Name: Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende a medir tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en corazón de rata aislado en modo trabajo. Este método permite evaluar la función cardíaca y adaptaciones metabólicas en tiempo real.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc ...). También es posible evaluar c...

Relevancia clínica En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco 1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón 2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la remodelación metabólica del corazón subrayado dará lugar a la identificación de dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de la insuficiencia cardíaca 5-7. La reciente publicación de una declaración científica de la American Heart Association sobre &quot;Evaluación de metabolismo cardíaco&quot;, subraya el creciente interés de la comunidad científica para tsu campo de investigación 8. Sin embargo, aunque los avances tecnológicos en imagen cardiaca ahora permiten una evaluación rápida y precisa de la morfología y la función cardíaca, el estudio in vivo del metabolismo cardiaco sigue siendo limitado y onerosa: la espectroscopia y resonancia magnética nuclear (RMN) Tomografía por Emisión de Positrones (TEP) puede se utiliza para seguir el metabolismo del fosfato de alta energía cardiaca y la actividad del ciclo de Krebs, pero estas técnicas se ven afectadas por los altos costos de operación y por su incapacidad para determinar la contribución de diversos sustratos para el metabolismo oxidativo en condiciones de estado estacionario 9 .Para esta fecha, el ex vivo trabajando preparación de corazón representa la sola y única técnica disponible para estudiar, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil y el flujo de sustratos metabólicos oxidativos en las vías de 7,9. El siguiente protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices para la preparación y utilización de los reactivos utilizados para determinar la rataes la utilización de sustratos en el corazón de rata aislado de trabajo. El aparato aislado del corazón de roedores de Trabajo Aunque la técnica es casi la mitad de un siglo de antigüedad, la preparación aislada de corazón de rata de trabajo sigue siendo un método de elección para la investigación cardiovascular. Al igual que con la preparación de corazón Langendorff, el corazón de roedores de trabajo ofrece una manera relativamente simple, fiable y de bajo costo para medir una amplia gama de parámetros cardíacos independientemente de los efectos de confusión de otros órganos, y otros factores neurohormonales circulantes. Pero en contraste con el corazón perfundido Langendorff, el corazón trabaja sigue llevando a cabo el trabajo cardíaco cercanas a las fisiológicas, un requisito previo para la generación de flujo metabólico oxidativo a niveles que son relevantes a las condiciones in vivo. Esto se logra mediante la entrega de la memoria intermedia de perfusión en el ventrículo izquierdo (VI) a través de una cánula conectada a la aurícula izquierda, y como el LV se llena y se contrae, latampón es expulsado a través de la línea aórtica frente a una presión hidrostática de la poscarga determinado. El diseño del aparato de perfusión descrito originalmente por Neely et al 10 fue mejorado posteriormente por Taegtmeyer, dobladillos y Krebs 11, pero ha cambiado muy poco desde entonces. Como se describe en el aparato original, la función contráctil se puede evaluar mediante la determinación del gasto cardíaco, utilizando no más de probetas graduadas y un cronómetro para medir los flujos aórtico y coronario 10,11. Varios vendedores ofrecen ahora sistemas completos de roedores de trabajo de perfusión del corazón. Estos aparatos disponibles en el mercado se puede adquirir con flowprobes, transductores de presión, un catéter de presión-volumen y todo el equipo necesario para la adquisición de datos de la función cardíaca y el análisis. Los proveedores ofrecen extensas sesiones de documentación y formación para familiarizar a los nuevos usuarios con sus equipos. Varios artículos de revisión también protocolos de detalle en el corazón trabaja instrumentación y en el uso de catéteres para medir la función cardiaca en los roedores 12-15. Por esta razón, sólo mencionaremos brevemente la configuración del aparato de perfusión y el aparato de control. El presente protocolo y no tiene por objeto complementar la información ya disponible con una descripción de los métodos que se pueden implementar para medir simultáneamente las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, los dos principales sustratos energéticos que proporciona en el corazón normal. Describimos aquí todos los pasos implicados en el uso de sustratos de energía radiomarcados para la evaluación del metabolismo oxidativo del miocardio, de la preparación de los reactivos y tampones a la recuperación y procesamiento de las muestras, al análisis de datos. Principios del método Cardiomiocitos generan la mayor parte de su energía para la contracción de la fosforilación oxidativa de los ácidos grasos (ácidos grasos de cadena larga principalmente) y carbohidratos (Glucose y lactato). El corazón se ha muy limitada reservas energéticas y depende de un suministro constante de estos sustratos de energía que proporciona a partir de la circulación. El catabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica produce piruvato que después se descarboxila por el complejo piruvato deshidrogenasa de la membrana mitocondrial interna. ácidos grasos de cadena larga, extraídos de circulación de albúmina o lipoproteína de triglicéridos, se activan primero en moléculas de acil-CoA en el citosol y posteriormente transportados dentro de la matriz mitocondrial a través de la lanzadera de la carnitina para entrar en la vía de oxidación beta. Las moléculas de acetil-CoA producidos por el catabolismo de la glucosa y los ácidos grasos combustible el ciclo de Krebs para generar los equivalentes reductores (NADH y FADH 2) que son utilizados por la cadena de transporte de electrones para construir la fuerza protón-motriz través de la membrana mitocondrial interna y generar ATP a través de la actividad de la ATP sintasa. Agua y dióxido de carbono son los subproductos de extremo delas reacciones enzimáticas que tienen lugar dentro del ciclo de Krebs. El suministro de 14 C y 3 H- sustratos radiomarcados (como 14 C-glucosa radiomarcada y ácido oleico 3 H-radiomarcado) para el corazón aislado de trabajo será por consiguiente dar lugar a la producción de 14 CO 2 y 3 H 2 O que puede recuperar cuantitativamente a partir del efluente coronario. La colección de 14 CO 2 se lleva a cabo manteniendo el corazón aislado y perfundido en una cámara sellada y por la recuperación inmediatamente el efluente coronario a medida que sale del corazón. Una columna pequeña de intercambio aniónico se usa para separar y recuperar 3 H 2 O del efluente coronario. La radiactividad de las muestras procesadas se mide con un contador de centelleo líquido, y con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados utilizado, entonces es posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácido graso en lala oxidación vías 16,17.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio Heptahidrato (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 resina, forma de cloruro, tamaño de malla seca 100 - 200, 500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>Este artículo se puede reemplazar comprando directamente la forma de óxido de hidrógeno&nbsp; (ver referencia más abajo), pero esto costará casi 8 veces más</td></tr><tr><td>resina AG 1-X8, forma de hidróxido, tamaño de malla seca de 100 a 200, 100 g</td><td>de 1432445 Bio-Rad</td><td></td><td>La compra de este artículo permite evitar la conversión de la resina de intercambio aniónico de la forma de cloruro a la forma de hidróxido (ver sección 1.2 del protocolo)</td></tr><tr><td>Microanálisis de vidrio Portafiltros al vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>Corrosivo. Consulte la MSDS del producto para conocer su manejo y almacenamiento adecuados.</td></tr><tr><td>Tubo de dispersión de gas con cilindro fritado</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Albúmina sérica bovina sin ácidos grasos, polvo</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>Recomendamos el uso de un BSA desgrasado con carbón, ya que otros procesos de purificación, como el fraccionamiento de etanol en frío, pueden dejar residuos tóxicos para el corazón.</td></tr><tr><td>Oleato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>Material radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos.</td></tr><tr><td>Tubo de membrana de diálisis, 29 mm de diámetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>Material radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>Sustancia controlada en USDEA Schedule III</td></tr><tr><td>3-0 Silk Black Braid</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Hyamine Hydroxide</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>Altamente tóxico y causa quemaduras graves. Consulte la hoja de datos de seguridad del producto para un manejo y almacenamiento adecuados Viales</td></tr><tr>de<td>centelleo de vidrio de 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25E</td><td>Utilice viales de vidrio para la recuperación cuantitativa de 14CO2</td></tr><tr><td>20 ml Viales de centelleo de HDPE</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>Utilice viales de HDPE para la recuperación cuantitativa de 3H2O</td></tr><tr><td>Red Tapones de goma</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit viales de centelleo de 20 mL; Aguja BD</td></tr><tr><td>PrecisionGlide reutilizable 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>Úselo para inyectar ácido perclórico a través del tapón de goma de la trampa de CO2</td></tr><tr><td>Ácido perclórico, 60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>Altamente corrosivo y puede actuar como oxidante y/o causar un peligro de explosión. Consulte la ficha de seguridad del producto MSDS para un manejo y almacenamiento adecuados</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Lana de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean Detergente en polvo</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>Para la limpieza de cristalería, piezas de plástico y tubos</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Detergente con energía enzimática</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-115</td><td>Para la limpieza de superficies de "difícil acceso" (tubos, cristalería) contaminadas por residuos de ácidos grasos-BSA</td></tr></tbody></table>

los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de 14 C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado 3 H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. 14 CO 2 y 3 H 2 O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.

Dos experimentos representativos se describen en las siguientes figuras. En ambos casos, se aisló el corazón de un 16 semanas de edad macho Sprague Dawley de rata perfundido y en el modo de trabajo con tampón KH preparado de acuerdo con el protocolo anterior. En cada experimento, el corazón se sometió a una condición de estrés para afectar el trabajo cardíaco. la función contráctil cardiaca se evaluó por registro continuo de la presión de pulso a través de la inserción de un transductor ...

El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener simultáneamente mediciones en tiempo real de las tasas miocárdicas de oxidación de glucosa y oxidación de ácidos grasos, así como de la función contráctil cardíaca en un corazón de rata aislado en trabajo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular, tales como cómo el corazón se adapta metabólicamente a cambios agudos en las demandas energéticas y cómo estas respuestas se ven afectadas en condiciones patológicas.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona al investigador un control total sobre las variables ambientales, como la naturaleza y las concentraciones de sustratos, fármacos u hormonas administradas al corazón. La más sería Bhavisha Bakrania, una becaria posdoctoral del centro de recursos cardiovasculares Reno en el Centro Médico de la Universidad de Mississippi. Para comenzar, encienda la bomba para cebado del aparato de perfusión y para oxigenar el tampón.Después de preparar los materiales, anestesie una rata y prepárela para la cirugía. Afeite el abdomen para eliminar el vello y realice una incisión media con extensión lateral. Mueva el estómago y el intestino hacia un l

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El objetivo es supervisar el estado redox mitocondrial de los corazones aislados dentro del contexto de la precarga fisiológica y presiones poscarga. Un modelo de trabajo biventricular corazón de conejo se presenta. De alta resolución espacio-temporal de imágenes de fluorescencia de NADH se utiliza para supervisar el estado redox mitocondrial del tejido epicárdico.

NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

La glucólisis es un marcador metabólico definitorio en múltiples sistemas biológicos. El monitoreo de la glucólisis mediante la medición del flujo extracelular de H+ es común, pero requiere una corrección para que sea cuantitativa e inequívoca. Aquí, demostramos cómo recopilar y corregir datos de flujo extracelular para distinguir entre las fuentes respiratorias y glucolíticas de acidificación extracelular.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

El estudio del metabolismo es cada vez más relevante para la investigación inmunológica. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en esplenocitos de ratón y linfocitos T y B.

Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.

Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Aquí se describe un protocolo detallado para realizar el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de velocidad glucolítica en muestras de tejido retiniano ex vivo utilizando un bioanalizador comercial.

Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en muestras de tejido retiniano ex vivo

Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con 13C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de 13C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de 31R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.

Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopia de RMN 13C / 31P

Aprende a medir tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en corazón de rata aislado en modo trabajo. Este método permite evaluar la función cardíaca y adaptaciones metabólicas en tiempo real.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo (Video) | JoVE Journal

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

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