Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

ensayos de quimiotaxis visuales son esenciales para una mejor comprensión de cómo las células eucariotas controlar la migración de células direccional quimioatrayente mediada. A continuación, se describen los métodos detallados para: 1) en tiempo real, monitoreo de alta resolución de múltiples ensayos de quimiotaxis, y 2) visualizar simultáneamente el gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las células HL60 neutrófilos como señalización.

El objetivo general de este modelo es permitir la monitorización simultánea de múltiples ensayos de quimiotaxis, o la visualización de los múltiples eventos de señalización de una sola célula quimiotaxisa. Los biólogos celulares de Overdeck han desarrollado varios enfoques diferentes para cuantificar el comportamiento de la quimiotaxis de las células. Hasta hace poco, somos capaces de responder a preguntas clave en el campo de la quimiotaxis, como por ejemplo, cómo monitorizar simultáneamente múltiples ensayos de quimiotaxis.

La principal ventaja de esta tecnología es aplicar el principio de la microfluídica para generar ingredientes altamente reproducibles y fiables para múltiples ensayos de quimiotaxis simultáneos con alta resolución en tiempo real. El Dr. Xi Wen, un postdoctorado de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Para montar el soporte, primero use las palancas para colocar la base en posición vertical para que las palancas puedan inclinarse hacia el usuario.

Luego, cubra brevemente la superficie del vidrio de 41 milímetros con etanol al 70% y use una toallita para eliminar cuidadosamente el etanol. Inserte el vidrio en la base del soporte y coloque un cubreobjetos cuadrado de 2 milímetros recubierto de BSA encima del vidrio. A continuación, inserte la pequeña junta tórica en la parte inferior de la carcasa de la oblea y monte la carcasa de la oblea en la base del soporte, con el orificio elíptico en la parte posterior del instrumento.

Tire del nivel interior de la base del soporte hacia adelante hasta la posición horizontal, para bloquear la carcasa de la oblea en su lugar. Use un plumero de aire para soplar cualquier residuo del interior de la carcasa de la oblea. A continuación, añada 4 mililitros de RPMI 1640 medium, complementado con 0,1%BSA, a la carcasa.

Ahora, monte el chip del dispositivo de análisis de movilidad de celdas recubierto de BSA en el centro de la carcasa de la oblea con la cara estructural en contacto con el vidrio y con la marca de posicionamiento en la parte trasera. Coloque las dos protuberancias de la junta de goma en los orificios para fijar la junta a la parte inferior de la abrazadera de la oblea y monte la junta tórica grande en la parte superior de la carcasa de la oblea. A continuación, monte la abrazadera de oblea con el orificio del sensor en la parte trasera y tire de la palanca exterior de la base de la carcasa hacia adelante hasta la posición horizontal para bloquear la abrazadera de oblea en su lugar.

Cuando el soporte esté ensamblado, coloque la parte inferior del soporte sobre una caja de luz para confirmar que no haya burbujas de aire en los pozos. A continuación, retire la cubierta, transfiera el conjunto a la placa situada en la parte superior de la unidad del dispositivo de análisis de movilidad celular y fije el bloque de sensores al soporte. Para realizar el ensayo de movilidad celular, primero suspendimos células HL60 diferenciadas en medio RPMI 1640 suplementado con BSA, y una concentración de dos veces diez a la sexta célula por mililitro.

A continuación, conecte la unidad del dispositivo de análisis de movilidad celular al ordenador para la adquisición de imágenes y encienda ambos dispositivos. A continuación, abra el software del dispositivo de análisis de movilidad celular. En el panel de control de imagen de la cámara, utilice las líneas horizontal y vertical para ajustar la posición del soporte en tiempo real y centre el dispositivo en el panel de imagen de la cámara.

A continuación, seleccione Canal uno para mover la cámara al canal seleccionado y utilice Mover a la izquierda de Mover a la derecha para ajustar la coordenada X de la cámara para centrar el campo de visión horizontalmente. Para ajustar verticalmente la imagen al centro de la pantalla, gire la perilla de posición en el panel frontal del dispositivo de análisis de movilidad celular. En el panel de control del calentador, ajuste la temperatura del soporte a 37 grados centígrados y la temperatura de la placa a 39 grados centígrados.

Para controlar la temperatura mediante el sensor térmico conectado al soporte, haga clic en Calor para iniciar la calefacción y, a continuación, en Soporte. En el panel de disparo, introduzca 15 segundos para el Intervalo y 30 minutos para el Tiempo para establecer los intervalos y la duración del ensayo de quimiotaxis, respectivamente. Por motivos de seguridad, seleccione la casilla Calentador apagado al final del disparo.

A continuación, guarde el archivo, introduzca los detalles del experimento en el panel de notas y confirme que el dispositivo se ha centrado en todos los canales. Ahora retire todo el tampón del soporte y ocho microlitros de tampón del tercer pocillo desde la parte superior del primer canal. Con una jeringa, inyecte dos microlitros de células en el segundo pocillo en el mismo canal, mientras monitorea la pantalla en tiempo real para controlar el número de células y el flujo durante la inyección.

Cuando las celdas estén alineadas, agregue inmediatamente los ocho microlitros de tampón al pocillo y repita la inyección de celdas en los canales dos a seis, como se acaba de demostrar. Después de que se hayan agregado todas las celdas, agregue dos mililitros de tampón al soporte y agregue un microlitro del quimioatrayente al tercer pocillo desde la parte superior en los canales apropiados. Finalmente, inicie la adquisición de la imagen.

En este experimento representativo, las células HL60 comienzan a quimiotaxar en una trayectoria recta inmediatamente después de la inyección del quimioatrayente, y continuaron durante los 60 minutos completos del ensayo, de acuerdo con los resultados de la simulación de estabilidad del gradiente. El trazado de la trayectoria de viaje y la morfología de las células permite la medición cuantitativa y la posterior comparación de los comportamientos de la quimiotaxis, utilizando un índice de quimiotaxis que incluye la longitud total de la trayectoria, la direccionalidad, la velocidad y la redondez de las células. La aplicación de un colorante fluorescente, junto con el quimioatrayente, permite establecer una relación lineal entre la concentración del quimioatrayente y la intensidad del colorante fluorescente monitoreada.

Además, en respuesta a la estimulación quimioatrayente aplicada uniformemente, las células HL60 median una translocación robusta de la membrana de la proteína quinasa tacto GFP D1.In un gradiente quimioatrayente, las células HL60 reclutan activamente la quinasa hacia la parte posterior del borde de ataque. Una vez dominado, este proceso puede completarse en 30 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante seguir estrictamente las instrucciones del fabricante sobre el ensamblaje del soporte y monitorear la inyección de celdas.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la quimiotaxis exploraran la posibilidad de múltiples ensayos de quimiotaxis, como un dictyostilium de monogenismo, u otros tipos de sistemas celulares de mamíferos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ensamblar la unidad, realizar ensayos de quimiotaxis simultáneos o visualizar simultáneamente múltiples eventos de señalización en células de quimiotaxia.