Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

El objetivo general de este procedimiento es obtener simultáneamente mediciones en tiempo real de las tasas miocárdicas de oxidación de glucosa y oxidación de ácidos grasos, así como de la función contráctil cardíaca en un corazón de rata aislado en trabajo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular, tales como cómo el corazón se adapta metabólicamente a cambios agudos en las demandas energéticas y cómo estas respuestas se ven afectadas en condiciones patológicas.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona al investigador un control total sobre las variables ambientales, como la naturaleza y las concentraciones de sustratos, fármacos u hormonas administradas al corazón. La más sería Bhavisha Bakrania, una becaria posdoctoral del centro de recursos cardiovasculares Reno en el Centro Médico de la Universidad de Mississippi. Para comenzar, encienda la bomba para cebado del aparato de perfusión y para oxigenar el tampón.

Después de preparar los materiales, anestesie una rata y prepárela para la cirugía. Afeite el abdomen para eliminar el vello y realice una incisión media con extensión lateral. Mueva el estómago y el intestino hacia un lado para acceder a la vena cava inferior e inyecte 200 unidades USP de Heparina.

Espere de cinco a 10 segundos, luego use tijeras para cortar el diafragma y los lados de la caja torácica y exponer el contenido de la cavidad torácica. A continuación, tome delicadamente el corazón con la mano y extirpe juntos el corazón y los pulmones. Corte al nivel de la aorta descendente, teniendo cuidado de no dañar el arco aórtico y la aorta ascendente en el proceso.

Transfiera inmediatamente el corazón y los pulmones a una placa de disección llena con tampón KH frío con hielo. Una vez que el corazón deje de latir, aprenda a trabajar rápidamente para que pueda reiniciarse dentro de uno o dos minutos. Ahora sumerja el corazón y los pulmones en una nueva placa con tampón KH frío con hielo.

Corte rápidamente cualquier trozo grande de tejido pulmonar, luego seccione la aorta descendente justo por encima del arco aórtico. Para los siguientes pasos, tome las precauciones necesarias para el manejo de materiales radiactivos. A continuación, usando pinzas, abra cuidadosamente la aorta y deslice el corazón hacia arriba sobre la cánula.

Tenga mucho cuidado en no pasar la cánula por la arteria aorta, ya que esto podría causar una hipoperfusión del corazón y dañar las válvulas aórticas. Ahora, asegure la unión con una pinza microquirúrgica e inicie la perfusión de Langendorff del corazón. Sin prisas, asegure la aorta a la cánula aórtica utilizando un hilo de sutura de seda 3-0 y retire la pinza microquirúrgica.

Luego, localice la vena pulmonar y corte los tejidos no cardíacos según sea necesario. Deje suficiente tejido para anclar la aurícula izquierda a la cánula. La canulación de la aurícula izquierda es el segundo paso más crítico del protocolo, ya que la inserción inadecuada de la cánula o la presencia de fugas debilitará las contracciones y comprometerá la cuantificación de las tasas metabólicas.

A continuación, prepare la cánula de la línea auricular izquierda, tal como se hizo con la cánula derecha. Luego, con pinzas, agarre delicadamente la abertura de la vena pulmonar y deslice el corazón hacia arriba sobre la cánula auricular. Mueva los tejidos según sea necesario sin doblar la aorta ni forzar excesivamente el corazón.

Luego sujete la cánula con una sutura de seda 3-0. Finalmente, abra la línea auricular mientras simultáneamente cambia la línea aórtica al modo de funcionamiento. Si el tampón sale por filtración desde la aurícula izquierda, cierre la línea auricular y regrese al modo Lagendorff.

Luego, use más puntos de sutura para asegurar mejor la cánula e intente cambiar nuevamente al modo de funcionamiento. Si el experimento incluye la medición directa de la función del VI con un catéter, comience perforando el ápice del VI con una aguja de calibre 26, introduzca un catéter de presión-volumen y alinee el eje con el eje longitudinal del VI. A continuación, coloque el electrodo distal E1 justo debajo de la válvula aórtica, adyacente al borde endocárdico, y coloque el electrodo proximal E4 justo dentro de la pared ventricular.

Ahora selle el corazón en una cámara con camisa de agua. Luego comience a monitorear los parámetros funcionales en el software. Una vez que los parámetros basales hayan permanecido estables durante al menos cinco minutos, comience a registrar los datos.

Para medir el flujo coronario, registre el tiempo que tarda en recolectar 20 mililitros de efluente. Luego, tome dos mililitros del efluente en una jeringa a través de la llave de paso de tres vías y deseche el resto. Transfiera inmediatamente la muestra de dos mililitros a un tubo de microcentrífuga y tome una alícuota de medio mililitro para determinar la tasa de oxidación de glucosa.

Guarde el resto en hielo. Continúe tomando muestras de efluente coronario periódicamente y, antes de finalizar, inyecte 10 microlitros de solución salina hipertónica en la línea auricular. Justo antes de que se conecte a la cánula.

Utilice la respuesta a esta bolo para calcular la conductancia paralela y determinar con precisión el volumen cardíaco. A continuación, desprecintar la cámara cardíaca y retire el catéter del VI. Luego corte el corazón de las cánulas y colóquelo en tampón KH frío con hielo. Ahora, seque rápidamente el corazón con una toalla de papel y mida su peso húmedo.

Una vez pesado, proceda a diseccionar las muestras de tejido necesarias y luego congele el tejido restante utilizando pinzas enfriadas con hielo seco. Como preparación, cargue viales de vidrio para centelleo con un mililitro de hidróxido de hyamina 10x. Prepare uno para cada muestra de efluente coronario y dos para los controles.

En cuanto se cargue un vial de muestra, colóquelo directamente en un vial de centelleo cargado. Para el análisis, tape cuidadosamente el vial con un tapón de manga de goma y use parafilm para sellar el vial. Ahora, utilizando una jeringa de un mililitro con una aguja larga de calibre 23, inyecte 200 microlitros de ácido perclórico al 60 % a través de la manga de goma.

Deje que todos los viales de muestra reposen durante la noche. Al día siguiente, retire cuidadosamente cada tubo de muestra con pinzas y lave sus fondos sobre los viales abiertos con un mililitro de cóctel de centelleo para recuperar todo el hidróxido de hyamine. Luego agregue nueve mililitros más de cóctel de centelleo a cada vial.

Para obtener la actividad específica, agregue 0,5 mililitros de tampón de perfusión en dos de los viales. Agite ahora los viales vigorosamente y deje reposar el vial durante al menos seis horas antes de tomar mediciones. Para determinar las tasas de oxidación de oleato miocárdico, prepare primero una columna de resina de intercambio aniónico para cada muestra.

Simplemente cargue las puntas de las jeringas de tres mililitros con lana de vidrio. Luego, añada la suspensión acuosa de resina hasta la marca de dos mililitros en cada columna utilizando una pipeta de transferencia. A continuación, lave la resina pasando dos mililitros de agua ultrapura a través de cada columna tres veces.

Luego, coloque viales de centelleo debajo de las columnas y cargue las columnas con medio mililitro de efluente coronario. Para la medición del fondo, utilice tampón de perfusión en su lugar. Ahora, eluya las columnas sucesivamente con medio mililitro, un mililitro y finalmente dos mililitros de agua ultrapura.

Deseche las columnas. A continuación, agregue 13 mililitros de cóctel de centelleo a los viales. Agregue 0,5 mililitros de tampón de perfusión directamente a dos viales llenos con 13 mililitros de cóctel de centelleo líquido para la determinación de la actividad específica.

Agite vigorosamente los viales, déjelos reposar durante más de seis horas y tome las mediciones. Se aislaron corazones de dos ratas de 16 semanas y se sometieron a diferentes condiciones de estrés. Para un corazón, se simuló un aumento agudo de la carga de trabajo incrementando la postcarga en un 40 % y agregando epinefrina al tampón de perfusión.

La frecuencia cardíaca aumentó inmediatamente en más del 50% con la inducción del salto de trabajo. La potencia cardíaca aumentó en más del 40% en el salto de trabajo, lo que se acompañó de un incremento en las tasas de oxidación de glucosa y oleato. El aumento relativo desde la línea base en la oxidación de glucosa fue notable.

El otro corazón se sometió a 15 minutos de isquemia global y 30 minutos de reperfusión. Bajo estas condiciones experimentales, se restableció una presión del pulso casi normal unos minutos después de iniciarse la reperfusión. Dentro de los 10 minutos, la potencia cardíaca aumentó rápidamente por encima de los valores previos a la isquemia antes de regresar a valores cercanos a la línea base.

Esto se debió a un aumento en la oxidación de oleato. Mientras que la oxidación de glucosa se reanudó rápidamente a la actividad previa al isquémico. Una vez dominada, la aislación del corazón hasta la reperfusión inicial en modo funcional puede realizarse en menos de cinco minutos si se realiza adecuadamente.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los análisis de expresión de ARN y proteínas, para responder preguntas adicionales, tales como el efecto de un fármaco o una condición de estrés sobre las vías de señalización molecular. No olvide que trabajar con trazadores radiactivos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal completo, al realizar este procedimiento.