resultado la generación de V. Parahaemolyticus cian y V. Cholerae magenta.

Las colonias de V. Parahaemolyticus cultivadas en placas de agar cromogénico en presencia de homogeneizado de ostras se observan en cantidades similares a las de los medios no selectivos, lo que sugiere que el límite de detección del medio cromogénico es similar al de los medios no selectivos, incluso en presencia de una matriz alimentaria. Tampoco se afecta el crecimiento y la recuperación de V. Parahaemolyticus por la presencia de una no V. Especies de Parahaemolyticus, un atributo esencial para medios diferenciales y selectivos, ya que las muestras ambientales contienen varias especies de Vibrio en grandes cantidades, especialmente después de un procedimiento de enriquecimiento.

Además, la comparación de TCBS y agares cromogénicos mediante PCR de hemolisina termolábil revela una mayor sensibilidad y especificidad para el agar cromogénico, lo que indica un mejor rendimiento general para este medio diferencial y selectivo para la detección e identificación de V. Parahaemolyticus. Una vez dominado, todo el procedimiento, incluidos los tiempos de prueba e incubación de aproximadamente 50 cepas, se puede completar en 30 días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar etiquetar diligentemente todos los cultivos y utilizar la técnica aséptica en todo momento.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR de colonias, para responder a preguntas adicionales, como: ¿Este aislado específico lleva un gen de virulencia? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la seguridad alimentaria y la salud pública exploraran la detección de especies de Vibrio en mariscos y el ambiente estuarino. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un recuento en placa estándar y cómo evaluar la sensibilidad, la especificidad y el límite de detección de un medio de crecimiento.

No olvide que trabajar con patógenos y medios calientes puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar ropa protectora, cubrir las heridas abiertas y separar los desechos biopeligrosos mientras se realiza este procedimiento.