Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos, Ceratitis capitata

El objetivo general de este procedimiento es administrar ácidos nucleicos en los embriones de Ceratitis Capitata, una importante plaga agrícola, para finalmente ampliar la caja de herramientas para su control. Este método ayuda a corregir funcionalmente los genes de un organismo inmóvil, así como a generar cepas transgénicas. La principal ventaja de esta técnica es que se inyecta una cantidad muy baja de ácidos nucleicos para lograr los efectos deseados.

Mantener todas las etapas de vida de la colonia de moscamed a 25 grados centígrados con un 65% de humedad y un fotoperiodo de luz/oscuridad de 12 horas y 12 horas con una fotofase que comienza a las 8 a.m. Insertar una tira de esponja a través de una pequeña abertura en la base de la jaula para proporcionar agua a las moscas por capilaridad. Estableces una jaula de seis litros, cargas una con entre 1.500 y 2.000 pupas.

Para la comida, cargue la jaula con unos 45 gramos de una mezcla de uno a 10 de levadura y azúcar. Para recolectar los huevos, coloque un plato lleno de agua debajo de la jaula. Las hembras depositarán huevos a través de la malla, que luego se acumularán en el agua.

Debido a que las hembras vírgenes pueden ova-positar, asegúrese de que todos los huevos estén fertilizados esperando hasta que las moscas tengan al menos una semana de edad, antes de recolectar los huevos. Para recolectar los huevos, filtre el agua con un colador fino. Luego, usando una pipeta pasteural, transfiera los huevos a una caja de plástico cargada con aproximadamente 0,5 litros de alimento para larvas estándar.

Si no se pusieron suficientes huevos, aumente el contenido de levadura de la comida del adulto hasta en un 25%Coloque cada caja en un recipiente transparente, que contenga una capa de salvado para favorecer la pupa. Cubra el recipiente con una tapa de red para permitir la circulación del aire. Después de unos 10 días, busque larvas de tercer estadio que hayan saltado a la capa de salvado para la pupa.

Una vez que lo encuentres, prepárate para buscar pupas en los días siguientes. Para recolectar las pupas, use un cepillo suave para barrerlas del recipiente. Inicialmente, recoja las pupas en una taza pequeña.

Una vez completadas las recolecciones, transfiera las pupas a una nueva jaula para adultos. Los adultos deberían emerger en unos 10 días. Para la microinyección, tenga los portaobjetos preparados con anticipación.

Coloque una tira de dos centímetros de cinta adhesiva de doble capa en un portaobjetos y marque los bordes con un marcador de porcelana para hacer una pared para una capa de aceite que mantenga a los embriones hidratados. Para recolectar embriones recién puestos, permita que las hembras jóvenes fertilizadas ovopongan durante 30 minutos en una bandeja nueva y luego recoja los embriones. Para eliminar el corion de los embriones, sumerja el colador y los huevos en una solución comercial de lejía al 50% durante cinco segundos.

Es fundamental no blanquear demasiado los embriones. Lave inmediatamente los embriones blanqueados sumergiendo cuidadosamente el colador en agua limpia y ultrapura. Hazlo al menos cuatro veces.

A continuación, mantenga el colador en agua clara y ultrapura e inyecte los embriones en un plazo de dos horas. A continuación, con un pincel fino, recoge unos 50 embriones y colócalos en un disco de papel de filtro negro empapado en agua. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, coloque los embriones en la cinta de doble capa de un portaobjetos de microscopio preparado.

Orientar todos los embriones en la misma dirección. Es importante manipular los embriones con cuidado porque la perforación de la membrana embrionaria con el pincel puede causar daños que reduzcan la supervivencia del embrión. Ahora cubre los embriones con una capa de aceite de cloro-trifloro etoleno.

El aceite debe estar contenido por los bordes del marcador de porcelana. No desbordes las fronteras. Con una micropipeta, cargue la aguja de inyección con unos pocos microlitros de solución de ácido nucleico a uno o dos microgramos por microlitro.

A continuación, conecte la aguja al aparato de microinyección y configúrela para que proporcione una inyección de medio segundo a 800 hectopascales con una contrapresión de 150 hectopascales. Para inyectar, use un gatillo de pedal y use el micromanipulador para controlar la aguja mientras usa los controles de la etapa para mover el portaobjetos. Confirme que el bolo de inyección se está expulsando correctamente y luego alinee la aguja con el polo posterior del primer embrión de la fila.

Al mover la etapa, inserte la aguja en el embrión e inyecte el bolo de ácidos nucleicos. El líquido inyectado inducirá un aumento de la presión interna que dará lugar a un ligero movimiento del embrión. Suelte el pedal e inmediatamente pero suavemente, retire la aguja del embrión.

Un poco de citoplasma se filtrará en el sitio de la inyección. Esto es normal. Si los embriones están reventando con la inyección, deje que los embriones se secen durante unos minutos antes de cubrirlos con aceite.

Después de la inyección, transfiera el portaobjetos a una placa de Petri. Coloque un disco de papel de filtro en la tapa del plato. Remoje el filtro con agua y cierre la placa de Petri con una película de parafina.

Incubar la cámara a 25 grados centígrados. Dos días después de la inyección, revise los portaobjetos varias veces a lo largo del día en busca de larvas eclosionadas. Busque larvas en el aceite y, con un pincel fino, transfiéralas a una placa de Petri con alimento para larvas a base de zanahoria.

Cargue cada plato con hasta 200 larvas. La larva no puede sobrevivir mucho tiempo en el aceite, así que busque a menudo. Incuba las larvas con la tapa casi cerrada, de modo que todavía haya flujo de aire hacia las larvas.

Revise los platos diariamente y después de una semana prepárese para recolectar larvas colocando los platos en un recipiente con salvado. Recoge las pupas y poco después espera que emerjan. Más tarde, anestesia a los adultos eclosionados con dióxido de carbono e inspecciona su transformación.

A la hora de excluir, el método de movilización puede ser fundamental. Los adultos pueden ser anestesiados con hielo o CO2, pero la exposición prolongada podría reducir la supervivencia de otros. Compruebe la presencia de fluorescencia roja con un filtro ancho rojo DS.

O compruebe la fluorescencia verde con un filtro EYFP. Transfiera los individuos transformados a una jaula pequeña con adultos de tipo salvaje del sexo opuesto para establecer una cepa heterocigótica. En un experimento, se utilizó ARN de doble cepa para silenciar la expresión del gen inx5.

La línea germinal adulta de los controles no inyectados parece ser normal, como se esperaba, mientras que los individuos tratados mostraron testículos y ovarios subdesarrollados. La cuantificación de la abundancia de transcripción de inx5 en el abdomen de individuos de ambos sexos confirmó la expresión significativamente menor del gen en comparación con los controles. En un segundo experimento, se generaron dos cepas con espermatozoides marcados utilizando el promotor de tubulina beta-2 para impulsar diferentes marcadores fluorescentes.

Los varones transgénicos mostraron un patrón de fluorescencia distinto en el cuerpo y en los testículos. Con este vídeo, proporcionamos nuestros protocolos optimizados para la cría y la microinyección de ácidos nucleicos en embriones de moscamed. Una vez dominados, se pueden inyectar hasta 1.000 embriones en una jornada laboral de ocho horas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros metales como thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine para desarrollar una nueva generación de cepas de moscamed.