Determinación del Potencial Zeta a través de nanopartículas de translocación velocidades a través de un sintonizable nanoporos: El uso de partículas de ADN modificado como ejemplo

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la química de la superficie de las nanopartículas utilizando la detección posterior resistente sintonizable, o TRPS, y determinar el potencial zeta del material. Esto se demuestra mediante la caracterización de nanopartículas modificadas con ADN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la caracterización de nanomateriales y el desarrollo de bioensayos.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede completar el análisis partícula por partícula. Cada señal de partícula de ADN se traduce en una medición de potencial zeta, lo que proporciona una imagen completa de la muestra que se está analizando. El método más antiguo podría proporcionar información sobre la caracterización de los materiales.

También se puede aplicar a otras aplicaciones, como el desarrollo de bioensayos para la detección de células, virus, ADN y proteínas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no es fácil inyectar la lámpara y luego esperar la respuesta. Se necesita algún aporte del científico.

Para comenzar este procedimiento, se deben aplicar partículas recubiertas de estreptavidina durante 30 segundos antes de la sonicación durante dos minutos a 80 vatios para asegurar la monodispersidad. Diluya las partículas recubiertas de estreptavidina una en cien en tampón PBST para lograr una concentración resultante de una vez diez a nueve partículas por mililitro. A continuación, vórtice las partículas durante 30 segundos.

Basado en una capacidad de unión de 4.352 picomoles por miligramo a la concentración adecuada de ADN a las partículas para las concentraciones resultantes de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 y 210 nanomolares. Después de vórtice las muestras durante 10 segundos, colóquelas en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que el ADN se una a las superficies de las partículas a través de una interacción de biotina estreptavidina. Una vez que se haya agregado e incubado el ADN capturado con las partículas, elimine el exceso de ADN y la solución mediante separación magnética colocando las muestras en un estante magnético durante 30 minutos.

Después de esto, retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el grupo de partículas recién formado, más cercano al imán. A continuación, sustituya el sobrenadante por el mismo volumen de tampón PBST fresco. Ahora agregue la cantidad requerida de ADN objetivo a cada muestra para asegurarse de que se alcanzó la unión máxima posible al objetivo.

Agite las muestras durante 10 segundos. Y colóquelos en la rueda giratoria a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez completada la hibridación, elimine el exceso de ADN objetivo mediante separación magnética colocando las muestras en el estante magnético durante 30 minutos.

A continuación, retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el grupo de partículas recién formado, más cercano al imán. A continuación, sustituya el sobrenadante por el mismo volumen de tampón PBST fresco. Después de repetir los pasos anteriores para muestras duplicadas, coloque las muestras en la rueda giratoria a temperatura ambiente durante 16 horas para investigar los tiempos de hibridación del ADN.

En este punto, conecte un instrumento TRPS a un sistema informático con software en su lugar. Con pinzas, mida la distancia entre el exterior de dos mordazas paralelas. Escriba la distancia en el campo de estiramiento en la pestaña de configuración del instrumento y haga clic en calibrar estiramiento debajo de la pestaña.

A continuación, coloque lateralmente una membrana de nanoporos de poliuretano de tamaño adecuado para el análisis en las mandíbulas con el número de identificación del nanoporo hacia arriba. A continuación, estire las mordazas hasta el estiramiento requerido para el análisis utilizando el mango de ajuste de estiramiento en el lateral del instrumento. Coloque 80 microlitros de tampón PBST en la celda de fluido inferior debajo del nanoporo, asegurándose de que no haya burbujas que puedan afectar la medición.

Ahora encaje la celda de fluido superior en su lugar y agregue 40 microlitros de tampón, asegurándose de que no haya burbujas presentes. A continuación, coloque una jaula de Faraday sobre el sistema y aplique una presión externa como se describe en el protocolo de texto. Después de colocar 40 microlitros de las partículas de calibración en la celda de fluido superior, complete una medición TRPS a tres voltajes aplicados.

Modifique el voltaje haciendo clic en los botones más y menos en la escala de voltaje en la pestaña de configuración del instrumento en el software. Compruebe que los tres voltajes devuelvan las corrientes de fondo adecuadas. Y asegúrese de que en el medio voltaje, las partículas de calibración produzcan una magnitud de bloqueo promedio de al menos 0,3 nanoamperios.

Una vez que se hayan alcanzado las condiciones descritas en el protocolo de texto, inicie la ejecución haciendo clic en iniciar en el software en la pestaña de adquisición de datos. Para completar la medición, haga clic en detener en la pestaña de adquisición de datos y guarde el archivo de datos. Lave el sistema reemplazando las partículas de calibración con 40 microlitros con tampón PBST en las celdas de fluido superiores varias veces.

Y aplicando varias presiones hasta que no haya más eventos de bloqueo, asegurando que no haya partículas residuales ni contaminación cruzada. Una vez alcanzada la corriente de referencia adecuada, reemplace el electrolito en la celda de fluido superior con 40 microlitros de muestra. Inicie la ejecución de ejemplo haciendo clic en iniciar en la pestaña de adquisición de datos.

Registre un mínimo de 500 partículas y asegúrese de que el tiempo de ejecución sea de un mínimo de 30 segundos. Para completar la medición, haga clic en detener en la pestaña de adquisición de datos y guarde el archivo de datos. Aquí se muestra un ejemplo de análisis de tamaño y potencial zeta de partículas recubiertas de estreptavidina sin modificaciones y partículas recubiertas de estreptavidina saturadas con ADN monocatenario en la superficie.

Aunque ambas muestras eran de un tamaño similar, el potencial zeta era significativamente diferente y mucho mayor cuando el ADN se funcionalizaba en la superficie de la partícula. Aquí se muestran los datos de tamaño y potencial zeta exhibidos para las muestras con las concentraciones más bajas y más altas de ADN hibridado con las partículas recubiertas de estreptavidina. Se registra un valor de potencial zeta mayor para las partículas hibridadas con una mayor concentración de ADN.

Aquí se muestra el cambio en el potencial zeta medido solo para el ADN sondeado de captura, un objetivo de ADN totalmente complementario, un objetivo de ADN de unión media, un objetivo de ADN de unión final y un objetivo de ADN que sobresale. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar a fondo un nanopolo entre cada calibración y muestra para garantizar que no haya contaminación cruzada entre las muestras y evitar cualquier bloqueo de nanopolos.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los biosentidos exploraran las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN en ensayos múltiples. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener el potencial zeta usando TRPS y preparar partículas modificadas con ADN para bioensayos.