Adenofection: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en Morfodinámica celular mediante experimentos de reducción-Rescate

El objetivo general de este método es permitir que los experimentos de rescate de agotamiento se realicen en condiciones que preserven la integridad celular y la homeostasis de las proteínas. Para análisis funcionales de procesos biológicos a nivel de célula individual. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las funciones de las proteínas y los requisitos estructurales en la dinámica celular, como la mitosis y la diferenciación celular.

La principal ventaja de esta técnica es agotar una proteína de interés y reintroducir al mismo tiempo una variante de esta proteína a nivel neofisiológico en una medición de una población celular. Comience cubriendo los platos con fondo de vidrio con fribronectina. Para ello, diluir un miligramo por mililitro de firbronectina stock de uno a 100 con PBS estéril.

Añade un mililitro a cada plato de 35 mililitros para cubrir toda la superficie. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Durante la incubación, se precalentó alfa MEM suplementado con 10% de FBS y una alícuota de 0,05% de tripsina EDTA a 37 grados centígrados.

Después de 45 minutos de incubación, comience a preparar la solución celular. Aspire el medio de una placa de 10 centímetros de células HeLa RFP H2B. Y enjuague suavemente dos veces con 1,5 mililitros de 0,05% de tripsina EDTA.

Deje 0,5 mililitros de tripsina EDTA en el plato después de la última aspiración. E incubar las células durante dos o tres minutos a 37 grados centígrados. Y 5% de dióxido de carbono.

Golpee suavemente la placa. Y observe la capa celular bajo el microscopio para verificar que todas las células se hayan desprendido. A continuación, añada 10 mililitros de medio y pipetee suavemente varias veces para separar las células y transferir la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros.

Cuente una muestra de 10 microlitros de la suspensión celular con un hemocitómetro. A continuación, aspire la solución de fibronectina de los platos con fondo de vidrio. No permita que la fibronectina se seque antes de la colocación de la siembra de las células.

Prepare una solución de suspensión celular para colocar 1,5 veces diez a la quinta celda por plato de 35 milímetros en dos mililitros de medio. Placa una placa de 35 milímetros adicional al número de condiciones para contar el número de células antes de la transducción del virus. Incubar durante 30 a 45 minutos.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, revise las células bajo el microscopio para asegurarse de que las células estén bien separadas. Como se ve aquí. Regrese las placas a la incubadora y cultive las células hasta el día siguiente.

Al día siguiente de la siembra, asegúrese de que las células hayan alcanzado una densidad de al menos el 50%Una densidad celular inferior al 50% resulta en una disminución de la eficiencia de la transducción del virus. Aumento de la variación de la expresión de proteínas por célula y aumento de la toxicidad celular. A continuación, coseche las células del plato adicional como antes.

Y cuenta el número de celdas. Calcular el volumen de virus necesario para una transducción eficiente de las células. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada condición.

Y agregue 400 microlitros de alfa MEM caliente menos. Después de descongelar lentamente las alícuotas de los virus en hielo, agregue el volumen requerido de cada virus a los tubos y mezcle suavemente mediante pipeteo. A continuación, después de aspirar el medio de las células, agregue suavemente la mezcla de virus gota a gota.

Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Cada 15 minutos durante un período de una hora, agite las placas cuidadosamente debajo de la campana estéril para cubrir las células con virus. El uso de una pequeña cantidad de medio facilita el contacto del virus con las células.

Después de la incubación, pipetear suavemente 1,6 mililitros de alfa MEM menos en cada placa para obtener un volumen total de dos mililitros. A continuación, inicie la sincronización celular añadiendo dos milimolares de timidina antes de incubar las células durante otras dos horas. Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección de siRNA agregando en un microtubo 139 microlitros de agua estéril, 50 microlitros de cloruro de calcio molar y 11 microlitros de siRNA de 20 micromolares.

Si no es necesario ningún siRNA, reemplace la cantidad de siRNA por agua estéril para realizar una transfección vacía. Agregue la solución de HBSS2X gota a gota lentamente a la mezcla de siRNA de cloruro de calcio. Mezclar suavemente dos veces por inyección de aire con una pipeta de 200 microlitros.

Como precipitados más pequeños, mejor eficiencia de transfección. A continuación, incubar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, agregue lentamente 200 microlitros gota a gota a cada placa y agite para mezclar.

Incubar las placas a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 16 horas. Al día siguiente, retire las placas de la incubadora y transpórtelas a una campana de cultivo de tejidos. Después de enjuagar las células dos veces con dos mililitros de hipis tibio, agregue dos mililitros de alfa MEM menos antes de regresar a la incubadora.

Siete horas más tarde, agregue dos milimolares de timidina a las placas antes de devolverlas a la incubadora. Trabaje con no más de cuatro placas de celdas a la vez, ya que las variaciones de temperatura afectan la duración del ciclo de celdas. Al día siguiente, 48 horas después de la transfección de siRNA y la infección por virus, enjuague las células dos veces con dos mililitros de PBS tibio y luego agregue dos mililitros de alfa MEM sin rojo de fenol para obtener imágenes de células vivas.

Incubar durante siete horas. Realizar experimentos de imagen de células vivas a corto plazo en células mitóticas con un microscopio invertido equipado con una cámara termorregulada humidificada de dióxido de carbono al 5%. Antes de la adquisición, verifique que la cámara haya alcanzado la temperatura adecuada de 37 grados centígrados.

Coloque las placas cultivadas en la cámara del microscopio una hora antes de la adquisición para permitir un equilibrio adecuado del medio y evitar la deriva del enfoque debido a los cambios de temperatura. Examina el estado mitótico de las células. En este punto.

el 10 y el 15% de las células deben estar en las primeras etapas de la mitosis. Durante el tiempo de equilibrio, configure los parámetros de adquisición según lo determinado en experimentos anteriores. Es importante lograr una resolución adecuada sin fotoblanqueo.

Ya que esto causa daño celular y perturba la progresión mitótica. Elija varios campos que contengan células que estén en la entrada mitótica por condición para obtener un número significativo de células para analizar sin exceder el intervalo de adquisición. Una vez que se hayan elegido todos los campos, restablezca el enfoque e inicie la adquisición lo más rápido posible.

El uso de un disco giratorio puede enfocar el sistema. Una configuración típica incluiría cuatro condiciones diferentes. Siete campos por plato.

Y dos canales de color con un intervalo de 1,5 a dos minutos durante un período de 75 minutos. Determinar criterios bien definidos para analizar los tipos de fenotipos mitóticos en las células, que dependerán de los marcadores fluorescentes que se utilicen. A diferencia de la transfección de BAG3 GFP, el ADN plasmático, como se ve a la izquierda, la adenofección con adenovirus recompetentes que se muestra aquí a la derecha permite una expresión más homogénea y eficiente de BAG3 GFP.

En la mayoría de la población celular a baja multiplicidad de infección. Este western blot representativo muestra que la adenofección con siRNAs específicos de BAG3 y adenovirus recompotentes BAG3 GFP permite la depleción eficiente de BAG3 endógeno y la reintroducción de la proteína BAG3 GFP a niveles casi endógenos. Como se muestra aquí, la adenofección puede preservar la homeostasis de las proteínas, ya que no hay un aumento detectable en los niveles de las proteínas de choque térmico inducidas por el estrés en las células HeLa que han sido adenofectadas.

A diferencia de las células HeLa tratadas con el inductor de estrés proteotóxico, MG132. Aquí vemos que la progresión de las células a través de la mitosis no se ve perturbada significativamente por la adenofección, como lo muestran estas imágenes de lapso de tiempo confocal de células HeLa adenofectadas con siRNA de control y BacMam GFP alfa tubulina. y BacMam FRP actina.

El gráfico indica la proporción de células con mitosis anormal. Las células adenofectadas con siRNA específico de BAG3 solo mostraron un aumento aproximado de dos veces en el nivel de defectos mitóticos. Como se muestra en la barra roja.

Que se restauró cerca del nivel de la celda de control mediante la reintroducción de BAG3 GFP que se muestra en la barra negra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de rescate de agotamiento utilizando la adenofección. Este método proporciona un sistema rápido y sencillo para crear derribos hipomórficos para el análisis de la función de la estructura en múltiples fondos celulares.

Siguiendo este método, se pueden identificar los requisitos estructurales clave de la proteína de interés para una función determinada. Se pueden utilizar otros enfoques de edición del genoma para profundizar en la mecánica involucrada.