Name: Preparación de CD4 + Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a preparar células T CD4+ para analizar la expresión de gangliósidos GD3 y GD2 mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo optimiza el uso de bajas cantidades celulares en investigación de leucemia.

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Agradecemos al Dr. José Luis Daniotti por sus comentarios. Agradecemos la asistencia al Dr. J. Arturo Pimentel y al Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM por la adquisición de imágenes confocales. I.M.-D. y T.M.V.C. fueron apoyados por becas 157634 y 253596 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiología, A.C. T.M.V.-C. es beneficiario de una beca (245192) del CONACYT. Agradecemos también el apoyo de la Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

La sangre periférica de donantes varones sanos se obtuvo con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Bioética del Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos. 1. Aislamiento y activación de T humanas indiferenciadas CD4 + células <ol><li> Recoger 2 ml de sangre periférica derivadas de donantes humanos sanos mediante el consentimiento informado y se diluye con 2 ml de PBS estéril-EDTA (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Añadir la sangre diluida lentamente en la parte superior de 3 ml de solución de sacarosa con 1,077 de densidad como se describe anteriormente 8. Nota: La migración diferencial durante la centrifugación causado por diferencias en la densidad hará que los eritrocitos sedimentan a completamente y una capa de células mononucleares menos densos formará anteriormente. 2 ml de sangre periférica se rinden aproximadamente 0,5 x 10 6 células T CD4 + vírgenes después de la Purificatisobre las medidas. </li><li> Centrifugar 30 minutos a 250 xg en 21 ° C (uso rotor para tubos de fondo redondo con ángulo fijo de 30 mm) sin interrupción para generar el gradiente de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Después de la centrifugación, el PBMC se puede observar claramente como un anillo blanco. Recoger las PBMCs con una pipeta y transferir al tubo estéril para el lavado. </li><li> Después de tres lavados con solución de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min proceder a la purificación de células T CD4 + vírgenes. métodos de selección o varios tipos de kits de purificación están disponibles para este propósito. Preferiblemente, utilice&gt; 1 x 10 7 PBMCs para la purificación. <ol><li> Purificar las células T CD4 + no tratados previamente por selección negativa con perlas magnéticas. Realizar la selección negativa con anticuerpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, y CD235a (glicoforina A). Evaluar el porcentaje de pureza mediante la determinación de células CD45RA + CD4 + a través de fcitometría de baja. Nota: Opcionalmente, se procede a la incubación de las PBMC durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2 con una densidad de 1 x 10 6 células / ml en 10 ml de medio suplementado para promover la adhesión de los monocitos y continuar con la purificación ingenuo células T CD4 +. La recuperación eficiente de las células T CD4 + vírgenes de sangre periférica depende en gran medida del sistema de purificación. </li></ol></li><li> Preparar placas de cultivo celular de 24 pocillos mediante la adición de 250 l por pocillo de PBS con anticuerpo 5 mg / ml de anti CD3 monoclonal y se incuba durante al menos 2 horas a 37 ° C. Nota: Las placas con 96 pocillos se pueden utilizar cuando se utiliza un número más pequeño de células T CD4 + no tratados previamente (por ejemplo, 2 x 10 4 -1 x 10 5). </li><li> Retire la dilución de anticuerpo anti CD3 desde el 24 de pozo o placas de 96 pocillos y se lavan las placas dos veces con PBS estéril 1x. </li><li> Diluir las células T CD4 + no tratados previamente con&gt; 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a una densidad de 1 x 10 6 células / ml en avanzado 1640 medio RPMI suplementado con 3% de suero bovino fetal (o RPMI suplementado con 10% de suero), glutamina 2 mM y antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 g / ml de estreptomicina). Nota: Si se requiere la localización de gangliósidos en PBMCs, siguen el mismo protocolo para la dilución y estimulación como se describe a continuación. </li><li> Añadir 500 l de la dilución de células a pocillos recubiertos anti-CD3 y a los pozos no recubiertos (células de control) en la placa de 24 pocillos. Alternativamente, añadir 100 l de la dilución de células a los pocillos de la placa de 96 pocillos. </li><li> Completar las condiciones de estimulación de células T CD4 + vírgenes en los pozos de anti-CD3 recubiertos mediante la adición de 1 mg / ml de anticuerpo anti CD28. </li><li> Mantener las células T CD4 + en reposo como el control en los pocillos no revestidos sin la adición de anticuerpos anti CD28. Incubar el reposo y activadas de células T CD4 + durante 0 a 72 horas en condiciones estándar de 37 °C y 5% de CO 2. </li><li> Para verificar una activación adecuada evaluar mediante citometría de flujo la expresión del marcador de activación temprana CD69 (16 horas después de la activación) o CD25 marcador de activación tardía (48 horas después de la activación) en reposo y activadas las células T CD4 + vírgenes se incubaron a 37 ° C y 5% de CO 2 en ausencia o presencia de anticuerpos anti CD3 / CD28 9,10. </li></ol> 2. La adhesión de reposo y activadas las células T naive CD4 + <ol><li> Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos en autoclave y exposición a la luz UV durante al menos 15 minutos. </li><li> Coloque los cubreobjetos en placas de cultivo celular de 24 pocillos estériles. Nota: Para los cultivos con células de menos de 1 x 10 5, es preferible utilizar cámaras de diapositivas con pozos pequeños adaptados para evitar la dispersión de células en cubreobjetos. </li><li> cubreobjetos de la capa (o cámara de diapositivas) con 200 l de poli-L-lisina (MW 150 a 300 KDa) 0,1% (w / v) de la solución y se incuba durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar y secar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar con cuidado y recoger el reposo y las células T CD4 + activadas ingenuas de las placas de 24 pocillos. Contar las células y, si es necesario, ajustar con medio suplementado fresco para transferir 1 x 10 5 células a los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Se incuban las células durante un mínimo de 6 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 3. La recolección y fijación de reposo y activadas Naïve células T CD4 + <ol><li> Retirar con cuidado el medio de reposo y se cultivaron las células T CD4 + activadas ingenuos. </li><li> Añadir 500 l de PBS estéril RT lentamente. Nota: Además cuidadosa y la eliminación de soluciones de los pozos impide el desprendimiento de células del cubreobjetos. </li><li> Desechar el PBS y añadir otros 500 l de PBS para eliminar completamente los medios de cultivo. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l filtrada paraformaldehído al 4% (filtración elimina micropartículas que pueden interferir con el análisis de microscopía) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente (preferido) o durante la noche a 4 ° C. Precaución: El paraformaldehido es un compuesto tóxico y volátil. Se sabe que es un carcinógeno humano. Utilice con cuidado con un protocolo de seguridad adecuado. </li><li> Retire el fijador y lavar al menos dos veces con PBS a temperatura ambiente. </li><li> Proceder al siguiente paso o mantener los pozos de la placa con 500 l de PBS a 4 ° C durante varios días hasta que las manchas. Nota: La esterilidad durante este proceso ayuda a evitar el crecimiento de microorganismos. </li></ol> 4. La tinción, montaje y visualización mediante microscopía confocal <ol><li> Retire el PBS de los pozos. Añadir 500 l de tampón de bloqueo frío (1x PBS, 0,5% de grado estándar de albúmina de suero bovino, 1% de suero fetal bovino pH 7,4). Incubar durante 20 minutos en hielo. </li><li> Retire el amortiguador de bloqueo y añadir con cuidado los anticuerpos primarios (anti gangliósidos GD3 R24 clon, clon GD2 14G2a),PE-conjugado anti CD25 y APC-conjugado anti TCR e isotipos controles diluidos en tampón de bloqueo a 2,5 g / ml. </li><li> Incubar 2 horas en el hielo o la noche a 4 ° C. Nota: agitación orbital lenta es preferible. </li><li> Retire el anticuerpo con cuidado y lentamente añadir 500 l de PBS. Repetir dos veces. </li><li> Añadir los anticuerpos secundarios (FITC conjugado anti IgG3 para R24 contra GD3, Alexa Fluor 488-conjugado o Alexa Fluor 647-conjugado anti IgG2a para 14G2a contra GD2) diluido en tampón de bloqueo a 0,1 g / ml. </li><li> Incubar durante 1 hora en hielo en la oscuridad sin agitación. </li><li> Lavar tres veces en PBS como se describe en 4.4). Mantener los pocillos con PBS suficiente para evitar la deshidratación de las muestras. </li><li> Añadir Hoechst 333258 mancha diluido en PBS a 0,1 g / ml. </li><li> Incubar 15 minutos a temperatura ambiente y quitar. Lavar tres veces en PBS. </li><li> Colocar los portaobjetos en una toalla de papel y añadir 20 l de solución de montaje (50% de glicerol en PBS) o solución de montaje comercials para evitar la decoloración y el enfriamiento rápido de las muestras. </li><li> Recoja cuidadosamente el cubreobjetos con unas pinzas finas y colocarlo en la solución de montaje. Asegúrese de que el lado del cubreobjetos donde se unen las células está en contacto con la solución. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y analizar mediante fluorescencia o microscopía confocal. </li></ol> 5. Aislamiento de ARN <ol><li> Preparar anticuerpo anti CD3 (5 mg / ml) recubiertas placas de 96 pocillos. Incubar 4 x 10 4 células T CD4 + vírgenes / pocillo en 100 l de medio de cultivo suplementado con el anticuerpo CD28 contra (1 mg / ml) para completar el estímulo. Incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante 0-72 hr. </li><li> Después de diferentes tiempos post-activación colocar las células en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 500 l de PBS y centrifugar a 250 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de reactivo Trizol. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y mantener la muestra a -8076; C durante al menos 24 h. Proceder con el aislamiento de ARN cuando sea necesario. Nota: Dejar la muestra a -80 ° C durante al menos 24 horas mejora el rendimiento de ARN. Además, el uso de guantes de la mano es esencial para evitar la degradación del ARN por RNasas. </li><li> Descongelar la muestra de incubación a 37 ° C durante 2 min en un baño de agua. </li><li> Añadir 200 l de cloroformo y agitar con fuerza a mano durante 30 segundos (para evitar la mezcla agresiva de ARN mediante agitación). Incubar 5 min a TA. </li><li> Centrifugar 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C. </li><li> Recuperar la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 500 l de isopropanol y se invierte el tubo tres veces. </li><li> Incubar 10 min a RT y se centrifuga durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante por inversión. </li><li> Añadir 1 ml de hielo frío de etanol 75% y se centrifuga 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Completamente descartar el sobrenadante y secar el pellet de ARN dejando el tapón del tubo abierto. Noe: En este punto el pellet no es claramente visible. Procede de todas maneras. </li><li> Resuspender el precipitado en 20 l de agua de grado molecular. Calcular la concentración y pureza de los ácidos nucleicos mediante la medición de la absorbancia 260 nm y 280 nm usando NanoDrop. </li><li> Proceder con cuidado para la síntesis de ADNc mediante el uso de cualquier kit de transcriptasa inversa convencional y siguiendo el protocolo del fabricante. Nota: Aproximadamente 0,5 a 2 g de ARN se obtiene a partir de 4 x 10 4 células T CD4 + vírgenes. cDNA puede ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN y se utiliza en tiempo real, las reacciones de PCR sin la necesidad de kits de entrada baja de ARN. </li></ol>

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<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito se puede utilizar para localizar gangliósidos o proteínas en las suspensiones de células de células T CD4 + o otras células inmunes (por ejemplo, PMBCs, figura 5) a partir de un pequeño número de células. Debido al pequeño tamaño de las células T y las propiedades no adherentes, la adquisición de fluorescencia imágenes microscópicas se obtenga información mala o baja calidad si las células están no se cumplen correctamente. Este prot...

Las células T CD4 + orquestan la respuesta inmune a través de sus funciones efectoras después de la activación por las células presentadoras de antígeno 1. El estudio de los mecanismos celulares que están moduladas durante la activación permite penetración en un proceso básico de la función inmune. Sin embargo, el estudio de las células T CD4 + vírgenes puede ser complicado debido a que representan una población muy pequeña de células en la periferia de sangre 2. A través de microscopía de fluorescencia varios informes han estudiado la localización de diferentes moléculas implicadas en la activación de células T CD4 +, principalmente proteínas asociadas a la membrana plasmática 3. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y aunque han sido ampliamente estudiados en las células nerviosas en el que son abundantes, otras células tales como las células inmunes también expresan gangliósidos con biológicamente funciones relevantes 4,5. Hemos informado anteriormente de that durante la activación de las células T CD4 + vírgenes humanos hay una regulación por incremento de la α2,8 sialiltransferasa ST8Sia 1 (GD3 sintasa) y la sintasa GM2 / GD2, que inducen la neoexpression superficie significativa de GD2 y la regulación al alza de GD3 gangliósido 6. El estudio adicional de GD3, GD2 y otros gangliósidos en células inmunes, es necesario complementar una vista parcial a base de proteínas de la función inmune. Comúnmente, el estudio de la expresión de gangliósidos se basa en técnicas tales como cromatografía en capa fina (TLC) 7, pero esta técnica no permite la localización espacial de los gangliósidos en la membrana plasmática o en compartimentos subcelulares, limitando el análisis biológico. En este trabajo, se describe un protocolo para la identificación mediada por anticuerpos y localización de GD3 y GD2 gangliósidos en células T CD4 + vírgenes humanos y PBMCs después de la activación anti-CD28 anti-CD3 /. Con este protocolo se iTambién es posible analizar el gen y la expresión molecular de gangliósidos en un bajo número de células en suspensión, con la adquisición de imágenes de alta calidad 6, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los linfocitos (9 m).

<table><tbody><tr><td>RPMI avanzado 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplementado con un 3% de anticuerpo</td></tr><tr><td>CD3 humano anti ratón</td> FBS <td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>clon de OKT3</td></tr><tr><td>ratón anti humano anti humano anticuerpo CD28</td><td>ebioscience 16-0288-81</td><td></td><td>clon CD28.6</td></tr><tr><td>ratón anti humano GD3&nbsp; anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24</td></tr><tr><td>ratón clon anti anti humano GD2 anticuerpo Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>clon 14G2a</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-ratón IgG3 conjugado con FITC</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antiratón conjugado</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a anticuerpo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 antiratón conjugado</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr>Anticuerpo <td></td><td></td><td></td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Isolation Kit II, humano</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-tek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Microscopio Confocal Láser (Olympus)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI e IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>Cebador de secuencia directa GD3 sintasa</td><td>5&agudo;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>cebador de secuencia inversa GD3 sintasa</td><td>5&agudo;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Cebador de secuencia directa GM2/GD2 sintasa</td><td>5&agudo;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Cebador de secuencia inversa GM2/GD2 sintasa</td><td>5&agudo;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparación de cd4<sup&gt; +</sup&gt; las células t para el análisis de gd3 y gd2 gangliósidos membrana expresión mediante microscopía

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Los métodos aquí descritos para la activación de las células T CD4 + no tratados previamente en suspensión y su adhesión en cubreobjetos para el análisis de microscopía confocal permiten la localización espacial y la visualización de los gangliósidos que participan en la activación de células T CD4 +, que la expresión complemento experimentos de perfiles tales como citometría de flujo, en el oeste Blot o PCR en tiempo real. La cuantificación de la expresión de gangliósidos a través de citometría de flujo y su localización celular a través de microscopía se puede obtener por el uso de anticuerpos anti-gangliósido con alta afinidad y especificidad. Sin embargo, un manejo adecuado de células en suspensión implica el tratamiento de placas de cultivo para promover la adherencia necesaria requerida para la fluorescencia o la adquisición microscopía confocal. En este trabajo, se describe un protocolo para determinar GD3 y GD2 expresión de gangliósidos y colocalización con el TCR durante la activación de ingenuo células T CD4 +. También, en tiempo real, texperimentos ime PCR usando &lt;40.000 células se describen para la determinación de la GD3 y GM2 genes / GD2 sintasa, lo que demuestra que los experimentos de análisis de gen se puede realizar con un bajo número de células y sin la necesidad de kits adicionales bajos de ARN de entrada.

El protocolo descrito en este manuscrito hace que una buena calidad de culto y de descanso adherido y las células T CD4 + vírgenes humanos activados (Figura 1). Las células T CD4 + activadas muestran el perfil proliferativa característica (Figura 1B) en comparación con la condición de reposo (Figura 1A). El marcador de activación CD25 tarde es útil para evaluar la activación eficiente en 72 hr observada por microsco...

Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando &lt;40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar la preparación de una suspensión de células T CD4+ para tinción, con el fin de visualizar la localización de los gangliósidos GD3 y GD2 en la superficie celular utilizando un número reducido de células. Este método permite la visualización de glicolípidos de membrana en un bajo número de células en suspensión pequeñas, como es el caso de las células mononucleares. La principal ventaja de esta técnica es que permite evaluar la expresión y localización de gangliósidos en cantidades reducidas de células T CD4+, optimizando así el uso de la muestra.Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la investigación y el diagnóstico de algunos tipos de leucemia de células T. Como hemos encontrado, algunas líneas celulares de leucemia aumentan la expresión de los gangliósidos GD3 y GD2. Comience por diluir dos mililitros de sangre periférica de donantes humanos sanos con dos mililitros de PBS EDTA estéril.Dispensar lentamente la sangre diluida sobre tres mililitros de solución de sacarosa de densidad 1,077. Luego, centrifugar durante 30 minutos a 250 veces G a 21 grados Celsius sin freno para generar el gradiente de células mononucleares de la sangre periférica. Después de la centrifugación, las PBMC pueden observarse claramente como un anillo blanco.Recoger los PBMC con una pipeta y transferirlos a un tubo estéril para lavarlos. Después de lavar las células con PBS-EDTA, purificar las células T CD4+ naïve mediante selección negativa con microesferas magnéticas utilizando un kit disponible comercialmente. Una vez obtenida una población de células T CD4+ con una pureza mayor al 95 %, preparar placas de cultivo celular de 24 pocillos añadiendo 250 microlitros de anticuerpo monoclonal anti-CD3 a cinco microgramos por mililitro en PBS a cada pocillo.Incube la placa a 37 grados Celsius durante al menos dos horas. Tras la incubación, retire la dilución del anticuerpo anti-CD3 de las placas y lávelas dos veces con PBS 1x estéril. Luego, diluya las células T CD4+ naïve con medio RPMI 1640 avanzado suplementado hasta una densidad de uno por diez a la sexta células por mililitro.A continuación, agregue 500 microlitros de células diluidas a los pozos recubiertos con anti-CD3 de la placa de 24 pozos. Luego, complete la estimulación de las células T CD4+ naïve en los pozos recubiertos con anti-CD3 agregando un microgramo por mililitro de anticuerpo anti-CD28. Incube las células T CD4+ en reposo y activadas durante cero a 72 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Después de que haya transcurrido el tiempo de incubación asignado, recolecte las células T CD4+ naïve en reposo y activadas de las placas de 24 pocillos. Realice un conteo celular y, si es necesario, diluya las células con medio suplementado fresco hasta una concentración de un por diez a la sexta células por mililitro. Siembre 500 microlitros de las células diluidas en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga laminillas recubiertas con poli-L-lisina o una cámara de portaobjetos e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante un mínimo de seis horas.Tras la incubación, las células T CD4+ se adherirán a las laminillas. Retire cuidadosamente el medio de los pocillos y luego agregue lentamente 500 microlitros de PBS estéril. La adición de PBS durante el lavado debe realizarse con mucha precaución, especialmente cuando se preparan cámaras de portaobjetos con menos de 50.000 células por pocillo.Aspire el PBS y agregue otros 500 microlitros de PBS a los pocillos para eliminar completamente el medio de cultivo. Después de retirar todo el PBS, agregue 500 microlitros de paraformaldehído al 4% filtrado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las células. Tras la fijación, retire el fijador y lave al menos dos veces con PBS.Si se desea, la placa puede almacenarse con 500 microlitros de PBS en cada pocillo durante varios días a cuatro grados Celsius. Primero, retire el PBS de las células fijadas y agregue 500 microlitros de tampón bloqueador frío. Incube durante 20 minutos sobre hielo.Durante la incubación, es fundamental no agitar vigorosamente la placa, ya que la agitación desprenderá las células. Aspire cuidadosamente el tampón de bloqueo y añada tampón de bloqueo que contenga 2,5 microgramos por mililitro de uno de los anticuerpos primarios o anti-CD25 conjugado con PE, anti-TCR conjugado con APC, o un control isotípico. Incube durante dos horas en hielo y proteja de la luz, o durante la noche a cuatro grados Celsius.Tras la incubación, retire cuidadosamente la solución de anticuerpos y agregue lentamente 500 microlitros de PBS. Luego, añada los anticuerpos secundarios apropiados diluidos en tampón de bloqueo hasta una concentración de 0,1 microgramos por mililitro. Proteja de la luz e incube durante una hora en hielo, teniendo cuidado de evitar agitaciones.Después de lavar tres veces con PBS como antes, agregue el colorante Hoecht diluido en PBS hasta una concentración de 0,1 microgramos por mililitro e incube protegido de la luz durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego coloque las laminillas lavadas sobre una toalla de papel y añada 20 microlitros de solución de montaje o solución de montaje comercial para prevenir el desvanecimiento y el apagado de la fluorescencia. Finalmente, tome un cubreobjetos con pinzas finas, inviértalo con la cara hacia abajo y colóquelo encima de la solución de montaje, de modo que el lado del cubreobjetos donde están adheridas las células quede en contacto con la solución.Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas y analice mediante microscopía de fluorescencia o confocal. Esta imagen muestra la visualización en campo brillante de células T CD4+ fijadas 72 horas después de la activación. La validación de una activación eficiente tras la tinción se evalúa utilizando el anticuerpo anti-CD25 mostrado en rojo.El gangliósido GD3 se localiza intracelularmente y en la superficie celular de los linfocitos T CD4+ activados, tal como se evaluó mediante tinción con anticuerpo anti-GD3 mostrado en verde. GD3, nuevamente mostrado en verde, no co-localiza con el TCR, mostrado nuevamente en rojo, según se evaluó mediante tinción con anticuerpos anti-GD3 y anti-TCR. Sin embargo, el gangliósido GD2 sí co-localiza con el TCR en linfocitos T CD4+, tal como se determinó mediante tinción con anticuerpo anti-GD2, mostrado en verde, y tinción con anticuerpo anti-TCR, mostrado en rojo.La tinción del gangliósido GD3 muestra la localización intracelular y en la superficie celular en un subconjunto de PBMC activados. Mientras que la tinción del gangliósido GD2 muestra la localización intracelular y en la superficie celular en todos los PBMC activados. Tras seguir este procedimiento de adherencia y manipulación de las células T CD4+, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de compartimentos intracelulares, con el fin de responder preguntas adicionales, como la localización o procesamiento intracelular específico de los gangliósidos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular y adherir un bajo número de células T CD4+ para obtener imágenes de microscopía fluorescente de alta calidad y analizar la expresión de gangliósidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

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