Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

El objetivo general de este procedimiento es probar directamente el efecto de la hipoxia tumoral en la metástasis utilizando un modelo animal. Este método puede ayudar a identificar el mecanismo subyacente a los efectos prometastásicos de la hipoxia y posibles nuevas dianas terapéuticas para prevenir la diseminación tumoral. Dos ventajas de esta técnica son la capacidad de probar los efectos de la hipoxia tumoral in vivo y recapitular los pasos de la metástasis y las interacciones celulares que ocurren en los pacientes con cáncer.

En nuestro modelo, la hipoxia tumoral se crea por ligadura de la arteria femoral que suministra sangre al hilio portador del tumor del ratón. La amputación posterior de la extremidad posterior impide la movilidad asociada con el crecimiento repetido del tumor primario, lo que permite la formación de metástasis. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Jason Tilan, Sung-Kyeok Hung y la Dra. Olga Rodríguez, codirectora del Laboratorio de Investigación de Imágenes Preclínicas aquí en Georgetown.

Para inyectar las células del sarcoma de Ewing, sujete suavemente a una hembra de ratón SCID Beige de cuatro a seis semanas de edad, estabilizando la pata izquierda entre el cuarto y el quinto dedo para exponer el lado medial de la extremidad trasera inferior. Inserte una aguja de calibre 28 de 1/2 pulgada en un ángulo de aproximadamente 30-45 grados anteriormente en el músculo gastrocnemio hacia la cresta tibial. Cuando la punta de la aguja toque la cresta, retírela ligeramente e inyecte lentamente 0,1 mililitros de las células del sarcoma de Ewing mientras continúa retirando la aguja.

A continuación, utilice calibradores digitales para medir el tamaño de la pantorrilla diariamente a través de las longitudes medial/lateral y anterior/posterior hasta que el tamaño del tumor alcance el volumen deseado. Antes de comenzar la ligadura, inyecte por vía subcutánea un agente analgésico seguido de la administración de Hypoxyprobe-1 para confirmar la hipoxia. A continuación, coloque el ratón anestesiado en una almohadilla térmica sobre la superficie de operación y aplique ungüento en los ojos del animal.

Luego, extienda y asegure la extremidad trasera con un trozo de cinta adhesiva aproximadamente a 45 grados de la línea media. Depique el área quirúrgica con crema depilatoria, retire la crema con una almohadilla de preparación de etanol después de 10 segundos y desinfecte la piel expuesta con tres toallitas consecutivas de povidona yodada al 10% y etanol. Transfiera el ratón bajo un microscopio estereoscópico y haga una incisión de 1 centímetro en la piel desde la mitad del muslo hacia la región inguinal.

Con hisopos de algodón fino humedecidos con solución salina, cepille suavemente el tejido graso subcutáneo que rodea el músculo del muslo. A continuación, diseccione cuidadosamente el tejido graso subcutáneo para revelar la arteria femoral subyacente. Estabilice la herida y el campo quirúrgico para exponer la vasculatura del músculo aductor medio-superior y use pinzas finas para perforar suavemente la vaina femoral membranosa para exponer el haz neurovascular.

Usando un juego limpio de pinzas finas, diseccione y separe la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la ubicación proximal cerca de la ingle, distal al ligamento inguinal. Luego, pase una sutura de seda 6-0 por debajo de la arteria femoral distal al brach de la arteria femoral circunfleja lateral y ocluya la arteria femoral con nudos dobles. Cierre la incisión con suturas de polipropileno 6-0 e inyecte subcutáneamente 0,5 mililitros de solución salina tibia para la terapia de equilibrio de líquidos.

Luego, coloque al animal encima de una almohadilla tibia en la jaula de recuperación con monitoreo hasta que se recupere por completo. En el momento experimental apropiado, sujete suavemente al animal y use una maquinilla para afeitar el pelo de la extremidad portadora del tumor desde la tibia distal hasta la región pélvica. Inyecte el agente analgésico y coloque al animal anestesiado en decúbito lateral derecho sobre un paño estéril colocado sobre una almohadilla térmica.

Aplique ungüento en los ojos y desinfecte el sitio quirúrgico como se acaba de demostrar. A continuación, se coloca un paño estéril sobre el animal y se realiza una incisión en la piel circunferencial femoral media, seguida de una disección roma y una retracción proximal de la piel. Exponga el pedículo neurovascular femoral medial en el lado mediano de la pierna.

A continuación, utilice una sutura reabsorbible recubierta de poliglactina 910 4-0 para ligar cerca del ligamento inguinal. Con unas tijeras, realice una transección femoral media del músculo seguida de una disección roma del tejido blando hasta la articulación coxofemoral. Con un cortador de huesos, realice una osteotomía femoral media seguida de una presión suave en el sitio de la osteotomía con una esponja de gelatina absorbible para minimizar el sangrado.

A continuación, utilice clips quirúrgicos para heridas para cerrar la piel suprayacente e inyecte por vía subcutánea 0,5 mililitros de solución salina tibia para la terapia de equilibrio de líquidos. Al menos dos veces por semana, palpar cuidadosamente la cabeza, el cuello, las regiones axilares y la extremidad posterior contralateral de los animales inyectados por el tumor. Comprobar la presencia de metástasis en los órganos internos mediante distensión abdominal y la presencia de metástasis pulmonares mediante una presión suave de la apófisis xifoides con el dedo índice.

Para evaluar la metástasis de órganos internos mediante resonancia magnética en los momentos experimentales adecuados, encienda la bomba conectada a un sistema de circulación de agua caliente para mantener al ratón a una temperatura corporal fisiológica. A continuación, coloque el sensor respiratorio en contacto con la parte superior del abdomen del animal y encienda el equipo de monitorización respiratoria de BIOPAC Systems. Coloque el ratón anestesiado en un soporte estereotáxico para ratones diseñado a medida y aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal.

Para reducir los artefactos de movimiento y el ruido, seleccione la opción de compuerta en el protocolo de resonancia magnética para sincronizar la recopilación de datos con el ciclo respiratorio. A continuación, ejecute una secuencia de imágenes anatómicas bidimensionales ponderadas en T2 para obtener imágenes de las metástasis. Para el cultivo de células tumorales primarias después de la amputación, la incisión o la necropsia, se extraen dos o tres segmentos de 2-3 milímetros de tejido tumoral viable húmedo y lustroso de color rojo rosado de cada muestra de tejido de interés y se colocan los segmentos aislados en placas de cultivo celular de 6 centímetros que contienen medio de cultivo primario fresco.

Luego, transfiera los tejidos a una incubadora de cultivo celular para el período de crecimiento celular apropiado. Después de la inyección de las células del sarcoma de Ewing en el músculo gastrocnemio, se permite que los tumores primarios crezcan hasta un tamaño de pantorrilla de 250 milímetros cúbicos. Los tumores de control con este volumen exhiben un nivel relativamente bajo de hipoxia endógena únicamente en las células distantes de la vasculatura, según lo determinado por la tinción con Hypoxyprobe-1.

Por el contrario, la ligadura de la arteria femoral induce una hipoxia profunda en la gran mayoría de las células tumorales, incluso en las proximales a los vasos sanguíneos. La eficacia de la ligadura de la arteria femoral está respaldada por la inhibición completa del crecimiento del tumor primario durante el período de tres días entre la ligadura de la arteria femoral y la amputación. El análisis histopatológico revela extensas áreas de necrosis en los tumores primarios tratados con ligadura de arteria femoral recolectados tres días después de la cirugía.

Sin embargo, hay grupos de células tumorales viables presentes dentro del tejido tumoral ubicados en los bordes del tumor cerca de la vasculatura. Estas células tumorales viables restantes son altamente invasivas, como lo demuestra su intravasación masiva. Muchas células dentro de la luz del vaso son positivas para Hypoxyprobe-1, lo que indica que las células que son hipóxicas después de la ligadura de la arteria femoral pueden haber iniciado la angioinvasión.

En estos experimentos, la hipoxia aumentó significativamente la frecuencia y la multiplicidad de las metástasis, a menudo observadas en lugares no afectados en ratones portadores de tumores de control. Una vez dominado, cada procedimiento quirúrgico, incluida la preparación, la anestesia y la recuperación, se puede completar en 30 minutos por animal. La duración de todo el experimento depende de la línea celular utilizada y de sus tasas de crecimiento y metástasis.

Los plazos de resonancia magnética y eutanasia varían según la latencia de las metástasis, y deben establecerse para cada línea celular individual en un experimento piloto. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el manejo adecuado del dolor y el monitoreo del animal después del procedimiento. Si el procedimiento se realiza perfectamente, no se deben observar efectos adversos graves ni la muerte relacionada con la cirugía.

Después de este procedimiento, los tejidos y las células de los tumores primarios control e hipóxicos, así como de sus metástasis correspondientes, se pueden someter a análisis adicionales, incluido el perfil de expresión génica global para identificar los mecanismos de metástasis inducidas por hipoxia. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores en el campo de la metástasis del cáncer para probar directamente los efectos de la hipoxia tumoral en la diseminación de la enfermedad. Aunque aquí nos centramos en el sarcoma de Ewing, se puede aplicar un abordaje similar a otros tumores.

Después de ver este vídeo, debería tener una muy buena comprensión de cómo crear un modelo animal de hipoxia tumoral y cómo monitorizar las metástasis resultantes tanto in vivo como ex vivo.