Name: La manipulación genética del patógeno de la planta Ustilago maydis Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis mediante reemplazo de genes y protoplastos. Este protocolo permite generar mutantes de deleción para estudiar fenotipos de infección en interacciones planta-microbio.

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Un agradecimiento especial al Dr. Benedikt Steuten para la lectura crítica del manuscrito. El trabajo original sobre las quitinasas se llevó a cabo por el Dr. Thorsten Langner. El laboratorio de VG es apoyado por el Cluster de Excelencia en Ciencias de las Plantas (CEPLAS, DFG EXC 1028) y BioSC, el laboratorio de KS es apoyado por BioSC. KB es apoyado por BioSC. Las actividades científicas del Centro de Ciencias de Bioeconomía (BioSC) fueron apoyados económicamente por el Departamento de Innovación, Ciencia e Investigación, en el marco de la NRW Strategieprojekt BioSC (Nº 313 / 323-400-00213). LF es apoyado por una beca de doctorado de la DFG Grupo Internacional de Formación de Investigadores 1525 iGRADplant.

1. Generación de constructos de deleción <ol><li> Generar un plásmido que contiene la construcción de deleción (Figura 1) que comprende un respectivo 1 kb aguas arriba del flanco (UF) y el flanco corriente abajo (DF) cada uno y el casete de resistencia apropiada, flanqueada por sitios de restricción de corte romos. NOTA: Cualquier estrategia de clonación se puede utilizar (para la clonación véase la referencia 22) recomendamos Golden Gate clonación de tales plásmidos 9. </li><li> Extirpar la eliminación construcción del plásmido usando un cortador romo para obtener 1 g de ADN de la supresión construir 9. Se purifica el constructo de deleción para eliminar la enzima y tampón 22 por ejemplo mediante el uso de reactivos comerciales y seguir las instrucciones del fabricante. NOTA: La cadena principal del vector puede permanecer en la mezcla de transformación. </li></ol> 2. Preparación de protoplastos NOTA: Mantener condiciones estériles durante todas las épocas del correoXperiment. La pared celular es una fuerte barrera de protección que limita el acceso de las moléculas de la membrana plasmática. Para permitir la captación del ADN que contiene la construcción de deleción, la pared celular debe ser eliminado por la pared celular de las enzimas de degradación en una reacción de protoplastos. Los pasos críticos en la preparación de protoplastos son 1) la estabilización osmótica del medio y 2) evitar el estrés mecánico en los protoplastos. <ol><li> Marcar tubos de 2 ml con fondo redondo para congelar los protoplastos y enfriarlos a -20 ° C. Iniciar un pre-cultivo en 3 ml Yeps luz de un plato fresco de la cepa con el fondo genético deseado. Incubar en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C. NOTA: La cepa puede ser la cepa SG200 solopathogenic 10, las cepas de tipo silvestre, cepas de ensayo, tales como AB33 23, o cualquier mutante de fondo para la generación de mutantes dobles. Asegúrese de que la cepa es libre de la resistencia deseada. </li><li> Se diluye la cultura en 50 ml Yeps-luz en un flas desconcertadok y se incuba en un agitador orbital a 28 ° C con 200 rpm. NOTA: El tiempo de duplicación es de aproximadamente 2 horas para las cepas de tipo salvaje. Permitir tres duplicaciones mínimo. </li><li> Crecer hasta fase exponencial. Asegúrese de que la densidad óptica, medida a una longitud de onda de 600 nm (OD 600), es de alrededor de 0,8 (0,6 a 1,0 es aceptable). Un OD 600 de 1,0 corresponde a aproximadamente 1-2 x 10 7 U. maydis células por ml. </li><li> Compruebe las células en busca de contaminación bajo el microscopio. Utilice un aumento de 40x. Sedimentar las células de la completa cultivo de 50 ml durante 5 min, 1500 xg y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 25 ml de citrato de sodio, solución de sorbitol (SCS), se centrifuga 5 min, 1.500 xg, y desechar el sobrenadante. NOTA: contaminaciones bacterianas pueden ser identificadas como células pequeñas y, a menudo móviles. Contaminaciones fúngicas pueden ser identificados en base a una forma de la célula diferente o tamaño en comparación con las células en forma de cigarro de U. maydis. </li><li> durante CENtrifugation preparar solución de protoplastos (12,5 mg / ml Trichoderma lisis de enzimas, en SCS, así como preparar 3 ml por sedimento celular; esterilizar por filtración a través de un filtro de 22 micras; solución tiene que ser fresco para la actividad enzimática óptima). SCS es un estabilizador osmótico para evitar la ruptura de protoplastos después de la retirada de la pared celular. </li><li> Resuspender el sedimento en 2 ml de solución de protoplastos. Incubar durante 5 a 20 min a TA y comprobar bajo el microscopio hasta el 30 a 40% de las células son redondas o como cabezas de alfiler (Figura 2). NOTA: Realizar todos los pasos en el hielo a partir de ahora y manejar protoplastos con cuidado! </li><li> Lavar 3x en 10 ml de frío (4 ° C) SCS, centrifugar a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender el precipitado en 10 ml de sorbitol frío, solución Tris-HCl, CaCl2 (STC), centrifugado a 1.000 xg durante 5 min, desechar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de STC fría, hacer 100 ml de alícuotas en los tubos enfriados. Congelar las alícuotas a -80 ° C hasta su uso posterior.</li></ol> 3. Transformación de U. maydis NOTA: La transformación de la U. maydis protoplastos se basa en el polietilenglicol (PEG) método de transformación mediada por, que es técnicamente sencilla y opuesto a electroporación o transformación biolística no requiere equipo especializado. <ol><li> Preparar las placas de selección de dos capas (2 planchas por reacción de transformación). La capa inferior contiene el antibiótico en una concentración doble. Pipetear 12 ml de RegLight que contienen 400 mg / ml de higromicina (o 300 mg / ml nourseothricin o 4 mg / ml carboxin o 1 mg / ml de G418) en una placa de Petri. Evitar las burbujas. NOTA: Las placas de capa inferior se puede almacenar un par de días a 4 ° C, pero preparar la capa superior recién durante la transformación (véase más adelante). </li><li> protoplastos descongelación en hielo (1 tubo / transformación). Añadir 1 heparina l (15 mg / ml). Añadir 1 g de ADN (constructo linealizado) o 10 l H 2 </sub&gt; O (control de agua). Incubar durante 10 minutos en hielo. </li><li> Durante este tiempo, para la capa superior extendido 12 ml licuados RegLight (hervir y enfriar a 60 ° C) sobre la placa de fondo RegLight. NOTA: Esta capa no contiene antibióticos. </li><li> Añadir 500 l STC / PEG (polietilenglicol) al tubo de transformación (3. 2) y mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo. Incubar 15 minutos en hielo. </li><li> Distribuir cada reacción de transformación en dos de las placas RegLight de dos capas. Difundir lentamente y con cuidado con una pipeta de vidrio. Incubar las placas en posición vertical a 28 ° C durante 5 a 7 días hasta transformantes crecen como colonias. Obtener unos 100-200 colonias por placa. NOTA: Los números más bajos podrían ser causados ​​por protoplastos &quot;malos&quot; que, o bien contienen demasiada pared celular y por lo tanto no pueden captar ADN o no pueden regenerarse. El primero puede ser probado por transformación con un plásmido autorreplicante, este último mediante el ensayo de regeneración en las placas sin antibióticos. </li> &lt;li&gt; Prepare placas Yeps-Light que contienen el antibiótico apropiado en 200 mg / ml de higromicina (o 150 mg / ml nourseothricin o 2 g / carboxin ml o 500 mg / ml de G418; estas concentraciones igual la mitad de la utilizada para placas de fondo). Re-purificar al menos 24 colonias transformantes putativos en estas placas. Las colonias individuales se deben obtener. Al mismo tiempo, la cepa original consecutivas en medios no selectivos. NOTA: Las placas se pueden almacenar a 4 ° C durante 1-2 semanas. </li></ol> 4. Verificación de la deleción Eventos Corregir NOTA: Las mutaciones se verifiquen en un procedimiento de tres pasos (Figura 1). En primer lugar, los candidatos que contienen la copia de tipo salvaje del gen están excluidos por PCR. En segundo lugar, la integración de la casete de resistencia en el locus se verifica por PCR. En tercer lugar, la integración de la casete de resistencia a solamente en el locus deseado se verificó por análisis de transferencia de Southern. la verificación cuidadosa cepa es essential, por lo que los fenotipos mutantes verdaderamente se correlaciona con la eliminación. <ol><li> En primer diagnóstico de PCR 20 <ol><li> Diseño cebadores de emparejamiento en el gen que se desea borrar que resultan en un producto de 250 a 600 pb (Figura 1). Tales productos pequeños son fáciles de amplificar en una PCR de colonias, y el tiempo suficiente para la detección en la electroforesis en gel estándar. </li><li> Para cada candidato y la cepa original como control positivo, resuspender un poco (cantidad de una cabeza de alfiler) de material celular de una sola colonia con un palillo de dientes en 20 l de NaOH 0,02 M. Incubar a TA durante 30 min. NOTA: Utilice colonias frescas. Si las placas son mayores de 1 semana de re-consecutivas para obtener una colonia fresca. </li><li> Utilice 1 l de la suspensión celular para la PCR inmediatamente. Ejecutar una reacción de PCR estándar y analizar los fragmentos resultantes. NOTA: Estas muestras no se pueden almacenar. NOTA: Este pruebas de PCR para la presencia del gen de tipo salvaje y de este modo permite la rápida identificación de cand negativoidates en el que no se ha sustituido el gen de interés. se descartarán clones que producen bandas en esta reacción PCR. Uno de tales clones negativa de todos modos debe realizarse a lo largo de como un control negativo adicional. Los candidatos que tengan un producto de PCR tienen que analizarse más. Para los genes sin efectos perjudiciales aproximadamente la mitad de los candidatos debe contener el gen de tipo salvaje, mientras que el otro medio no debe dar lugar a una banda. Esto correspondería a una tasa de recombinación homóloga de 50%. </li></ol></li><li> Segunda PCR de diagnóstico <ol><li> Preparación de ADN genómico. NOTA: El DNA genómico (gDNA) se puede preparar usando dos protocolos diferentes. La primera consiste en reactivos tóxicos como el fenol y cloroformo y, por tanto, deberán ser manejados solamente por los investigadores experimentados (que se describen en 4.2.1.1 a 4.2.1.5), mientras que el segundo también puede ser manejado por los estudiantes menos experimentados (que se describen en 4.2.1.6 a 4,2. 1,11). Ambos protocolos están trabajando de forma fiable. Paso 4.2.1.1 es idéntica para ambos protocoles. <ol><li> Inocular 5 ml Yeps-Light con cada candidato y se incuba en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C. Drop 2 l de la cultura en una placa CM. Mantener el cultivo estéril. NOTA: A continuación se presenta un protocolo estándar (PRECAUCIÓN: pasos tóxicos). </li><li> Poner 1 cucharada (~ 200 l) de perlas de vidrio lavadas-HCl para tubos de 2 ml. Añadir 2 ml de la U. cultura maydis. Girar 12.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante (pellet puede congelarse en esta etapa). Añadir 500 l de fenol / cloroformo / Alcohol isoamílico (25: 24: 1) al sedimento. ¡PRECAUCIÓN! El fenol es TÓXICO! </li><li> Añadir 500 l Usti-buffer de lisis 1. Agitar durante 6 a 10 minutos en un Vibrax a 1.000 rpm. Compruebe que el sedimento celular se resuspendió completamente, pero evite extendida agitación para evitar el cizallamiento del gDNA. Girar a 12.000 xg durante 15 min. Transferir 400 l de la fase acuosa en el nuevo tubo de reacción (no toque la interfase). </li><li> Añadir 1 ml 100% (v / v) de etanol. 3x invertir los tubos para mezclar, observar la cen voz alta de ADN que aparece en breve. Girar a 12.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y lavar con 200 l 70% de EtOH. No resuspender el precipitado en esta etapa. </li><li> Aspirar el sobrenadante por completo (no deje que el pellet se seque por completo). Añadir 50 l de TE / RNasa. Disolver gDNA por agitación a 400 rpm a 50 ° C durante 10 min. Analizar 2 l de la gDNA en un gel de agarosa al 0,8% 20. NOTA: Los siguientes pasos comprenden un protocolo alternativo no tóxico. </li></ol></li><li> Preparación alternativa de ADN genómico <ol><li> Poner 1 cucharada (~ 200 l) de HCl lava perlas de vidrio para tubos de 2 ml. Añadir 2 ml de la U. cultura maydis y centrifugado a 12.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante (gránulos se pueden congelar en esta etapa). </li><li> Añadir 500 l Usti tampón de lisis 2 al sedimento. Agitar durante 5 a 15 min en un Vibrax a 1000 rpm. Compruebe que el sedimento celular se resuspendió completamente. </li><li> Incubar los tubos a 65 ° C durante 15 a 20 min. usando aproincubadoras adecuadas diseñadas para albergar tubos de 2 ml es crítica. A continuación, colocarlo en hielo durante 5 min. </li><li> Añadir 100 l 8 M acetato de potasio, vórtice o invertir 8 a 10 veces. Girar 12.000 xg durante 15 min a TA. </li><li> Transferencia de 500 l del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 400 l de isopropanol. Vortex o invertido 8 a 10 veces. Girar 12.000 xg durante 15 min. Aspirar el sobrenadante y lavar con 500 l 70% de EtOH. Girar 12.000 xg durante 5 min. </li><li> Empapa del sobrenadante por completo! Con el tiempo, añadir un breve centrifugado (10 seg) para eliminar el líquido residual. Dejar que el ADN seco de pellets de 3 a 5 minutos. Añadir 50 l TE / ARNasa y se incuba a 50 ° C durante 10 a 15 min a 400 rpm. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> Diseño dos pares de cebadores con uno de ellos fuera de la unión de los flancos y la correspondiente unión dentro del casete de resistencia (UF-f, RC-R; RC-f, DF-r, Figura 1) 9. </li><li> Utilice 1 l de una dilución 1:10 de la gDNA de cada candidato como una plantilla en 2 reacciones de PCR verificación de la correcta inserción de aguas arriba y aguas abajo 9. </li><li> Utilice reacciones PCR estándar para cada candidato y analizar los fragmentos generados 22. Nota: estos PCRs de ensayo para la inserción de la casete de resistencia en el locus genómico correcto. Si los productos se obtienen por ambos lados, el candidato es probable que una inserción correcta. Sin embargo, también candidatos en el que sólo uno de los lados (aguas arriba o aguas abajo) se pudo confirmar deben llevarse a lo largo para su posterior análisis en caso de que las reacciones de PCR simplemente fracasaron por un flanco. </li></ol></li></ol></li><li> Verificación de la inserción genómica correcta por Southern Blot Analysis 22 <ol><li> Digerir 15 l de ADNg (4.2.1) de los candidatos mutantes y la correspondiente cepa de tipo salvaje / progenitor con una enzima apropiada que corta fuera del locus / construir y además, corta o bien en el gen o en el casete de resistencia que conduce a claramente distpatrones inguishable (Figura 1) 8. NOTA: Ninguna de las bandas esperadas debe ser mayor de 10 kb, de manera que sean claramente distinguibles de ADN no digerido. </li><li> Utilice la aguas arriba y aguas abajo del flanco como sondas. Etiquetarlos por ejemplo, utilizar el kit de etiquetado PCR DIG o cualquier método estándar similar. Mezclar las sondas marcadas en una proporción de 1: 1 moleculares y llevar a cabo la transferencia de Southern. Mantenga por lo menos dos transformantes independientes correctas. NOTA: El patrón de tipo salvaje debe ser claramente detectable en la cepa original y los clones correctos debe contener solamente las bandas esperadas. las bandas adicionales sólo presentes en los candidatos indican otras inserciones de la construcción en un lugar equivocado. Dichos clones deben ser desechados. El candidato negativos identificados en el primer diagnóstico de PCR debe contener las bandas de tipo salvaje y las bandas (impredecibles en el tamaño) de la construcción de deleción integrado erróneamente. </li></ol></li><li> Las existencias de glicerol NOTA: las existencias de glicerol sirven para mantener los clones durante años en colecciones de cepas. Al menos dos transformantes independientes deben mantenerse para cada mutante. Esto permite que comparan los fenotipos que deben ser idénticos. <ol><li> Crecer 5 ml de cultivos de las cepas mutantes confirmados en Yeps-Light en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C Mix 500 l de cada cultivo con 500 l NSY-glicerol-medio. Invertir tubo hasta que la cultura y el medio estén bien mezclados. El glicerol en el medio impide la formación de cristales de hielo. </li><li> Congelar a -80 ° C. Re-racha de una parte del cultivo congelado para comprobar si la acción es funcional. </li></ol></li></ol> 5. microscópicos fenotipos <ol><li> Crecer 5 ml de cultivos de tipo salvaje y cepas mutantes en Yeps-Light en una rueda giratoria durante 12 horas a 28 ° C. </li><li> Al día siguiente, se diluye la cultura a un OD 600 de alrededor de 0,1 y crecer él hasta una OD 600 entre 0,5 y 0,7. Un OD 600 de 1,0 correspgundos a aproximadamente 1 a 2 x 10 7 U. maydis células por ml. </li><li> Inspeccionar la morfología de las células al microscopio. NOTA: Healthy células aparecen en forma de cigarro (Figura 4, WT). vacuolas pronunciadas o la formación de filamentos indican que se destacaron las células. NOTA: En función del fenotipo mutante era de esperar, el análisis se puede adaptar, por ejemplo, si se utilizan reportero cepas del ensayo apropiado se puede llevar a cabo en esta etapa. Si la morfología celular se debe llevar a cabo el análisis estadístico cambiado, por ejemplo, para determinar la longitud de la célula media. </li></ol> 6. Ensayo de infección NOTA: El ensayo de infección de las plántulas se ha visualizado anteriormente en esta revista 11. Se puede ser llevado a cabo utilizando un fondo cepa haploide solopathogenic como SG200 10 o mediante la mezcla de los socios de acoplamiento compatibles que porten la mutación. <ol><li> Crecer al menos un 40 por plántulas de maízcepa durante 7 días a un ciclo de luz de 16 horas, 200 E · 28 ° C / 22 ° C (día / noche). Deben estar en la etapa de 3 hojas y 10-15 cm de alto hasta el día de la infección. </li><li> Dos días antes de la infección, iniciar un pre-cultivo de las cepas en 5 ml Yeps-Light en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 ° C. Crecer un cultivo principal en 50 ml Yeps-Luz hasta DO600 = 1,0 (tasa de división celular = 2 horas, permiten 3 divisiones mínimo, se puede hacer S / N). </li><li> Centrifugar las células de cultivo de 50 ml a 1500 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Lavar 3 veces con H2O estéril Resuspender las células en H2O estéril a un OD 600 de 3,0. Si es necesario, mezclar los socios de apareamiento. </li><li> Inyectar 250 - 500 l de las suspensiones de células en el tallo de las plántulas de maíz de edad 7 días usando una jeringa pequeña. Utilice H2O estéril como control. Mantenga plántulas infectadas durante 7-14 días adicionales en las mismas condiciones de luz y temperatura. Anotar el fenotipo de cada planta unaegún sana, clorosis, la formación de antocianinas, los tumores pequeños, los tumores grandes, plantas muertas 10. NOTA: La puntuación puede hacerse tan pronto como 7 días y se repite a los 14 días para seguir la infección con el tiempo. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se describe cómo generar mutantes de deleción para estudios de genética inversa en U. maydis. El punto de partida es una construcción de deleción que contiene secuencias flanqueantes del gen de interés que contiene secuencias de aproximadamente 1 kb aguas arriba del inicio y aguas abajo del codón de parada, así como un casete de resistencia apropiada, ya que estaba previamente optimizado 7,9 . Las construcciones que se han generado de forma individual para cada gen y verificado cuidado...

Ustilago maydis es un modelo de hongo fitopatógeno que se ha estudiado ampliamente durante décadas 1,2. Existe en dos morfologías, una etapa similar a la levadura, no patógena y un filamentosos, forma infecciosa 3. Descubrimientos importantes universales, como los mecanismos de recombinación y reparación del ADN homólogas se hicieron en la etapa de crecimiento similar a la levadura de este hongo 4. Por otra parte, el interruptor morfológica de los filamentos y factores de virulencia infecciosas importantes para la infección son bien caracterizado 5,6. El conocimiento acerca de la biología molecular creciente y la virulencia de este hongo tizón se basa en una estrategia de sustitución de genes sencillo 7-9 apoyado por una excelente anotación del genoma 10 y la facilidad de uso de la genética inversa, por ejemplo, la colección de plásmido bien organizado en nuestro instituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). , ensayos de infección estandarizados rápidos en el maíz seedlings permiten estudios detallados de patogenicidad factores 11. El genoma de U. maydis contiene alrededor de 6.900 genes 10. Para el estudio de su función, se pueden eliminar individualmente o en combinación debido a un sistema de recombinación homóloga eficiente. Regiones flanqueantes de alrededor de 1 kb que contienen extremos perfectamente homólogas son ideales para las tasas de recombinación homóloga mayor que 50%, pero ya 250 pb con extremos no homólogos permiten cierto grado de correcta integración de la construcción 9. En la actualidad, cinco casetes de resistencia diferentes, HygR, CBXR, Nat, G418r, y phleoR que media la resistencia contra la higromicina, carboxina, nourseothricin, G418 y fleomicina, se emplean para seleccionar los transformantes 7,9. Además, la resistencia a la higromicina se ha desarrollado en un casete reciclable (FRT-HygR) que se puede quitar por la expresión transitoria de una recombinasa FLP heterólogo 12. Esto permite la eliminación de la casete de resistencia y por lo tanto, en teoría, las modificaciones genéticas ilimitadas. Fleomicina es mutagénico 13, de modo que con los nuevos cassettes, en particular el casete reciclable HygR, el uso de phleoR está disminuyendo. Mutantes cuádruples por lo tanto se pueden generar utilizando los otros cuatro cassettes, pero para los mutantes quíntuples, se recomienda el sistema FRT-HygR 14. Esta estrategia general de supresión de genes ha sido transferido con éxito a otros hongos tales como tizón Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, o U. esculenta 17 y por lo tanto ofrece la posibilidad de nuevas aplicaciones en organismos genéticamente aún intratables con un sistema de recombinación homóloga eficiente. Por otra parte, los organismos que carecen de recombinación homóloga pueden ser modificados para mejorar la ingeniería genética como se ejemplifica por la deleción de genes implicados en no homóloga-end-unirse en Neurospora crassa 18,19. Aquí se describe la estrategia de supresión de genes publicado por U. maydis 7,9 en detalle experimental con un enfoque en la verificación rápida y precisa de los candidatos. A modo de ejemplo, podemos utilizar las quitinasas fúngicas y representan la generación de mutantes individuales, así como la supresión de múltiples cepas 20,21. Quitinasas son ejemplos interesantes, ya que actúan sobre la quitina en la pared celular rígida. Se requiere remodelación de la pared celular de los cambios morfológicos durante la división celular, cambiar a un crecimiento filamentoso, y la formación de esporas. Por lo tanto, en los mutantes de deleción se puede esperar que los fenotipos de todo el ciclo de vida.

<table><tbody><tr><td>Ácido aminobenzoeico (ácido libre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar&nbsp;</td><td>BD</td><td>214010</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD 211677</td><td></td><td>utilice alternativamente</td></tr><tr><td>el extracto de levadura Bacto del proveedor local&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>10234</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr><tr><td>Carboxin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos de Casamino&nbsp;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>Colircloruro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>ChemSolute</td><td>24,321,000</td><td>alternativamente use el proveedor local</td></tr><tr><td>CuSO4*5H2O</td><td>Fluka</td><td>61240</td><td>alternativamente use el proveedor local</td></tr><tr><td>D(+)Sacarosa&nbsp;</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>alternativamente utilice el proveedor local</td></tr><tr><td>ADN degr. ácido libre &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3*6H2O</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>10288</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Geneticin (G418) sal de disulfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma enzimas lisantes Sigma</td><td>Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucosa</td><td>Caelo</td><td>2580</td><td>o utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G065015</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td>Dangerous substance. Consulte las instrucciones de seguridad del fabricante.</td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B-solución</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>Sustancia peligrosa.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>26764298</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td><td>o utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>MgSO4 sin agua</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td> La <td>ausencia de agua es fundamental. Alternativamente, utilice el proveedor local</td></tr><tr><td>MnCl2*4H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td>, <td>alternativamente utilice el proveedor local</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA*2H2O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>o utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Na2MoO4*2H2O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>utiliza alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12174</td> utilizar <td>alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13.751.000</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Ácido nicotínico (ácido libre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dihidrógeno de nuresteotricina &nbsp; &nbsp;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5,001,000</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de nutrientes&nbsp;</td><td>Proveedores locales</td> <td>de Difco</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1) pH 6.7</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803</td><td>Sustancia peligrosa. Consulte las instrucciones de seguridad del fabricante.</td></tr><tr><td>polietilenglicol (PEG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>AppliChem</td><td>121479</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Pyridoxin (monoclorhidrato)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td> alternativamente <td>use</td></tr><tr><td>la jeringa pequeña</td><td>del</td> proveedor local BD <td>300300</td><td>alternativamente use</td></tr> el <tr><td>filtro estéril del proveedor local, 22 y micro; m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td> utilice <td>alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>clorhidrato de tiamina</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>tri-Na-Citrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S332060</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Tris- (hidroximetil) aminometano</td><td>VWR</td><td>103156X</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>de clorhidrato Tris</td><td>Roth</td><td>9090.4</td><td>utilice alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Serva&nbsp;</td><td>37240</td> utilizar <td>alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Fluka</td><td>96470</td><td>utilizar alternativamente el proveedor local</td></tr><tr><td>Composición de las soluciones/preparación del material</td><td></td><td></td><td>Composición de las soluciones</td></tr><tr><td>Stock de carboxina</td><td></td><td></td><td>: 5 mg/ml en metanol, concentración final: 2 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Placas CM</td><td></td><td></td><td>0,25 % (p/v) Ácidos Casamino, 0,1 % (p/v) Extracto de levadura, 1,0 % (v/v) Solución vitamínica Holliday, 6,25 % (v/v); Solución salina de Holliday, 0,05 % (p/v) de ADN degr. ácido libre, 0,15 % (p/v) de NH4NO3, 2,0 % (p/v) de agar Bacto; ajuste a pH 7.0 usando NaOH 5 M; Después de esterilizar en autoclave, agregue 1 % de glucosa &nbsp;</td></tr><tr><td>Genética (G418)</td><td></td><td></td><td>Stock: 50 mg/ml en H2O, concentración final: 500 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>de HCl Perlas de vidrio lavadas (0,35-0,45 mm)</td><td></td><td></td><td>Cubra las perlas de vidrio con HCl concentrado (25 %, 7,8 M) e incube durante 60 min. Balancee varias veces. Decantar HCl (mantener el líquido decantado) y lavar las perlas de vidrio con 3 M HCl (mantener el líquido decantado). Lave las perlas de vidrio varias veces con H2O de doble destilación hasta que el pH sea 7 (el líquido ya no debe ser amarillo-verdoso). Alícuota las cuentas de vidrio y sécalas a 180 &deg;C. El HCl decantado debe neutralizarse antes de su eliminación.</td></tr><tr><td>Stock de heparina</td><td></td><td></td><td>: 15 mg/ml</td></tr><tr><td>solución</td><td></td><td></td> salina de Holliday <td>16.0 &permil; (s/v) KH2PO4, 4.0 y permil; (s/v) Na2SO4, 8.0 y permil; (s/v) KCl, 1.32 y permil; (s/v) CaCl2*2H2O, 8.0 &permil; (v/v) oligoelementos, 2.0 y permil; (s/v) MgSO4; filtrado estéril</td></tr><tr><td>solución vitamínica Holliday &nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 y permil; (s/v) Tiamina, 0,05 y por mil; (s/v) Riboflavina, 0,05 y permil; (s/v) Piridoxina, 0,2 y permil; (s/v) Ca-Pantothenat, (0,05&permil; (s/v) Ácido aminobenzoeico, 0,2 y permil; (s/v) Ácido nicotínico, 0,2 y permil; (s/v) Cloruro de colincloruro, 1.0 y permil; (w/v) mio-Inositol; se puede almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Stock de higromicina</td><td></td><td></td><td>: 50 mg/ml en PBS, concentración final: 200 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>Stock de Nourseotricina</td><td></td><td></td><td>: 200 mg/ml en H2O, concentración final: 150 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>NSY-glicerol-medio</td><td></td><td></td><td>0,8 % (p/v) Caldo de nutrientes, 0,1 % (p/v) Extracto de levadura, 0,5 % (p/v) de sacarosa,&nbsp; 80,0 % (v/v) 87% Glicerina (f.c. 69,6%)&nbsp;</td></tr><tr><td>RegLight</td><td></td><td></td><td>1,0 % (p/v) Extracto de levadura &nbsp; 0,4 % (p/v) Bacto Peptona, 0,4 % (p/v) de sacarosa, 18,22 % (p/v) de sorbitol, 1,5 % (p/v) Agar</td></tr><tr><td>SCS, pH 5,8</td><td></td><td></td><td>Solución 1: 20 mM de tri-Na-citrato, 1 M de sorbitol; colución 2: 20 mM de ácido cítrico, 1 M de sorbitol, añadir la solución 2 en la solución 1 hasta alcanzar un pH de 5,8; autoclave</td></tr><tr><td>STC, pH 8</td><td></td><td></td><td>1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2; filtro</td></tr><tr><td>estéril STC/PEG</td><td></td><td></td><td>40 % (v/v) PEG en tampón STC&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón TE, pH 8</td><td></td><td></td><td>1,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O</td></tr><tr><td>TE/RNasa</td><td></td><td></td><td>10 y micro; g/ml de RNasa en tampón TE</td></tr><tr><td>Oligoelementos</td><td></td><td></td><td>0,06&permil; (s/v) H3BO3, 0.14&permil; (s/v) MnCl*4H2O, 0.4 &permil; (s/v) ZnCl2, 0.4 y permil; (s/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 &permil; (s/v) FeCl3*6H2O, 0.04&permil; (s/v) CuSO4*5H2O</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de enzimas lisantes de Trichoderma</td><td>12,5 mg/ml SCS; filtro estéril; preparar poco antes de usar</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7,5</td><td></td><td></td><td>806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; comprobar el pH y, si es necesario, ajustar con HCl;</td></tr><tr><td>autoclave Tampón de usitis 1, pH 8</td><td></td><td></td><td>10 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM de NaCl, 1% (p/v) de SDS, 2% (v/v) de TritonX-100, 1 mM de EDTA. No mida el pH con un medidor de pH.</td></tr><tr><td>Tampón de usti-lisis 2</td><td></td><td></td><td>mezcle el tampón de lisis Usti 1 con 1x TE en una proporción de 1:1</td></tr><tr><td>YEPS-Medio</td><td></td><td></td> ligero <td>1,0% (p/v) Extracto de levadura, 0,4% (p/v) Bacto Peptona, 0,4% (p/v) Sacarosa, para placas: 1,5% (p/v) Bacto Agar</td></tr></tbody></table>

la manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; ustilago maydis</em&gt; estudiar biología de hongos y plantas microbe interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

supresión de genes juega un papel importante en el análisis de la función génica. Uno de los métodos más eficaces para interrumpir genes de una manera dirigida es la sustitución de la totalidad del gen con un marcador seleccionable a través de recombinación homóloga. Durante la recombinación homóloga, el intercambio de ADN se lleva a cabo entre las secuencias con alta similitud. Por lo tanto, las secuencias genómicas lineales que flanquean un gen diana se pueden utilizar para dirigir específicamente un marcador seleccionable para el sitio de integración deseado. Los extremos romos de la construcción de deleción activan sistemas de reparación del ADN de la célula y de ese modo promover la integración de la construcción, ya sea a través de recombinación homóloga o por no homóloga de extremo de unión. En los organismos con recombinación homóloga eficiente, la tasa de éxito de la deleción del gen puede alcanzar más de 50% haciendo de esta estrategia de un sistema de interrupción de genes valiosos. El hongo Ustilago maydis es carbón de un microorganismo eucariota modelo que muestra tales recombinantes, homóloga eficienteion. Fuera de sus cerca de 6.900 genes, muchos se han caracterizado funcionalmente con la ayuda de mutantes de deleción, y el fracaso de sustitución de genes puntos repetidos intentos en función esencial del gen. caracterización posterior de la función del gen mediante el etiquetado con marcadores fluorescentes o mutaciones de dominios predichos también se basa en el intercambio de ADN a través de recombinación homóloga. A continuación, presentamos la U. maydis estrategia de generación de la tensión en detalle utilizando el ejemplo más simple, la deleción del gen.

Las construcciones de deleción para los cuatro genes quitinolíticas codificados en la U. maydis genoma fueron generados por clonación Golden Gate de utilizar la cinta para la eliminación de HygR CTS1, el NATR para la eliminación de CTS2, el casete G418r para la eliminación de cts3 y la CBXR para la eliminación de cts4 20. Una visión general de la estrategia de sustitución de genes se ejemplifica m...

Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

El objetivo general de este protocolo es modificar genéticamente el hongo del carbón, ustilago maydis. Este método de generación de cepas permite la caracterización funcional de genes de diversas maneras. Por ejemplo, podemos eliminar los genes, podemos intercambiar los promotus, o podemos generar construcciones de fusión.La principal ventaja de este método es que podemos verificar con precisión la modificación, de modo que cualquier fenotipo se puede relacionar directamente con el cambio en el gen de interés. La demostración visual de este método es esencial, porque saber cuándo detener la reacción protoplastiva es fundamental para una transformación exitosa. En preparación, enfríe dos tubos inferiores redondos de mililitros a menos 20 grados centígrados.A continuación, inocular un precultivo de tres mililitros en YEPS-Light utilizando una placa fresca. Incubarlo durante 24 horas en una rueda giratoria a 28 grados centígrados. Al día siguiente, agregue 25 microlitros del precultivo a 50 mililitros de YEPS-Light en un matraz con deflectores.Luego, haga crecer el cultivo en un agitador orbital hasta que alcance la fase exponencial. Una densidad óptica de 1,0 corresponde a una o dos veces 10 a la séptima celda en ustilago maydis. Compruebe la densidad óptica a 600 nanómetros.Un valor de 0,6 a 1,0 es aceptable. A continuación, compruebe si las celdas están contaminadas con un aumento de 40x. Las contaminaciones bacterianas se pueden identificar como células pequeñas y que a menudo se mueven.Las contaminaciones fúngicas se pueden identificar en función de su forma o tamaño. Deseche siempre los cultivos contaminados y trabaje solo a partir de los limpios. Después de peletizar las células durante cinco minutos a 1, 500 G, deseche el supernantant.A continuación, vuelva a suspender el pellet en 25 mililitros de SCS. Repita la centrifugación. Y mientras tanto, prepare tres mililitros de solución protoplastiva por pellet de celda.Pase esta solución a través de un filtro de 22 micras. Ahora deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de solución protoplastina. Luego deje reposar las celdas a temperatura ambiente hasta que el 30 al 40% de ellas sean redondas o en forma de cabeza de alfiler.La reacción puede tardar de cinco a 20 minutos. Comience a observarlo bajo el microscopio después de cinco minutos. Para obtener la máxima eficiencia de transformación, la reacción protoplástica debe detenerse en el momento adecuado.Y luego, los protoplastos hay que manipularlos con mucho cuidado como si fueran pompas de jabón. Proceda con el protocolo, manteniendo siempre los protoplastos en hielo. El siguiente paso es lavarlos con 10 mililitros de SCS frío, y luego recogerlos con un centrifugado de cinco minutos a 1.000 G. Repita este paso de lavado un total de tres veces.Después de los lavados, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de STC frío. A continuación, recoja las células de nuevo con otro centrifugado de cinco minutos a 1.000 G, seguido de una nueva suspensión en 1 mililitro de STC frío. Ahora haga 100 alícuotas de microlitros en los tubos fríos y almacene estas alícuotas a menos 80 grados centígrados.Para transformar los protoplastos de ustilago maydis, prepare dos selecciones por transformación. Primero, derrita el agar RegLight y enfríelo a 60 grados centígrados. Luego, a un poco de agar derretido, agregue el antibiótico selectivo al doble de la concentración de trabajo y agregue 12 mililitros a cada placa para formar la capa inferior.La muestra debe mezclarse con cuidado. Evita hacer burbujas. Mantenga el RegLight restante sin antibióticos a 60 grados centígrados.A continuación, descongele un tubo de protoplastos en hielo para cada transformación. Una vez descongelado, agregue un microlitro de solución de heparina y un microgramo de ADN de construcción linealizado. Luego manténgalos en hielo durante 10 minutos.Mientras espera, esparce 12 mililitros de RegLight sin antibióticos sobre RegLight con antibióticos. A continuación, añade 500 microlitros de STC/PEG a cada tubo de transformación y mézclalos cuidadosamente con las inversiones. Luego continúe la incubación en hielo durante 15 minutos más.Ahora distribuya cada reacción de transformación en dos placas RegLight selectivas separadas. Asegúrese de que todo el líquido haya empapado las placas antes de continuar. Luego, incube las placas en posición vertical a 28 grados centígrados durante cinco a siete días para obtener de 100 a 200 colonias.Si solo crecen unas pocas colonias, los protoplastos pueden contener demasiada pared celular, y esto se puede probar transformándolos con un plasma de fabricación celular o es posible que no puedan regenerarse y esto se puede probar plantándolos en placas sin antibióticos. Más tarde, seleccione 24 transformantes para realizar pruebas. Vuelva a purificarlos en YEPS-Light selectivo para obtener colonias individuales.En cada plato, también raye un poco de la cepa original para asegurarse de que los antibióticos estén seleccionando contra los no transformantes. Es fundamental verificar las mutaciones mediante un proceso de tres pasos que implica dos PCR y un análisis de Southern Blot. Estos se detallan en el protocolo de texto.En esta sección se explica cómo preparar el ADN genómico necesario para estos análisis. Primero, inocular cinco mililitros de YEPS-Light con el transformante candidato e incubarlo en una rueda giratoria durante 24 horas a 28 grados centígrados. Al día siguiente, coloque dos microlitros del cultivo en una placa CM.Mantenga el cultivo estéril. Luego prepare un tubo de dos mililitros con unos 200 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido clorhídrico y dos mililitros del cultivo de 24 horas. Después de girar el tubo a 12.000 g durante cinco minutos, aspire y deseche el sobrenadante.Al pellet, que se puede congelar para su almacenamiento, se añaden 500 microlitros de tampón usti-lysis dos. A continuación, agite el tubo a 1.000 rpm en un Vibrax durante cinco a 15 minutos. Asegúrese de que las células se vuelvan a suspender por completo, luego incube el tubo a 65 grados centígrados durante 15 a 20 minutos.A continuación, coloque el tubo en hielo durante cinco minutos. Una vez enfriado, añadir 100 microlitros de acetato potásico de 8 molares, y aplicar un breve vórtice, o diez inversiones. A continuación, gire el tubo a 12.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.A continuación, se alícuota 500 microlitros del sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros, y se añaden 400 microlitros de isopropanol a la alícuota. Después de mezclar, gire el tubo durante cinco minutos a 12.000 G. Deseche el sobrenadante y lave el ADN granulado con 500 microlitros de etanol al 70%. Ahora aplica un giro de cinco minutos y retira completamente el sobrenadante.Después de otro breve giro, deje que la bolita de ADN se seque al aire durante unos minutos y luego agregue 50 microlitros de RNasa NTE. Después de agregar la RNasa, incubar agitando y luego proceder a usar el ADN para los análisis. Se generaron secuencialmente mutantes simples y dobles de las chintinasas cts3 delta y mutantes múltiples con hasta los otros tres genes de quitinasa con las mismas construcciones en dos fondos genéticos diferentes.Los transformantes se confirmaron por PCR y luego por análisis de Southern Blot. Para el gen cts3, la tasa de recombinación homóloga fue del 70% en la cepa SG200, lo que sugiere que cts3 tiene una función no esencial. Algunas de las mutaciones conducen a defectos evidentes de crecimiento.Por ejemplo, el doble mutante cts1/2 tenía un defecto de separación celular pronunciado. La tinción de los tabiques mostró que la citocinesis se completaría, pero las células permanecerían conectadas. Para probar la contribución de las quitinasas a la virulencia, se llevaron a cabo ensayos de infección de plántulas utilizando los mutantes de la cepa SG200.Si bien la mutación de un gen controlado, khd4, redujo la virulencia, la deleción de todas las quitinasas no afectó la infección de las plántulas de maíz. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modificar genéticamente hongos de carbón como el ustilago maydis. Una vez dominadas, las cepas se pueden generar fácilmente en unas cuatro semanas.Al utilizar este procedimiento, es muy importante planificar el detalle de la verificación de la cepa mediante el uso de futuros programas de clonación. Haga esto antes de empezar a trabajar con cultivos fúngicos. Con ligeras modificaciones en este procedimiento, otros hongos del carbón como el sporsorium reilianum o el ustilago esculenta o incluso hongos filamentosos, como la piriformospora indica, pueden modificarse genéticamente.No olvide que el trabajo con organismos genéticamente modificados debe llevarse a cabo de acuerdo con las regulaciones de su país.

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Investigación

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Genetics

Genética

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