In Vitro de grabación de la actividad nerviosa aferente mesentérica en ratón yeyunal y segmentos del colon

El objetivo general de esta técnica consiste en registrar in vitro la actividad del nervio aferente esplácnico a partir de un solo haz nervioso yeyunal o colónico en respuesta a distensiones progresivas y a la aplicación de compuestos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como si los nervios aferentes que inervan el tracto gastrointestinal presentan hipersensibilización o desensibilización durante diversos estados patológicos. Las principales ventajas de esta técnica son que permite el registro de la descarga nerviosa in vitro y que permite cuantificar la actividad nerviosa sin la modulación ni las influencias del sistema nervioso central.

La implicación de esta técnica se extiende hacia el tratamiento o diagnóstico de varios síndromes de dolor, como el síndrome del intestino irritable, ya que la sensibilización nerviosa desempeña un papel fundamental en la patogénesis. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la disección de los haces nerviosos y el análisis de unidad individual de la señal registrada requerirán una cantidad considerable de entrenamiento. Para comenzar este procedimiento, coloque el ratón sacrificado en posición supina.

Realice una incisión media abdominal a través de la piel y la capa muscular abdominal utilizando un bisturí, extendiéndola desde el apéndice xifoides hasta el hueso púbico. Posteriormente, enjuague la cavidad abdominal con solución de Krebs fría para evitar que los tejidos intraabdominales se sequen. Luego, extirpe rápidamente todo el yeyuno utilizando tijeras afiladas, retirando aproximadamente 20 centímetros del intestino delgado, comenzando inmediatamente desde la flexura duodeno-yeyunal.

Tenga cuidado de no dañar las estructuras circundantes y mantenga intacto el mesenterio del intestino delgado, que contiene los vasos sanguíneos y los nervios aferentes yeyunales. A continuación, coloque el yeyuno extirpado en solución de Krebs fría sobre hielo mientras lo oxigena continuamente con Carbigen. Luego, corte el yeyuno en segmentos de aproximadamente tres centímetros de longitud.

Localice el haz mesentérico que contiene los vasos sanguíneos y el nervio esplácnico cerca del centro del bucle correspondiente para facilitar la colocación del bucle en la cámara de registro. Posteriormente, lave cada segmento con solución de Krebs utilizando un catéter romo para eliminar los contenidos luminaires y el quimo, ya que contienen enzimas digestivas que acelerarán el deterioro de la muestra de tejido in vitro. Después de eso, seleccione un segmento para medir la actividad del nervio aferente y colóquelo en la cámara de registro codificada con una capa de elastómero de silicona.

Mantenga la temperatura de Krebs en la cámara de registro a 34 grados Celsius. Luego, coloque el segmento yeyunal en el baño de órganos, de modo que el extremo oral esté conectado al impulsor de jeringa que proporciona el flujo luminal y el extremo aboral se conecte al conducto de salida. Estire ligeramente el segmento, pero tenga cuidado de no ejercer una tensión excesiva.

Sujete ambos extremos firmemente usando ligaduras de seda a los puertos de entrada y salida. Posteriormente, conecte el impulsor de jeringa al extremo oral y perfunda el segmento yeyunal intraluminalmente con solución de Krebs a 10 mililitros por hora. Fije el mesenterio del segmento intestinal montado contra la capa inferior de elastómero de silicona para que quede plano.

Luego, estire el mesenterio para optimizar la visualización del haz mesentérico. A continuación, realice una prueba de distensión progresiva cerrando el puerto de salida hasta que la presión intraluminal del segmento intestinal alcance 60 milímetros de mercurio, con el fin de verificar que no haya fuga de solución de Krebs intraluminal desde el segmento montado. Observe un aumento progresivo y uniforme de la presión intraluminal sin interrupciones.

Se esperan pequeñas contracciones del segmento durante la fase inicial de distensión. Si es necesario, bloquee la actividad peristáltica añadiendo un micromol del bloqueador de los canales de calcio tipo L, nifedipino, a la solución de Krebs. Bajo un microscopio estereoscópico, comience suavemente a separar el tejido adiposo del mesenterio tirando delicadamente de él con dos pinzas pequeñas, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos y el nervio aferente que se encuentran dentro del tejido adiposo.

Comience a separar el tejido adiposo a cierta distancia del yeyuno para exponer ambos vasos sanguíneos en el haz mesentérico. Identifique el nervio yeyunal aferente entre ambos vasos como un delgado hilo blanco encapsulado en el tejido adiposo. Luego, diséquelo más proximalmente hacia el yeyuno separando suavemente el tejido adiposo con pinzas.

A continuación, diseccione el nervio mesentérico yeyunal del segmento eliminando el tejido adiposo adherido al nervio. Seccione el nervio utilizando tijeras de tejido afiladas. Si es necesario, retire suavemente la grasa restante y el tejido conectivo, así como la vaina epineural, tirando de ella con cuidado.

En este procedimiento, utilice un micromanipulador para introducir la punta del electrodo de succión en el baño orgánico. Luego, aspire suavemente algo de solución de Krebs del baño orgánico, de modo que la punta del electrodo quede sumergida en la solución de Krebs. Asegúrese de que la solución de Krebs cubra el electrodo de alambre dentro del electrodo de succión.

A continuación, coloque la punta del electrodo de succión inmediatamente junto al filamento nervioso aferente seccionado y aspire el filamento nervioso seccionado dentro de la capilaridad a lo largo de toda su longitud. Dirija la punta del electrodo hacia el tejido adiposo y aspire este tejido dentro de la capilaridad de vidrio mediante el émbolo, logrando así un sellado mecánico del nervio en la capilaridad, aislándolo del contenido del baño orgánico. El sellado adecuado de la capilaridad de vidrio respecto a la cámara de registro, mediante la aspiración de algo del tejido graso circundante dentro de la capilaridad, es fundamental para minimizar el ruido de fondo redundante que finalmente dificultaría el análisis final.

Para verificar la grabación de la actividad nerviosa aferente, realice un aumento inducido por distensión progresiva en la descarga aferente cerrando el puerto de salida para provocar un aumento gradual de la presión en el segmento intestinal. Solo realice el protocolo experimental deseado cuando tres distensiones progresivas consecutivas produzcan una descarga multiunitaria reproducible. Tras el aislamiento del nervio, estabilice la preparación durante 15 minutos para obtener una actividad nerviosa aferente espontánea estable antes de realizar los experimentos reales.

Se muestra aquí una representación esquemática de diferentes unidades de fibras aferentes según su perfil mecanosensible. Las fibras de umbral bajo muestran predominantemente un aumento en la actividad nerviosa a bajas presiones de distensión, lo que resulta en un porcentaje de LT superior al 55 %. Las unidades de umbral alto, por el contrario, solo muestran un aumento en la frecuencia de disparo a presiones nocivas. Las fibras de rango dinámico amplio muestran un aumento gradual en la actividad nerviosa durante toda la distensión, mientras que las fibras mecanicamente insensibles no responden a presiones crecientes de distensión.

Esta figura muestra la descarga del nervio aferente mesentérico en ratones de tipo salvaje durante la distensión progresiva. Obsérvese que en el perfil de distensión bifásico, el aumento inicial de la descarga nerviosa se debe a las fibras de umbral bajo y de rango dinámico amplio, mientras que las fibras de umbral alto y de rango dinámico amplio contribuyen al segundo aumento de la descarga. Una vez dominada la técnica, el aislamiento del nervio yeyunal y el registro inicial de la línea base pueden realizarse en menos de una hora si se realiza adecuadamente.

Se necesita más tiempo al estudiar el efecto de compuestos administrados en el baño de órganos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener un enfoque bien estandarizado, como identificar de forma consistente el mismo segmento en todos los experimentos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el aislamiento de ganglios de la raíz dorsal con posterior imagen de calcio, con el fin de evaluar qué estaciones de relevo en el sistema nervioso gastrointestinal están involucradas en la patogénesis de varias enfermedades.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la patogénesis de varios síndromes de dolor en la investigación gastrointestinal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar nervios aferentes yeyunales del tracto gastrointestinal de ratón y registrar la actividad de estos durante distensiones progresivas.