Name: El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a utilizar el Análisis de Sector Somático Inducido para caracterizar genes y promotores en tejido leñoso secundario de árboles. Este protocolo eficiente permite estudiar la formación de madera en diversas especies forestales.

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Los autores desean agradecer el apoyo financiero para algunos aspectos del trabajo a través de las Becas de Vinculación LP0776563 (GB, AS) y LP0211919 (GB) y los socios de la industria Sappi y Mondi, así como el Premio Australiano de Posgrado (EM) del Consejo Australiano de Investigación y el Premio a los Jóvenes Innovadores y Científicos a través del Departamento de Agricultura de Australia (LT). También nos gustaría agradecer a Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan y Simon Southerton por las muchas discusiones e ideas que presentaron durante el desarrollo de este protocolo y a Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel y Noemie Defaix por su ayuda en el trabajo relacionado con el laboratorio.

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo de ISSA es un método relativamente sencillo y eficaz para la creación de tejidos del tallo transgénicas en las especies de árboles en el espacio de unos pocos meses para el análisis de genes y promotores de interés que participan en la madera y el vástago de formación. , Más allá de mantener vivas las plantas, se requiere poco esfuerzo para crecer tejido del tallo transgénico después de la inoculación, que contrasta con los métodos in vitro donde se requiere un extenso cultivo para mantener el teji...

Troncos de los árboles comprenden una cantidad significativa de la biomasa y los planetas son de gran importancia biológica, cultural y comercial. Tallos secundarios crear hábitat proporcionando recursos y refugio para muchas otras formas de vida. Ofrecen muchos otros servicios de los ecosistemas que habitan y actúan como un recurso renovable para la producción de madera, pulpa y papel y otros productos madereros y no madereros. el desarrollo del tallo secundaria y la formación más específicamente la madera se rige por el sistema complejo molecular que regulan el desarrollo de determinados tipos de células, la composición bioquímica de sus paredes celulares y la forma en que se organizan para formar tejidos y órganos. La disección de las bases moleculares del desarrollo del tallo secundaria y formación de la madera es confundida por muchos factores, incluyendo la variabilidad de la madera y madre de propiedades dentro y entre los tallos, largos tiempos de generación, sistemas de apareamiento capaz de fecundación, alta heterocigosidad, de alta carga genética, inactividad estacional, a largo maduroperíodos de establecimiento de rasgos y el tamaño físico requerido por los árboles maduros. Como resultado de ello, la comprensión del desarrollo del tallo secundario en relación con el conocimiento detallado de la mayoría de los otros aspectos del control molecular del desarrollo de la planta, se encuentra todavía en su infancia. Una serie de técnicas in vitro se han utilizado para estudiar y comprender el desarrollo del tallo secundario, en particular, la madera y la formación de la pared celular secundaria. Estos protocolos implican el uso de sistemas de parte de la planta de toda la planta o, cuando se crean cualquiera de las plantas transgénicas o células secundarias específicas o tejidos se transforman para el estudio de aspectos específicos de la madera y / o el desarrollo del tallo secundario 1. Las plantas transgénicas se pueden recuperar transformación posterior genético de una amplia variedad de tejidos de plantas y tipos de células, sin embargo, el progreso es lento, particularmente cuando se analizan rasgos de fibra de madera debido a la larga la regeneración y el vástago tiempos de maduración (en el orden de años), alta técnica y Deman laboralds, el bajo rendimiento de los genes candidatos, así como las dificultades en la propagación de algunas especies de plantas leñosas. Técnicas similares se han desarrollado en el modelo de sistema no leñosas tales como Arabidopsis que superar con éxito algunas de estas limitaciones, pero no todos los tipos de células madre secundaria un presente en estos tallos y rasgos relacionados con la estacionalidad o la longevidad no pueden ser estudiados en dichas especies 2. Alternativamente, los sistemas de parte de la planta, tales como cultivos de callos radiata Pinu s 3 reducen los marcos de tiempo asociados. Sin embargo, estos métodos están limitados al estudio de un tipo de célula individual y sufren limitaciones similares como se ha indicado para los experimentos in vitro. Del mismo modo, las culturas madre apical 4 implican explantes enteros madre han demostrado ser prometedores pero hasta el momento no se han aplicado para el estudio de los genes o promotores específicos de interés. Más recientemente, un protocolo alternativo que implica cultivos de raíces peludas se ha desarrollado para eucaliptos y ha sido con éxitoaplicó 5, sin embargo, este método todavía requiere de cultivo in vitro, implica raíces secundarias en lugar de tallos y hasta la fecha se limita a una sola especie arbórea. Inducida análisis sector somática (ISSA), como se describe aquí, se ha desarrollado para superar algunos de estos problemas proporcionando un medio a alto rendimiento herramienta de cribado funcional para genes y promotores con sospecha de papeles en la formación de madera y el desarrollo del tejido del tallo secundario. ISSA es un sistema de transformación y el cribado in vivo que fue desarrollado para reducir el tiempo necesario para producir las células y tejidos transgénicos en un vástago secundario intacta, mientras que la superación de la mano de obra, las limitaciones técnicas y de rendimiento de forma rutinaria usados en métodos in vitro. Los protocolos descritos aquí permiten la creación simultánea de cientos de sectores y células de tejido transformadas independientemente en tallos secundarios dentro de un corto período de tiempo, en las especies de árboles y tejido de interés sin gEnetic variación y / o ambiental dentro de plazos relativamente cortos y mano de obra barata. Técnicas de la AISS en vivo se describió por primera vez para la secundaria del vástago 6 y el brote 7 tejidos y desde entonces han ido perfeccionando en el tejido del tronco secundario a través de estudios de los genes y / o promotores implicados en la diferenciación cambial e incluyen: tubulina (TUB) 8, arabinogalactano fasciclina como ( FLA) 9, celulosa sintasa (CESA) 10, célula de dominio NAC pared asociada secundaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 y realmente interesante nuevo gen de proteína (ANILLO) H2 13. Estos estudios fueron realizados en secundaria tallos de las plantas de álamo y eucalipto y proporcionó información sobre la morfología celular, la química de la pared celular y la expresión génica. Los protocolos descritos aquí están destinadas a reunir a la experiencia de unand conocimientos adquiridos a través del desarrollo y aplicación de la AISS de una serie de estudios publicados y no publicados en la última década. Se centran en la transformación in vivo de los tejidos del tronco secundario 6 y se concentran en estudios con el clon &#39;piramidal&#39; Populus alba, Eucalyptus globulus, así como 11 de Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento toma investigadores a través del protocolo desde el cultivo de plantas y bacterias, transformación de los tejidos del tallo, crecimiento y cosecha de los tejidos, la identificación de las células y los tejidos transgénicos, preparación para las evaluaciones fenotípicas y métodos para la recogida y análisis de datos. Mientras que las técnicas con éxito se han aplicado para medir la composición de monosacáridos de la pared celular también 9,11, debido a limitaciones de espacio, este documento se centra en técnicas utilizadas para la célula de medida y la morfología del tejido y la comprensión de los patrones de expresión de genes en st secundariaems solamente. De acuerdo con ello, el protocolo como se describe es adecuado para aquellos que buscan obtener más conocimientos sobre la función y / o expresión de genes relacionados con tallos secundarios usando un bajo costo, técnicamente fácil, y medio a método de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>Plantas</td><td>NA</td><td>NA Por</td><td>favor, consulte a los proveedores locales de viveros para las plantas según sea necesario</td></tr><tr><td>Cepa de Agrobacterium</td><td>NA</td><td>NA Hay</td><td>muchas vías posibles para obtener cepas de Agrobactrium. Le sugerimos que haga un seguimiento dentro de su comunidad de investigación local, ya que puede haber restricciones para obtener la bacteria en su país y región.</td></tr><tr><td>Vector binario (gen y promotor)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Hemos desarrollado una gama de vectores para adaptarnos al protocolo ISSA utilizando un sistema de recombinasa de puerta de enlace. Esto incluye sobreexpresión, knockouts de ARNi y vectores de fusión de promotores basados en vectores pCAMBIA modificados y felices de proporcionar según sea necesario. Además, hay muchos vectores disponibles para la comunidad investigadora.</td></tr><tr><td>Medios LB</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Medios LB con agar</td><td>Sigma</td><td>L2897</td><td>Un producto similar podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Sigma</td><td>NA</td><td>El número de catálogo dependerá del antibiótico que necesite, ya que se utiliza una variedad de antibióticos para la selección bacteriana en vectores binarios. Este producto podría obtenerse de a&nbsp; Gama de empresas</td></tr><tr><td>50 ml Tubos con tapa de rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>El mismo producto puede proceder de otra empresa</td></tr><tr><td>Microtubo de 2 ml</td><td>Watson Bio Lab</td><td>132-620C</td><td>El mismo producto puede proceder de otra empresa</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>Sigma</td><td>M9274</td><td>El mismo producto puede proceder de otra empresa</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí n.º 11</td><td>Sigma</td><td>S2771</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Este es el mejor producto para usar para vincular la ventana cambial después de la creación &nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de 14 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>El mismo producto puede proceder de otra empresa</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>El mismo producto puede proceder de otra empresa</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>El mismo producto puede proceder de otra empresa</td></tr><tr><td>X-Gluc</td><td>X-GLUC direct</td><td></td><td>Deberá ir al sitio web para realizar el pedido - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>Ferricianuro de potasio (III)</td> <td>Sigma</td><td>244023</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Ferrocianida de potasio (II)</td> <td>Sigma</td><td>P9387</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Papel tornasol</td><td>Sigma</td><td>WHA10360300</td><td>El mismo producto podría provenir de otra empresa</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de un solo filo</td><td>ProSciTech</td><td>L055</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de doble filo</td><td>ProSciTech</td><td>L056</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>SEM Pin Stub</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Frasco de muestra con tapón de rosca</td><td>ProSciTech</td><td>L6204</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>sigma</td><td>E7023</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>LR blanco</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>El mismo producto podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Molde de incrustación</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>Recomendamos esta variedad, sin embargo, hay muchas opciones disponibles</td></tr><tr><td>Medios de montaje Water Soulable</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td><td>Un ejemplo de un medio de montaje que podría utilizarse, sin embargo, existen otras opciones y podrían explorarse.</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>Un producto similar podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td>Un producto similar podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Safranina O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>Un producto similar podría obtenerse de otra empresa</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido ambiental</td><td>Quanta FEI</td><td></td><td>Este es el instrumento utilizado en parte de este estudio, pero cualquier otro SEM que tenga un modo de bajo vacío podría utilizarse.</td></tr><tr><td>El software</td><td></td><td></td><td>de imágenes ImageJ se puede obtener de la siguiente URL http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

el uso de inducida somática análisis del sector (issa) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo secundaria

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

el crecimiento del tallo secundario en los árboles y la formación de madera asociados son significativos tanto desde las perspectivas biológica y comercial. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre el control molecular que regula su desarrollo. Esto es en parte debido a la física, los recursos y las limitaciones de tiempo a menudo asociados con el estudio de los procesos de crecimiento secundario. Un número de técnicas in vitro se han utilizado implica ya sea parte de la planta o sistema de toda la planta, tanto en leñosas y especies de plantas no leñosas. Sin embargo, las preguntas sobre su aplicabilidad para el estudio de los procesos de crecimiento de los tallos secundarios, la obstinación de ciertas especies y la intensidad del trabajo son a menudo prohibitivos para el medio a aplicaciones de alto rendimiento. Además, cuando se mira en la formación y el desarrollo del tallo secundario de la madera los rasgos específicos bajo investigación sólo podría llegar a ser medible tarde en el ciclo de vida de un árbol después de varios años de crecimiento. Al abordar estos retos alternativa in vivo protocols se han desarrollado, llamado inducido somática análisis del sector, lo que implica la creación de sectores de tejidos somáticos transgénicos directamente en el tallo secundario de la planta. El objetivo de este protocolo es proporcionar un medio eficaz, fácil y relativamente rápido para crear tejido vegetal secundario transgénicos para genes y caracterización funcional promotor que puede ser utilizado en una gama de especies de árboles. Los resultados presentados aquí indican que los sectores secundario del vástago transgénicas se pueden crear en todos los tejidos vivos y tipos de células en tallos secundarios de una variedad de especies de árboles y que la madera rasgos morfológicos, así como los patrones de expresión promotor en tallos secundarios se pueden evaluar fácilmente la facilitación de medio a alto caracterización funcional rendimiento.

El uso de este protocolo todos los tipos de células y tejidos del tallo secundarias en vivo han demostrado ser susceptibles a A. tumefaciens transformaciones y se han definido en tipos de sector basándose en el tipo de célula inicialmente transformada y que el patrón de crecimiento posterior desarrollo. Tipo de sector incluyen peridermis, floema, cambium, el parénquima de la herida y tilosa (Figura 1b, 1c, 1d) y se pueden encont...

Aquí presentamos un protocolo que facilita la caracterización funcional de rendimiento medio a alto de construcciones de genes y promotores en tejido de tallo secundario de árbol dentro de marcos de tiempo comparativamente cortos. Es eficiente, fácil de usar y ampliamente aplicable a una variedad de especies de árboles.

El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

El objetivo general del Análisis de Sectores Somáticos Inducidos consiste en proporcionar una técnica de rendimiento medio o alto para la caracterización funcional de genes y constructos de promotores en tejido secundario del tallo de árboles, en marcos de tiempo comparativamente cortos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre dónde y cuándo se expresan los genes de defensa, así como sobre su papel en procesos biológicamente importantes, como la formación de madera y el desarrollo secundario del tallo. La principal ventaja de esta técnica es que es eficiente, sencilla y relativamente rápida, y es aplicable a una amplia gama de especies arbóreas.Para comenzar, prepare un tubo limpio de 50 mililitros con tapón de rosca que contenga 19 mililitros de medio LB fresco a 28 grados Celsius, con los antibióticos apropiados para la selección bacteriana. Añada un mililitro de cultivo de A.tumefaciens y mida la densidad óptica, u OD, a 600 nanómetros. Si la OD es superior a 0,1, diluya más con LB tibio. Incube el cultivo de A.tumefaciens en un incubador con agitación hasta que la OD a 600 esté entre 0,4 y 0,6.Una vez logrado esto, centrifugue las células durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y 1.000 × g. Decante el líquido del tubo y re-suspenda inmediatamente el sedimento celular con un mililitro de medio MS enfriado. Transfiera la suspensión a un microtubo limpio de dos mililitros y almacénelo en hielo hasta su uso.Comience el experimento durante la primavera o principios del verano y seleccione plantas con un cambium activo y de crecimiento rápido. Esto se confirma si el floema se puede separar fácilmente del xilema. Identifique una sección recta del tallo cerca de la base de la planta y retire todas las hojas o ramas.Con un escalpelo afilado, corte una ventana cambial de un centímetro cuadrado realizando dos incisiones paralelas de 20 milímetros a través del floema, separadas cinco milímetros entre sí, y luego un corte horizontal único que bisecte los dos cortes verticales en el extremo basal. Levante la tira de floema hacia arriba para exponer el tejido de xilema en desarrollo. A continuación, utilizando una pipeta, agregue medio de inoculación suficiente para humedecer completamente la superficie del xilema expuesto.Inmediatamente, vuelva a insertar la tira de floema en el tallo y sujétela firmemente con parafilm. Repita estos pasos de inoculación para todos los genes o promotores de interés, creando nuevas ventanas cambiales al menos un centímetro por encima o por debajo de las ventanas existentes y con un desfase de 90 grados. Además, inocule ventanas con los vectores de control positivo y negativo en el mismo tallo o tallos, al igual que los inoculados experimentales.Monitoree periódicamente el crecimiento del tallo y, una vez observado un crecimiento radial de al menos cinco milímetros, recolecte el tejido para un ensayo de beta-glucuronidasa, o ensayo GUS. Para recolectar el material de prueba, primero excise la ventana cambial del tallo, eliminando cualquier tejido que no forme parte del nuevo crecimiento. Para estudios relacionados con la morfología celular o tisular del xilema y floema maduros, separe el floema del xilema.Alternativamente, para investigaciones que requieran que la zona cambial permanezca intacta, o para evaluar los patrones de expresión del promotor, corte transversalmente la ventana cambial usando una cuchilla de afeitar para crear discos de entre 0,5 y un milímetro de grosor. Coloque los tejidos de la ventana cambial recolectados en tubos individuales de fondo redondo de 14 mililitros y enjuáguelos dos veces con tampón fosfato 0,1 molar a pH 7 durante cinco minutos cada vez, asegurándose de que el tejido quede completamente sumergido. Al final del segundo enjuague, tenga cuidado de eliminar toda la solución en exceso.A continuación, agregue cinco mililitros del reactivo GUS a cada tubo. Si esto no cubre completamente la muestra de tejido, añada más reactivo. Incube los tubos durante diez minutos a 55 grados Celsius en la oscuridad.A continuación, incubar los tubos durante 12 a 16 horas adicionales en un agitador a 37 grados Celsius en la oscuridad, utilizando agitación suave. Al retirarlos del incubador, tomar un subconjunto aleatorio de los tubos y verificar el pH del reactivo GUS utilizando papel de tornasol con un rango de pH de cero a siete. Si alguno tiene un pH inferior a seis, etiquetarlos y verificar el resto de los tubos.Etiquete y excluya cualquier tubo con un pH inferior a seis. Vierta el reactivo GUS desde los tubos y sustitúyalo con etanol al 70 por ciento suficiente para cubrir el tejido. Almacene las muestras a cuatro grados Celsius hasta que sean necesarias.Utilizando un par limpio de pinzas, retire todo el tejido de la ventana cambial de un tubo de muestra y colóquelo sobre una bandeja pequeña o una placa de Petri para su visualización microscópica. Coloque la muestra bajo la lente de un microscopio estereoscópico con un aumento entre 1X y 4X, e identifique y cuente el número de células o tejidos que presentan tinción azul brillante. En los ejemplos en los que se eliminó el floema, cuente el número de sectores en el tejido cambial encontrados en la superficie del xilema en desarrollo.Para muestras cortadas en discos, cuente el número de sectores encontrados en los diferentes tipos de células o tejidos. Asegúrese de observar ambos lados del disco y de emparejar los sectores que se extienden entre dos discos para garantizar que los números no se sobrestimen. Coloque únicamente el tejido que contiene los sectores nuevamente en el tubo que contiene etanol al 70 por ciento y almacénelo hasta que sea necesario.Repita el análisis para cualquier ventana cambial adicional recolectada, incluyendo los controles positivo y negativo. Para ayudar en la identificación precisa de la clasificación de los sectores, le sugerimos familiarizarse con la anatomía y el desarrollo secundario del tallo, incluyendo las respuestas del tallo al daño. Esta figura muestra varias transformaciones exitosas observadas aquí como regiones de tinción azul.Una ventana de exfoliación del floema muestra múltiples sectores transformados y discos recolectados de dos especies de árboles que presentan sectores de transformación y crecimiento radial subsiguiente. También puede observarse la transformación en una variedad de tipos de tejidos. Aquí, sectores del tallo pueden verse en el peridermo, floema, parénquima de herida y varias otras regiones de tejido del álamo blanco.Esta imagen muestra los resultados de la expresión del promotor génico en derivados del cámbium. En este ejemplo, se observa la proporción de tinción en cada tipo de tejido en un ensayo que incluye una serie de promotores CesA de Eucalyptus grandis transformados en tallos de híbridos de eucalipto. La expresión en floema, xilema en desarrollo y xilema desarrollado se representa como un porcentaje.El número promedio de eventos de transformación por centímetro de cambium inoculado también puede calcularse para cada promotor o gen de interés. Esta tabla muestra los datos de los sectores típicos identificados en ejemplares de eucalipto y álamo transformados con un control positivo o con un promotor de interés, analizados mediante el método de recolección de discos. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar un método rápido, eficiente y ampliamente aplicable para analizar la naturaleza compleja de la diferenciación del cambium con la formación en el desarrollo secundario del tallo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar plantas y bacterias, cómo transformar, cultivar y cosechar tallos, así como cómo identificar y clasificar el tejido transgénico para la evaluación fenotípica.

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Research

Investigación

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Genetics

Genética

Un método basado en la microscopía confocal de Raman que se presenta ofrece sin etiquetas de visualización de la lignina en las paredes celulares vegetales y comparación de lignificación en los diferentes tejidos, muestras o especies.

Sin etiquetas In situ Imágenes de lignificación de las paredes celulares vegetales

La composición de la pared celular de la planta varía según el tipo de tejido y puede incluir lignina, celulosa, hemicelulosas y pectina. Se han desarrollado varias técnicas de tinción para visualizar las diferencias a nivel de tipo de célula. Este artículo es una recopilación de las técnicas de tinción de pared celular más utilizadas.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Aquí presentamos un protocolo que describe cómo muestrear especímenes de madera para la evaluación general de sus estructuras de crecimiento. Se describen las técnicas de preparación y visualización macro y microscópica necesarias para generar conjuntos de datos anatómicos y dendroecológicos de madera bien replicados y altamente resueltos.

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El Sistema Inducible de Raíces Laterales (LRIS) permite la inducción sincrónica de raíces laterales y se presenta para Arabidopsis thaliana y maíz.

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A nivel subcelular, los eventos de señalización son modulados dinámicamente por señales de desarrollo y ambientales. Aquí describimos un protocolo que emplea el sistema de expresión transitoria del tabaco para monitorear la interacción dinámica proteína-proteína y para revelar la organización espacial de la transducción de señales en células vegetales.

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La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

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El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria (Video) | JoVE Journal

El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria

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