Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

El objetivo general de este protocolo de captura por afinidad es aislar complejos de proteínas endógenas de células de mamíferos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular y molecular, como qué proteínas se forman juntas en módulos funcionales físicamente vinculados. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar simultáneamente numerosas interacciones físicas asociadas con la proteína diana de interés.

Cultive de uno a ocho gramos de células como se describe en el protocolo de texto. Vierta el medio de crecimiento en un vaso de precipitados grande. Luego, coloque el plato de cultivo sobre hielo en una bandeja de hielo rectangular grande.

Agregue 20 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1x helada, o PBS, a la placa de cultivo y libere las células de la placa con un raspador de células grande. Transfiera las celdas a un tubo de 50 mililitros preenfriado en hielo. Agregue 10 mililitros adicionales de 1x PBS helado al mismo plato.

Recoja las células restantes y transfiéralas al tubo de 50 mililitros. Repite este proceso para cada plato. Las suspensiones celulares de diferentes platos se pueden combinar para reducir el número de muestras y los desechos plásticos.

A continuación, centrifugar las muestras durante cinco minutos a 1.000 x g en cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, vierta con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender cada pellet en diez mililitros de 1x PBS helado.

Consolide los gránulos resuspendidos hasta cinco por tubo de 50 mililitros. Lave los tubos vacíos con 10 mililitros de PBS. Agregue la solución a las muestras consolidadas y centrifugue como antes.

Después de eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de 1x PBS helado. Retire el émbolo de una jeringa de 20 mililitros y déjelo a un lado. Tape la boquilla de la jeringa, coloque la jeringa dentro de un tubo de 50 mililitros y transfiera allí la suspensión celular.

Centrifugar durante cinco minutos a 1000 x g, cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante con una pipeta de punta fina conectada a un sistema de trampa de vacío hasta que la capa superior de células comience a ser aspirada. Esto da como resultado un pellet de celda húmeda.

Destape la jeringa, inserte el émbolo y gotee las células directamente en un vaso de precipitados de plástico grande lleno de nitrógeno líquido que se mantiene en un baño de nitrógeno líquido en una caja de espuma de poliestireno. Sumerge a la fuerza las células restantes de la jeringa. A continuación, vierta las células congeladas en tubos de 50 mililitros.

Tape los tubos sin apretar para permitir que se evapore el exceso de nitrógeno líquido. Manténgalos durante la noche a 80 grados centígrados. Apriete completamente las tapas al día siguiente.

Las células congeladas pueden almacenarse de esta manera a 80 grados centígrados hasta la criomolienda. Retire las perlas de celda del congelador a 80 grados centígrados y colóquelas en un soporte de tubo de 50 mililitros en un baño de nitrógeno líquido. Enfríe previamente un frasco de 50 mililitros, dos bolas de 20 milímetros y la tapa del frasco en una cubitera rectangular limpia que contenga nitrógeno líquido.

Además, enfríe previamente un aislante de PTFE. Use un juego de discos o una funda y disco. Coloque el contrapeso adecuado en el molino.

Con unas pinzas, coloque las dos bolas de fresado de 20 milímetros preenfriadas y las células congeladas dentro del frasco de fresado preenfriado. Agregue nitrógeno líquido al frasco hasta la mitad de su capacidad, coloque la tapa en el frasco y transfiera el conjunto al molino. Sujete el conjunto en su lugar y realice tres ciclos de fresado, utilizando un programa de 400 rpm, tres minutos, rotación inversa cada minuto y sin pausa de intervalo.

Es fundamental escuchar el traqueteo de las bolas durante el fresado, esto indica que las bolas están chocando y pulverizando el material. Si no se oye este sonido, significa que no se está realizando el fresado. Una vez completados los tres ciclos de molienda, vuelva a convertir el frasco en nitrógeno líquido y déjelo reposar momentáneamente para que se enfríe.

Retire con cuidado la tapa. Retire las bolas con pinzas y transfiera el polvo a un tubo de 50 mililitros preenfriado con una espátula preenfriada. Tenga en cuenta que agregar nitrógeno líquido al frasco puede ayudar a desalojar el polvo que se acumula en las bolas.

Para la preparación del extracto celular, pese 100 miligramos de polvo celular en un tubo de microfuga preenfriado de 1,5 o dos mililitros. Tara una balanza analítica con el tubo de microfuga vacío. Dispense el polvo celular en el tubo con una cuchara enfriada con nitrógeno líquido o una espátula.

Compruebe la masa del polvo dispensado dentro del tubo en la balanza analítica antes de devolver el tubo a nitrógeno líquido. Abra el tubo con polvo celular y déjelo reposar a temperatura ambiente durante un minuto para liberar la presión dentro del tubo y evitar la congelación inmediata del tampón de extracción cuando se agrega al polvo. Añadir 400 microlitros de extractante, suplementado con inhibidores de la proteasa al tubo.

Agite el tubo brevemente y luego manténgalo en el hielo. Utilice un ultrasonido de micropunta para dar a la muestra un breve pulso de baja energía y dispersar los agregados. Clarificar el extracto por centrifugación.

Finalmente, retire el sobrenadante y proceda a la captura de afinidad. Para lavar previamente el medio de afinidad, coloque los tubos que contienen perlas paramagnéticas acopladas a anticuerpos en el imán. Las perlas se acumularán en el costado del tubo en cuestión de segundos, lo que permitirá eliminar la solución de almacenamiento.

A continuación, añade 500 microlitros de tampón de extracción a las perlas. Breve vórtice a velocidad media para mezclar. Además, gire los tubos en una mini centrífuga para recoger todo el contenido hasta el fondo del tubo.

A continuación, coloque los tubos en el imán y aspire la solución. Inicie brevemente la captura de afinidad transfiriendo el extracto celular clarificado a los tubos que contienen el medio de afinidad prelavado y el vórtice. Incubar los tubos durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con una mezcla suave continua en una rueda giratoria.

Las perlas deben permanecer suspendidas durante toda la incubación. Aspirar el sobrenadante y lavar las perlas tres veces con un mililitro de tampón de extracción en frío. Para eluir las proteínas, agregue tampón de muestra de página SDS sin agente reductor, para mitigar la liberación de cadenas de anticuerpos de las perlas.

Incubar durante cinco a diez minutos a temperatura ambiente con agitación. Recoja y guarde el sobrenadante, luego someta las muestras a la página SDS, seguida de la tinción de proteínas utilizando técnicas estándar. Las bandas de proteínas individuales pueden extirparse para su identificación, o se puede caracterizar toda la muestra en un solo análisis electroforendo la muestra solo brevemente.

El material que comprende el medio insoluble utilizado para la captura de afinidad puede afectar al proteoma recuperado. Aquí se muestran perlas magnéticas, agarosa impregnada de hierro y agarosa tradicional. Cada medio se acopló a anticuerpos anti-FLAG M2 y se utilizó para capturar la fosfatasa alcalina bacteriana marcada con FLAG, introducida en extractos producidos a partir de células HEK 293 criomoladas.

Las perlas magnéticas a escala micrométrica mostraron el perfil más limpio, lo que indica un nivel relativamente bajo de adsorción de proteínas no específicas. El método de lisis celular también puede afectar al proteoma recuperado. Aquí, un complejo de proteínas endógenas se sometió a la captura de afinidad a partir de extractos celulares criomilados o sonicados.

Se observaron menos contaminantes de alta masa cuando el extracto celular se produjo a partir de polvo celular criomolido. A pesar de que los medios magnéticos pueden exhibir un fondo más bajo que otros medios, el propio anticuerpo puede facilitar la adsorción de contaminación por falsos positivos, especialmente en ausencia de su antígeno objetivo. Para determinar la unión de fondo aportada por el medio magnético anti-FLAG cuando los paratopos de anticuerpos están o no ocupados, se llevaron a cabo experimentos simulados de captura de afinidad utilizando extractos de células HEK 293T en presencia, o ausencia, de un pico de péptido FLAG 3x.

En ausencia de su epítopo afín, el medio alfa FLAG captura un nivel detectable de proteínas de fondo que pueden eludirse competitivamente con el péptido 3x FLAG y eludir en mayor medida mediante el tampón de muestra de página SDS. Se observó una especie contaminante dominante entre los 37 y 50 kilodaltons. En presencia de un epítopo competidor, tanto las eluciones basadas en FLAG como en SDS están comparativamente libres de unión a proteínas de fondo.

Al intentar este procedimiento, es importante trabajar con cuidado, rapidez y precisión. Lleve un registro de sus procedimientos y de las variaciones observadas, para saber qué pasos son los más críticos para sus resultados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectrometría de masas, la centrifugación zonal y la microscopía electrónica para analizar la composición de la mezcla, su nivel de homogeneidad y el tamaño y la forma de los complejos macromoleculares constituyentes.

Después de su desarrollo, la captura de afinidad allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploraran las composiciones de los complejos de proteínas fisiológicas con un detalle sin precedentes, lo que sigue siendo un esfuerzo de investigación global en curso. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar células mamilianas para la criomolación y cómo ejecutar la captura de afinidad de una proteína de interés.