Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos

El objetivo general de este procedimiento es aislar miocitos de ganglios sinoauriculares espontáneamente activos de ratones para experimentos electrofisiológicos o de imagen a corto o mediano plazo. Los miocitos aislados del nódulo sinoauricular son importantes para el estudio de los mecanismos de marcapasos cardíacos, en particular el estudio de las corrientes iónicas específicas o el momento de la liberación de calcio intracelular. Pero relativamente pocos laboratorios utilizan miocitos sinoauriculares aislados de ratones, en parte porque es muy difícil aprender el procedimiento solo con métodos escritos.

Después de preparar todas las soluciones necesarias para el aislamiento, retire el pelaje del pecho del animal con unas tijeras. A continuación, seccione la caja torácica para exponer la cavidad torácica con pinzas de tejido externo y tijeras de disección. Enjuague la cavidad torácica con dos mililitros de Tyrode completo calentado con heparina.

Bajo un microscopio de disección, extraiga cuidadosamente los pulmones y el timo con tijeras internas y pinzas de disección. Mientras sostiene suavemente el ápice del corazón, corte con cuidado la vena cava inferior y la aorta para extraer el corazón de la cavidad torácica. Luego transfiera el corazón a una de las placas de disección de silicona y luego enjuáguelo con dos a cuatro mililitros de Tyrode completo heparinizado calentado.

Oriente el corazón de manera que los vasos posteriores sean visibles y miren hacia arriba. A continuación, inmovilice el corazón clavándolo a través del ápice en la placa de disección de silicona. Después, localiza el surco entre los ventrículos y las aurículas.

Con las tijeras de disección internas, haga una incisión en el surco mientras lo mantiene cerca de los ventrículos. Enjuague el surco y la incisión con Tyrode completo heparinizado calentado adicional, según sea necesario, para permitir una visión clara de las aurículas y las válvulas. Luego continúe cortando a lo largo del surco para separar las aurículas de los ventrículos.

Posteriormente, transfiera el tejido auricular a la segunda placa de disección de silicona y enjuague con tres mililitros de Tyrode completo heparinizado calentado. Después, mientras estira suavemente la preparación, sujete el tejido a través de la vena cava inferior. A continuación, voltee el tejido de modo que la aurícula derecha del animal quede ahora en el lado izquierdo del experimentador y la aurícula izquierda en el lado derecho del experimentador.

Es muy importante obtener y reconocer la orientación para aislar el tejido correcto. Proceda a sujetar el tejido a través de la vena cava superior, luego los apéndices auriculares derecho e izquierdo. Retire cualquier resto de grasa u otro tejido para permitir una visión clara de la preparación.

Posteriormente, abrir la pared anterior de las aurículas cortando las venas cavas. Gire el plato según sea necesario para diseccionar las venas cavas superiores e inferiores. Vuelva a colocar los clavos según sea necesario para visualizar el tabique interauricular.

A continuación, corte a lo largo del tabique interauricular para extirpar la aurícula izquierda. Vuelva a sujetar la preparación, estírela suavemente y retire la grasa de detrás del ganglio sinoauricular. Después de eso, retire el apéndice auricular derecho y luego libere el nódulo sinoauricular cortando a lo largo de la crista terminal, que aparece como una raya de color naranja oscuro que bordea el apéndice auricular.

Vuelva a sujetar o dessujetar el tejido ganglionar y córtelo lateralmente para producir tres tiras del mismo tamaño. En este procedimiento, utilizando la pipeta estrecha pulida al fuego, transfiera tres tiras de tejido del nódulo sinoauricular al primero de los tres tubos pequeños de fondo redondo que contienen 2,5 mililitros de Tyrode de magnesio y bajo en calcio e incube durante cinco minutos. Después de cinco minutos, transfiera las tiras de tejido al segundo tubo pequeño de fondo redondo que contiene 2,5 mililitros de Tyrode de magnesio y calcio con bajo contenido de calcio.

Lave las tiras de tejido agitando suavemente el tubo o pipeteando suavemente con la pipeta estrecha. No invierta el tubo. A continuación, transfiera las tiras de pañuelo al tercer tubo pequeño de fondo redondo que contenga 2,5 mililitros de Tyrode de magnesio y bajo en calcio y repita el paso de lavado.

Después, transfiera las tiras al tubo grande de fondo redondo que contiene 2,5 mililitros de Tyrode de magnesio con bajo contenido de calcio con enzimas. Mezcle cada cinco minutos agitando suavemente el tubo. Después de la digestión enzimática, use una pipeta estrecha pulida al fuego para transferir suavemente las tiras de tejido al primero de los tres tubos pequeños de fondo redondo que contienen una solución de KB modificada.

Luego, transfiera las tiras a través del segundo y tercer tubo pequeño de fondo redondo para lavar el pañuelo antes de transferirlo al tubo de fondo redondo grande que contiene la solución de KB. Usando la pipeta pulida al fuego más grande, disocie las celdas en el tubo de fondo redondo grande mediante trituración constante, teniendo cuidado de mantener el tubo de disociación sumergido en el baño de agua a 35 grados Celsius y evitar introducir burbujas en la solución. Hemos descubierto que una expulsión forzada de la solución a una frecuencia de aproximadamente uno por segundo o un hercio funciona mejor.

Ahora agregue 75 microlitros de solución de adaptación de cloruro de sodio y cloruro de calcio a los tejidos. Revuelva suavemente para mezclarlos e incubarlos durante cinco minutos. Continúe agregando calcio en incrementos como se describe en el protocolo escrito.

Después de la readaptación del calcio, recoja los miocitos sinoauriculares dejándolos reposar durante unos 10 minutos o mediante centrifugación a 2.000 veces g durante tres minutos. En el caso de células aisladas de forma aguda, retire y deseche suavemente unos cinco mililitros del sobrenadante con una pipeta de transferencia. A continuación, almacene las células a temperatura ambiente durante un máximo de ocho horas para realizar experimentos con pinzas de parche.

Posteriormente, las evaluaciones funcionales de los miocitos sinoauriculares aislados se pueden realizar mediante registros de pinza de parche para los potenciales de acción espontáneos y las corrientes de membrana. Los miocitos sinoauriculares espontáneamente activos pueden mantenerse en cultivo hasta seis días. Las células cultivadas conservan una morfología general muy similar a la de los miocitos sinoauriculares aislados de forma aguda, sin cambios significativos en la longitud media, la anchura, el área de la sección transversal o la capacitancia de la membrana de las células cultivadas en comparación con las células aisladas de forma aguda.

Las celdas son adecuadas para una variedad de estudios experimentales, como registros de pinzas amperimétricas de corriente y voltaje. Aquí se muestran como ejemplos los potenciales de acción espontánea y la corriente divertida. Una vez dominado, la disección, el aislamiento y la reintroducción del calcio del ganglio sinoauricular se pueden completar en aproximadamente dos horas para que pueda tener las células listas para sus experimentos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la orientación del tejido es fundamental para una buena disección y que los pasos de disociación enzimática y mecánica deben optimizarse como se describe en el texto. Siguiendo este procedimiento, los miocitos aislados del nódulo sinoauricular se pueden usar para una variedad de experimentos, incluida la electrofisiología de una sola célula, imágenes de calcio e inmunocitoquímica. Las células también se pueden mantener en cultivo para experimentos que requieran manipulación de genes o la expresión de moléculas reporteras.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar miocitos sinoauriculares de ratones adultos. Mucha suerte con tus experimentos.