Name: La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a preparar cortes oblicuos de médula espinal en ratones P2-P11 para estimulación de raíces ventrales. Esta técnica permite identificar motoneuronas y estudiar células ventrales inervadas por colaterales axonales motoneuronales en investigación neurofisiológica.

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Los autores agradecen a Marin Manuel y Olivia Goldman-Szwajkajzer por su ayuda en la toma de las fotografías. Los autores también agradecen a Arjun Masukar y Tobias Bock para la corrección del manuscrito. Ayudas económicas fueron proporcionados por la Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429/01), el NIH NINDS (R01NS077863), la Fundación Latran Thierry (OHEX Proyecto), la Asociación Francesa de miopatía ( la subvención número 16026) y Target ALS se agradece. Felix Leroy era el destinatario de un &quot;Contrato de Doctorado&quot; de la Escuela Normal Superior, Cachan.

Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas europeas (86/609 / CEE y 2010 a 63-UE) y la legislación francesa, y fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de París Descartes. 1. Preparación de la rebanada de la médula espinal <ol><li> Preparar las siguientes soluciones diarias o un día de antelación. Si se mantiene durante toda la noche, la burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO2 y mantener refrigerado en frascos bien cerrados. <ol><li> Prepare baja Na + fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF): KCl 3 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, sacarosa 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl2, 25 mM de glucosa, ácido ascórbico 0,4 mM, 1 mM Na-quinurenato, 2 mM Na-piruvato. Burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO 2 (pH 7,4). Desde Na-quinurenato es a menudo difícil de disolver, asegúrese de comprar la que aparece en la tabla de materiales. </li><li> Preparar Solu K-gluconatoción: 130 mM K-gluconato, mM KCl 15, EGTA 0,05 mM, HEPES 20 mM, glucosa 25 mM, 1 mM Na-quinurenato, 2 mM Na-piruvato, se ajustó a pH 7,4 con KOH. </li><li> Preparar ACSF: NaCl 130 mM, KCl 2,5 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, glucosa 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 2 mM Na-piruvato. Burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO 2 (pH 7,4). </li><li> Antes del comienzo de la disección, se disuelven 2% de agar en 80 ml de la solución de K-gluconato, y mantener caliente a 60 ° C. </li></ol></li><li> perfusión intracardiaca <ol><li> Realizar esta preparación en ratones hembras y machos, con edades de P2 a P11. </li><li> Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de 25 mM de sodio pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> El uso de agujas o cinta, se debe inmovilizar el ratón sobre su espalda en una gran placa de Petri llena de silicio. Use un microscop diseccióne para el resto de la disección. </li><li> Sujetando la punta del esternón, levantar el pecho y cortar el diafragma utilizando unas tijeras finas. A continuación, abrir el pecho en ambos lados por el corte a través de las costillas para exponer el corazón. </li><li> Cortar la aurícula derecha antes de la punción del ventrículo izquierdo con una aguja 27G. </li><li> Perfundir con helado de baja ACSF Na +. Después de 30 seg, bajo Na + ACSF debe considerarse que fluye de la aurícula. bajas cantidades de sodio evitar que las células de adición y reducir la muerte celular durante la disección. </li><li> Mantener la celebración de la aguja en el corazón bajo el microscopio de disección hasta que el hígado se vuelve amarillo cuando se drena la sangre. </li></ol></li><li> Disección de la médula espinal <ol><li> Decapitar al animal y lo puso en su estómago. </li><li> Eliminar rápidamente la piel de la espalda (Figura 1A1). Hacer dos cortes a través de los hombros y bajando la caja torácica (Figura 1A2). A continuación, corte el cable como low como sea posible en la sección de caudal con el fin de aislar la columna vertebral con el inicio de las nervaduras de la parte inferior del animal. Da la vuelta al animal de nuevo y retirar las vísceras todavía unido a las costillas. </li><li> Transferir la columna vertebral, a otra, más pequeña placa de Petri llena de silicio y el uso de 4 pines de insectos para sostenerlo hacia arriba dorsal (Figura 1A). </li><li> Continuamente perfundir el animal con ACSF carbógeno-burbujeó (a aproximadamente 4 ° C) mientras se realiza una laminectomía del lado dorsal, y la exposición de la médula espinal desde el extremo rostral (Figura 1B). Para ello, inserte la punta de tijeras finas entre el hueso y la médula espinal y cortar el hueso poco a poco desde el extremo rostral, asegurándose de mantenerse alejado de la sustancia blanca. Alternan en cada lado durante el uso de pinzas para mantener lejos de la banda del hueso ya cortada (Figura 1B1). </li><li> El uso de las tijeras de primavera disponibles más pequeños y pinzas, levante la dura y cortaen ambos lados mientras sostiene la parte suelta de la duramadre con el fin de evitar daños en la médula espinal con las tijeras. Corte a lo largo del eje rostro-caudal. NOTA: La duramadre es una membrana continua semi transparente; a esta edad la piamadre es demasiado frágil y se deshaga durante la disección y corte en rodajas (Figura 1B2). </li><li> Una vez que la duramadre es suprimido el uso de una copa roma o punta de plástico para empujar suavemente el cable en el lado izquierdo de la ranura formada por la columna vertebral mitad cortar, y cortar las raíces ventral y dorsal en el lado derecho, comenzando desde el lado rostral , más lejos de donde entran en el cable (unos pocos mm, al menos, la figura 1B2). </li><li> Repetir la operación en el lado izquierdo, siempre pasando de rostral a caudal. Si zurdo, comience desde el lado izquierdo y luego moverse hacia el lado derecho. </li></ol></li><li> Incorporación en agar <ol><li> Deslizar el cable fuera de la columna vertebral. Use un alfiler de insectos más pequeños de precisarel cordón con la superficie dorsal y quitar delicadamente cualquier pieza de membrana todavía unido a ella (Figura 1C1). </li><li> Una vez limpia, recortar ambos extremos (Figura 1C2). Inserte un alfiler de insectos doblada en la parte anterior de la cuerda para manipular el cable y tenga en cuenta su orientación (flecha en la figura 1C2). A continuación, la transferencia de la médula espinal a una solución de K-gluconato enfriado con hielo. NOTA: Esta solución imita la composición intracelular de la CSF y evitará que las células mueran de choque osmótico una vez que las motoneuronas se cortarán 26. </li><li> Una vez que la médula espinal se encuentra dentro de la solución intracelular, tomar el vaso de precipitados con el agar salir del baño seco y enfriarlo en una mezcla de hielo y agua. </li><li> Mantener la agitación mientras que la medición de la temperatura. Cuando la temperatura alcanza los 38 ° C sumergir la médula espinal, sujetándolo por el pasador de insectos y colocarlo lado rostral hacia abajo. Asegúrese de que la médula espinal es como straight posible, lejos de las paredes, parte caudal ligeramente hacia arriba (Figura 1D1). </li><li> Deje el vaso de precipitados en la mezcla de hielo y agua para permitir que el agar se solidifique lo más rápidamente posible. Asegúrese de que se mantiene en su lugar y que el cable es lo más recto posible (Figura 1D1). </li></ol></li><li> El rebanar <ol><li> Después de la solidificación, cortar el bloque de agar que contiene la médula espinal de una manera tal que la base del bloque es en un ángulo de 35 ° con la parte lumbar de la médula (flecha en la Figura 1D2). La superficie dorsal debe estar mirando hacia fuera de la base (Figura 1D2). NOTA: Este es un paso crítico en el procedimiento, para mantener la continuidad de las piscinas de las motoneuronas a las raíces ventrales de la que salen. </li><li> Pegar el bloque en la cámara de la vibratome utilizando pegamento de cianoacrilato. Sumergirla en una solución de K-gluconato y añadir solución de K-gluconato congelada para mantener slushedel baño de enfriado (por debajo de 2 ° C). </li><li> Cortar 350 - 400 micras rodajas gruesas de la región lumbar (identificable por la curvatura y el diámetro más grande). En su orientación correcta (véase 1.4.1.), Utilice la cuchilla para cortar desde el dorsal a la superficie ventral y hacer rodajas de forma continua más rostral. Típicamente, hay 4-5 rebanadas adecuados con raíces ventrales que se extienden de 2 mm o más. Utilice los siguientes parámetros: 10 ° de ángulo de referencia, la frecuencia de vibración de 70 Hz y 10 mm / min de velocidad de corte. </li></ol></li><li> Incubación <ol><li> Transferir las rebanadas de ACSF a 34 ° C. Después de aproximadamente 30 min, enfriar las rodajas a RT y comenzar la sesión de grabación. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> La figura 1. La disección A1:. La eliminación de la piel de la espalda para exponer la columna dorsal A2:El corte de los hombros y las costillas para liberar el dorsal columna B1:. La columna vertebral fijada en la placa de Petri de silicio-llenado (lado dorsal, de lado caudal izquierda) B2:. Lo mismo con la médula espinal expuesta y diseccionado C1:. Aislado de la médula espinal . (lado izquierdo rostral) C2: la médula espinal listo para ser incorporado (lado ventral hacia arriba, lado izquierdo rostral). Tenga en cuenta el pasador de insectos más pequeños en la parte rostral D1:.. De la médula espinal en el vaso de precipitados de agar (lado rostral Dow, lado ventral hacia la parte inferior) D2: bloque de agar Cortar con la médula espinal incrustado. Tenga en cuenta el ángulo de 35 ° las formas de la médula espinal con la base del bloque y la ampliación lumbar (Flecha). Las barras de escala 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Colocar la rebanada en la Cámara NOTA: Ventral raíces son de tamaño variable. <ol><li> Prepare una caja de varias pipetas con diámetros de punta que van desde 40 hasta 170 micras con antelación. Para preparar las pipetas de aspiración, preparar muchas pipetas con una larga puesta a punto. Usando un cuchillo de diamante, hacer un corte en diferentes posiciones. Entonces bajo un microscopio de disección, se rompen por golpear la punta con unas pinzas. </li><li> Retire la cámara del microscopio grabación y colocarlo bajo un microscopio de disección. </li><li> Seleccionar un segmento que contiene una raíz ventral de longitud suficiente (2 mm o más) para ser montado en un electrodo de estimulación de succión. Seleccione la orientación adecuada de la rebanada con las raíces ventrales hacia arriba (figura 2A) y cortar delicadamente el agar alrededor de las raíces ventrales, dejando el resto del agar alrededor de la rebanada (Figura 2B). NOTA: Debido a que el agar es más firme que la rodaja, esto permitirá que los hilos de anclaje de la rebanada para descansar en el agar en lugar de en la rebanada y por lo tanto la unanchor no dañará el tejido. Asegúrese de que los hilos de anclaje de la rebanada están por encima de la piscina de las neuronas motoras (se muestra en rojo en la figura 2C). </li><li> Montar la cámara de nuevo en el microscopio y perfundir continuamente la cámara de registro con ACSF a una velocidad de 1-2 ml / min, a temperatura ambiente. Usando una pipeta de vidrio lleno de ACSF y conectada a una jeringa, chupar uno de la raíz ventral (flecha en la Figura 2C). Con el fin de lograr una buena estimulación de la raíz ventral, la punta de la pipeta tiene que ser apretado alrededor de la raíz ventral. Un polo debe estar en el electrodo de estimulación y el otro en el baño (o conectado a la referencia de electrodo de conexión de sujeción). </li><li> Lograr la grabación de patch-clamp del tipo de célula deseado y registrar el efecto de la estimulación de la raíz ventral como se describe previsouly 10. <ol><li> Aquí, utilizar un amplificador para la adquisición de datos. Filtrar registros de células completas a las 3 kHz. Digitalizar a 10 kHz. Compensar la resistencia puente en curremodo nt-clamp. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figura 2. ventral Root Preparación R: Lumbar rebanada de la médula espinal incrustado en agar con la raíz ventral hacia arriba. B: Lumbar rebanada de la médula espinal con las raíces ventrales liberados del agar C:. Rebanada de la médula espinal lumbar con un electrodo de estimulación firmemente colocado alrededor de las raíces ventrales (flecha) . Tenga en cuenta la ubicación de las células de Renshaw que expresan fluorescencia roja en el 28 chrna2-Cre ratón cruzado con el reportero del ratón R26 Tom 17. Las barras de escala 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

rebanar oblicua de la médula espinal es importante ya que permite la estimulación unilateral de piscinas de neuronas motoras y las células de Renshaw en un solo segmento vertebral de una manera fiable, completa y específica. Además, se permite una identificación rápida, elegante y no ambigua de las motoneuronas grabados. A continuación, vamos a destacar las ventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de preparación rebanada, y luego vamos a insistir en las trampas más comunes a evitar al realizar este proc...

Históricamente, las grabaciones motoneuronas utilizando Sharp-electrodo se llevaron a cabo in vivo en animales grandes tales como gatos o ratas 1 o en una médula espinal enteros aislados en ratones 2. La aparición de la técnica de grabación de patch-clamp durante la década de 1980, llamado por el acceso directo a la motoneurona somas como el sellado necesario para conseguir bajo control visual. Por lo tanto, la preparación de la rebanada de la médula espinal se ha logrado fácilmente desde principios de 1990 3. Sin embargo, rebanada preparación temprana a menudo no permitía la estimulación de las raíces ventrales. A lo mejor de nuestro conocimiento, sólo dos estudios han informado de la estimulación exitosa de las raíces ventrales en rodajas transversales, y ninguno se obtuvo a partir de ratones 4,5. En este artículo se presenta una técnica para lograr las rebanadas de la médula espinal viables de ratones recién nacidos (P2 - P11) en el que la piscina de motoneuronas conserva sus raíces ventrales saliendo axones. Respiraderoestimulación de la raíz ral desencadena potencial de acción antidrómica de nuevo en los somas de las neuronas motoras de la piscina que sale de la misma raíz ventral. También excita los objetivos colaterales de neuronas motoras, otras motoneuronas 6-10 y las células de Renshaw 11-13. Dado que sólo motoneuronas envían sus axones hacia abajo las raíces ventrales, se utiliza el registro de los potenciales de acción antidrómicos como una forma sencilla y definitiva a physiologicaly identificar motoneuronas 10. Además de utilizar criterios electrofisiológicos y morfológicos potencialmente no incluido o engañosas para confirmar la identidad de las neuronas motoras, estudios recientes sobre las neuronas motoras de la médula espinal también se basó en tinciones tedioso y requiere mucho tiempo post hoc 16. Tal identificación se realiza generalmente sólo en una muestra de las células grabadas. Otras estrategias de identificación se basan en las líneas de ratón en el que las motoneuronas expresan la fluorescencia endógena <sup&gt; 17-19. Sin embargo, el uso de marcadores codificados genéticamente puede ser difícil a una edad temprana, cuando la expresión del marcador sigue siendo variable o si el estudio ya se requiere el uso de una línea de ratones transgénicos. Alternativamente, la acción antidrómica potenciales grabaciones se pueden realizar de forma rutinaria en todos los ratones desde el inicio de la grabación de la célula. Los experimentadores que trabajan en los preparativos de la médula espinal intacta en el gato, la rata y el ratón, se han utilizado de forma fiable estas técnicas de identificación desde la década de 1950 1,2,20,21. En condiciones óptimas, hemos sido capaces de provocar potenciales de acción antidrómicos de virtualmente todas las neuronas motoras registradas. Además, la estimulación de la raíz ventral se puede utilizar para excitar de forma fiable otros motoneuronas 22,23 o sus objetivos. las células de Renshaw 10,24,25. Presentamos aquí las aplicaciones de la estimulación de la raíz ventral en forma de acción antidrómica posibles grabaciones de somas de las neuronas motoras, así como la excitación de las células de Renshaw.

<table><tbody><tr><td>Na-quinurenato</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>se disuelve mejor que otras marcas</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Calidad Biológica</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>ácido glucónico</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de cesio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - 2,5 mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>solo se usa para cortar la duramadre, podría dañarse si se cortan los huesos</td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>A-M Systems</td><td>Estimulador de Pulso Aislado Modelo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Microtomo Vibratorio 7000 - Modelo 7000SMZ-2</td><td></td></tr></tbody></table>

la preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para root estimulación

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Registros electrofisiológicos de láminas de médula espinal han demostrado ser una técnica valiosa para investigar una amplia gama de preguntas, de celular a las propiedades de red. Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas viables de la médula espinal de ratones jóvenes (P2 - P11). En esta preparación, las motoneuronas conservan sus axones que sale de las raíces ventrales de la médula espinal. La estimulación de estos axones provoca back-propagan los potenciales de acción que invaden el somas de las neuronas motoras y emocionantes colaterales el motoneuronas en la médula espinal. Grabación de potenciales de acción antidrómicos es una forma inmediata, definitiva y elegante para caracterizar la identidad de las neuronas motoras, que supera a otros métodos de identificación. Además, la estimulación de las neuronas motoras colaterales es una manera simple y fiable para excitar los objetivos colaterales de las neuronas motoras en la médula espinal, tales como otros motoneuronas o Renshaw células. En este protocolo, se presentan grabaciones antidrómicos de la motoneurona somas, así como excitación de la célula de Renshaw, resultante de la estimulación de la raíz ventral.

La confirmación de la identidad Motoneuron base de los potenciales de acción antidrómica La orientación de la célula Motoneuronas se encuentran en el cuerno ventral (visible en rojo en la figura 2C). Comience desde el haz de axones que forman la raíz ventral y subir hasta que el haz se dispersa completamente y uno com...

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes oblicuos de la médula espinal que permitan la estimulación de las raíces ventrales. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación de motoneuronas para la estimulación de raíces ventrales y el estudio de las células ventrales inervadas por colaterales axónicos de motoneuronas. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando necesitábamos una forma confiable de estimular células ventrales.Las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la complejidad para ejecutar adecuadamente los diferentes pasos de la disección. Comience por perfundir un ratón P2 a P11 con ACSF de bajo contenido de sodio. Después de decapitar al ratón y retirar la piel de la espalda, realice dos cortes a través de los hombros y hacia abajo por la caja torácica.A continuación, corte la médula espinal lo más abajo posible en la sección caudal para aislar la columna vertebral y las costillas de la parte inferior del animal. Doble la columna vertebral y retire las vísceras que aún estén adheridas a las costillas. Transfiera la columna vertebral a otro plato de Petri más pequeño, relleno de silicona.Agregue ACSF frío y burbujee con carbógeno, y utilice cuatro alfileres para insectos para sujetar el tejido con la cara dorsal hacia arriba. Luego, realice una laminectomía del lado dorsal insertando primero la punta de unas tijeras finas entre el hueso y la médula espinal y cortando el hueso desde el extremo rostral, asegurándose de mantenerse alejado de la sustancia blanca. Alterne los cortes en cada lado mientras utiliza pinzas para sostener la banda de hueso ya seccionada.A continuación, utilice pinzas pequeñas para levantar la duramadre y tijeras pequeñas para cortar a lo largo del eje rostrocaudal en ambos lados. La eliminación de la duramadre es un paso crítico. Vale la pena dedicar unos minutos adicionales para hacerlo de manera exhaustiva.Una vez que se ha eliminado la dura, utilice una punta de vidrio roma para empujar suavemente la médula hacia el lado izquierdo del surco formado por la columna vertebral cortada por la mitad. Luego, corte las raíces ventrales y dorsales del lado brillante lo más lejos posible del punto donde entran en la médula. Repita la operación en el lado izquierdo, avanzando siempre de rostral a caudal.Después de la disección, extraiga la médula espinal de la columna vertebral. Luego, use un alfiler pequeño para insectos para fijar la médula con la superficie dorsal hacia arriba. Retire delicadamente cualquier fragmento de membrana adherida.Una vez limpiado, recorte ambos extremos del cordón e inserte un alfiler para insectos doblado en la parte anterior del cordón para marcar su orientación. A continuación, transfiera la médula espinal a una solución intracelular fría con hielo. Luego, enfríe el agar fundido previamente preparado sobre una mezcla de hielo y agua.Agite el agar mientras mide la temperatura. Cuando la temperatura del agar alcance 38 grados Celsius, sostenga la médula espinal con la aguja para insectos e inmérjala en el agar, con el lado rostral hacia abajo. Asegúrese de que la médula espinal esté lo más recta posible, alejada de las paredes, con la parte caudal ligeramente hacia arriba.Deje el vaso de precipitados en la mezcla de hielo y agua para permitir que el agar se solidifique alrededor del cordón lo más rápido posible. Después de la solidificación, corte el bloque de agar que contiene la médula espinal de manera que la base del bloque forme un ángulo de 35 grados con la parte lumbar del cordón. La superficie dorsal debe quedar orientada lejos de la base.Coloque el bloque en la cámara del vibrátomo utilizando pegamento de cianoacrilato. Es fundamental montar el bloque correctamente para mantener la continuidad de las motoneuronas con las raíces ventrales de las cuales emergen. Sumerja el bloque en solución de gluconato de potasio.Configure los parámetros del vibrátomo. A continuación, corte secciones de 350 a 400 micrones de grosor de la región lumbar, que se identifica por su curvatura y diámetro mayor. Transfiera las secciones adecuadas a ACSF a 34 grados Celsius.Normalmente, hay cuatro o cinco cortes adecuados con raíces ventrales que se extienden dos milímetros o más. Después de aproximadamente 30 minutos a 34 grados Celsius, enfríe los cortes a temperatura ambiente y luego comience la sesión de grabación. Prepare con antelación una caja con diversas pipetas cuyos diámetros de punta varíen entre 40 y 170 micrones.Para preparar las pipetas de sección, seleccione pipetas con una punta larga. Luego, utilizando un cuchillo de diamante, realice cortes en diferentes posiciones y, bajo un microscopio estereoscópico, rompa cada pipeta golpeando la punta con pinzas. A continuación, retire la cámara del microscopio de registro y colóquela bajo un microscopio estereoscópico.Seleccione una sección que contenga una raíz ventral de longitud suficiente para montarla sobre un electrodo de estimulación por succión. Monte la sección orientándola con las raíces ventrales hacia arriba, luego corte delicadamente el agar alrededor de las raíces ventrales dejando intacto el resto del agar alrededor de la sección y coloque la rejilla para sujetar la muestra. Vuelva a colocar la cámara sobre el microscopio y perfunda continuamente la cámara de registro con ACSF a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto a temperatura ambiente.Utilizando una pipeta de vidrio llena con ACSF y conectada a una jeringa, aspire una de las raíces ventrales. Para lograr una buena estimulación de la raíz ventral, la punta de la pipeta debe ajustarse firmemente alrededor de la raíz ventral. Realice un registro de tipo patch-clamp del tipo celular deseado y registre el efecto de la estimulación de la raíz ventral tal como se describió previamente.Esta imagen muestra los resultados del registro con bloqueo de voltaje. Los registros de los paneles superiores se tomaron de motoneuronas diferentes a las de los paneles inferiores. El panel superior muestra la respuesta antidrómica de una motoneurona a una estimulación de un voltio en rojo y a una estimulación de cinco voltios en negro.El trazo inferior muestra la respuesta del potencial de acción ortodrómico a una estimulación de 20 voltios en rojo y a una estimulación de 30 voltios en negro. Los puntos negros indican el momento del estímulo. Las cabezas de flecha dobles resaltan la diferencia en las latencias entre los potenciales ortodrómicos y antidrómicos.Aquí se muestran grabaciones en régimen de corriente constante. El panel superior muestra la respuesta antidrómica a estimulaciones de 10 voltios y 15 voltios en rojo y negro, respectivamente. El panel inferior muestra la respuesta ortodrómica a estimulaciones de 25 y 40 voltios en rojo y negro, respectivamente.Nuevamente, se indican la temporización del estímulo y las diferencias en las latencias. Esta imagen del grupo de células de Renshaw se obtuvo utilizando un condensador oblicuo y un objetivo de 20x. Observe los axones de las motoneuronas fusionándose con la raíz ventral, tal como se muestra mediante la flecha.Esta imagen de la misma región fue tomada utilizando un objetivo de 40x. Las células de Renshaw putativas se indican con cabezas de flecha. Aquí se muestra un registro en condición de bloqueo de voltaje de una célula de Renshaw tras la estimulación de la raíz ventral, indicada por el punto negro.El QX-314 en la solución intracelular impidió que la célula generara potenciales de acción y las respuestas a glicina y GABA se bloquearon con 3 micromolar de gabazina y un micromolar de estricnina, respectivamente. El trazo rojo es el promedio de los trazos grises. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 o 30 minutos.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la preparación en medio frío en todo momento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes oblicuos de la médula espinal adecuados para la estimulación de la raíz ventral. La estimulación de la raíz ventral puede utilizarse para confirmar fácilmente la identidad motoneuronal y, más importante aún, para estimular de manera confiable las células ventrales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describen los procedimientos para la preparación y registro electrofisiológico de rodajas de cerebro que mantienen el eje dorsal-ventral medial de la corteza entorrinal (MEC). Debido a que la codificación neural de la localización sigue una organización dorsal-ventral en el MEC, estos procedimientos de facilitar la investigación de los mecanismos celulares importantes para la navegación y la memoria.

Preparación de las rebanadas parasagitales para la Investigación de dorsal-ventral Organización de los roedores de corteza entorrinal medial

Este video describe el registro intracelular in vivo de motoneuronas de rata bajo estimulación transespinal de corriente continua. El protocolo describe cómo medir las propiedades de la membrana y registrar la activación rítmica de las motoneuronas antes, durante y después de la polarización anódica o catódica de la médula espinal.

Estimulación transespinal de corriente directa de la motoneurona espinal de una rata

Este video muestra un ensayo basado en una matriz de microelectrodos para estudiar la actividad de la red neuronal en secciones de la médula espinal de ratón. En primer lugar, se registra la actividad electrofisiológica del asta dorsal superficial (SDH) del corte. Luego, se introduce un inhibidor del canal de potasio para prolongar la despolarización, lo que resulta en una actividad rítmica sincrónica a través de la red neuronal.

Evaluación de redes neuronales en cortes de médula espinal de ratón mediante matrices de microelectrodos

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

La eficacia de la captación intramuscular y el transporte retrógrado de moléculas a las neuronas motoras correspondientes depende de la ubicación de los sitios de inyección con respecto a las placas terminales motoras (MEPs). En este artículo, describimos cómo localizar MEPs en los músculos esqueléticos para optimizar el transporte retrógrado de los trazadores a las neuronas motoras.

Las inyecciones intramusculares largo de las placas motoras de final: un abordaje mínimamente invasivo de trazadores de traslado directamente en neuronas motoras

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Este protocolo tanto visualmente comunica la preparación de la médula espinal de la médula oblonga y aclara la preparación de cortes transversales del tronco encefálico de forma integral paso a paso. Fue diseñado para aumentar la reproductibilidad y mejorar la probabilidad de obtener rodajas viables, duraderas, rítmicamente activa para grabación salida neuronal de las regiones respiratorias del tronco encefálico.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.

En Vivo Registro Intracelular de Motoneurones Espinales de Rata Tipo Identificados Durante estimulación de corriente directa trans-espinal

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

Se describe el uso combinado de la tecnología de matriz de microelectrodos y la estimulación química inducida por 4-aminopiridina para investigar la actividad nociceptiva a nivel de red en el asta dorsal de la médula espinal.

Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Aprende a preparar cortes oblicuos de médula espinal en ratones P2-P11 para estimulación de raíces ventrales. Esta técnica permite identificar motoneuronas y estudiar células ventrales inervadas por colaterales axonales motoneuronales en investigación neurofisiológica.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

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