El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria

El objetivo general del Análisis de Sectores Somáticos Inducidos consiste en proporcionar una técnica de rendimiento medio o alto para la caracterización funcional de genes y constructos de promotores en tejido secundario del tallo de árboles, en marcos de tiempo comparativamente cortos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre dónde y cuándo se expresan los genes de defensa, así como sobre su papel en procesos biológicamente importantes, como la formación de madera y el desarrollo secundario del tallo. La principal ventaja de esta técnica es que es eficiente, sencilla y relativamente rápida, y es aplicable a una amplia gama de especies arbóreas.

Para comenzar, prepare un tubo limpio de 50 mililitros con tapón de rosca que contenga 19 mililitros de medio LB fresco a 28 grados Celsius, con los antibióticos apropiados para la selección bacteriana. Añada un mililitro de cultivo de A.tumefaciens y mida la densidad óptica, u OD, a 600 nanómetros. Si la OD es superior a 0,1, diluya más con LB tibio. Incube el cultivo de A.tumefaciens en un incubador con agitación hasta que la OD a 600 esté entre 0,4 y 0,6.

Una vez logrado esto, centrifugue las células durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y 1.000 × g. Decante el líquido del tubo y re-suspenda inmediatamente el sedimento celular con un mililitro de medio MS enfriado. Transfiera la suspensión a un microtubo limpio de dos mililitros y almacénelo en hielo hasta su uso.

Comience el experimento durante la primavera o principios del verano y seleccione plantas con un cambium activo y de crecimiento rápido. Esto se confirma si el floema se puede separar fácilmente del xilema. Identifique una sección recta del tallo cerca de la base de la planta y retire todas las hojas o ramas.

Con un escalpelo afilado, corte una ventana cambial de un centímetro cuadrado realizando dos incisiones paralelas de 20 milímetros a través del floema, separadas cinco milímetros entre sí, y luego un corte horizontal único que bisecte los dos cortes verticales en el extremo basal. Levante la tira de floema hacia arriba para exponer el tejido de xilema en desarrollo. A continuación, utilizando una pipeta, agregue medio de inoculación suficiente para humedecer completamente la superficie del xilema expuesto.

Inmediatamente, vuelva a insertar la tira de floema en el tallo y sujétela firmemente con parafilm. Repita estos pasos de inoculación para todos los genes o promotores de interés, creando nuevas ventanas cambiales al menos un centímetro por encima o por debajo de las ventanas existentes y con un desfase de 90 grados. Además, inocule ventanas con los vectores de control positivo y negativo en el mismo tallo o tallos, al igual que los inoculados experimentales.

Monitoree periódicamente el crecimiento del tallo y, una vez observado un crecimiento radial de al menos cinco milímetros, recolecte el tejido para un ensayo de beta-glucuronidasa, o ensayo GUS. Para recolectar el material de prueba, primero excise la ventana cambial del tallo, eliminando cualquier tejido que no forme parte del nuevo crecimiento. Para estudios relacionados con la morfología celular o tisular del xilema y floema maduros, separe el floema del xilema.

Alternativamente, para investigaciones que requieran que la zona cambial permanezca intacta, o para evaluar los patrones de expresión del promotor, corte transversalmente la ventana cambial usando una cuchilla de afeitar para crear discos de entre 0,5 y un milímetro de grosor. Coloque los tejidos de la ventana cambial recolectados en tubos individuales de fondo redondo de 14 mililitros y enjuáguelos dos veces con tampón fosfato 0,1 molar a pH 7 durante cinco minutos cada vez, asegurándose de que el tejido quede completamente sumergido. Al final del segundo enjuague, tenga cuidado de eliminar toda la solución en exceso.

A continuación, agregue cinco mililitros del reactivo GUS a cada tubo. Si esto no cubre completamente la muestra de tejido, añada más reactivo. Incube los tubos durante diez minutos a 55 grados Celsius en la oscuridad.

A continuación, incubar los tubos durante 12 a 16 horas adicionales en un agitador a 37 grados Celsius en la oscuridad, utilizando agitación suave. Al retirarlos del incubador, tomar un subconjunto aleatorio de los tubos y verificar el pH del reactivo GUS utilizando papel de tornasol con un rango de pH de cero a siete. Si alguno tiene un pH inferior a seis, etiquetarlos y verificar el resto de los tubos.

Etiquete y excluya cualquier tubo con un pH inferior a seis. Vierta el reactivo GUS desde los tubos y sustitúyalo con etanol al 70 por ciento suficiente para cubrir el tejido. Almacene las muestras a cuatro grados Celsius hasta que sean necesarias.

Utilizando un par limpio de pinzas, retire todo el tejido de la ventana cambial de un tubo de muestra y colóquelo sobre una bandeja pequeña o una placa de Petri para su visualización microscópica. Coloque la muestra bajo la lente de un microscopio estereoscópico con un aumento entre 1X y 4X, e identifique y cuente el número de células o tejidos que presentan tinción azul brillante. En los ejemplos en los que se eliminó el floema, cuente el número de sectores en el tejido cambial encontrados en la superficie del xilema en desarrollo.

Para muestras cortadas en discos, cuente el número de sectores encontrados en los diferentes tipos de células o tejidos. Asegúrese de observar ambos lados del disco y de emparejar los sectores que se extienden entre dos discos para garantizar que los números no se sobrestimen. Coloque únicamente el tejido que contiene los sectores nuevamente en el tubo que contiene etanol al 70 por ciento y almacénelo hasta que sea necesario.

Repita el análisis para cualquier ventana cambial adicional recolectada, incluyendo los controles positivo y negativo. Para ayudar en la identificación precisa de la clasificación de los sectores, le sugerimos familiarizarse con la anatomía y el desarrollo secundario del tallo, incluyendo las respuestas del tallo al daño. Esta figura muestra varias transformaciones exitosas observadas aquí como regiones de tinción azul.

Una ventana de exfoliación del floema muestra múltiples sectores transformados y discos recolectados de dos especies de árboles que presentan sectores de transformación y crecimiento radial subsiguiente. También puede observarse la transformación en una variedad de tipos de tejidos. Aquí, sectores del tallo pueden verse en el peridermo, floema, parénquima de herida y varias otras regiones de tejido del álamo blanco.

Esta imagen muestra los resultados de la expresión del promotor génico en derivados del cámbium. En este ejemplo, se observa la proporción de tinción en cada tipo de tejido en un ensayo que incluye una serie de promotores CesA de Eucalyptus grandis transformados en tallos de híbridos de eucalipto. La expresión en floema, xilema en desarrollo y xilema desarrollado se representa como un porcentaje.

El número promedio de eventos de transformación por centímetro de cambium inoculado también puede calcularse para cada promotor o gen de interés. Esta tabla muestra los datos de los sectores típicos identificados en ejemplares de eucalipto y álamo transformados con un control positivo o con un promotor de interés, analizados mediante el método de recolección de discos. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar un método rápido, eficiente y ampliamente aplicable para analizar la naturaleza compleja de la diferenciación del cambium con la formación en el desarrollo secundario del tallo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar plantas y bacterias, cómo transformar, cultivar y cosechar tallos, así como cómo identificar y clasificar el tejido transgénico para la evaluación fenotípica.