Medida de In Vitro Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de integración in vitro de complejos de preintegración, o PIC, aislados de células SupT1 infectadas por VIH-1. Este método responderá a algunas de las preguntas clave en la biología del VIH, específicamente cómo ciertos factores del huésped y factores virales, por ejemplo, la cápside viral, juegan un papel en la integración del ADN del VIH-1, y hacerlo nos ayudará a diseñar o identificar nuevos objetivos para la terapia antirretroviral. La principal ventaja de este método es que requiere una cantidad relativamente pequeña de preparación del complejo de preintegración, o PIC, para medir la actividad de integración in vitro.

Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse tanto hacia el diagnóstico como hacia la terapia del VIH-1 SIDA, y esto se debe a que las versiones anteriores de esta técnica han sido fundamentales en el descubrimiento de los inhibidores de la integrasa del VIH-1, que son uno de los principales fármacos contra el VIH en uso clínico en la actualidad, por lo que este método no sólo puede utilizarse para comprender la integración del VIH-1, sino también para comprender la integración del VIH-1. pero también se puede aplicar para estudiar otros retrovirus, como el VRS y el MLV. El Dr. Muthukumar Balasubramaniam, quien es becario postdoctoral en el laboratorio, demostrará este protocolo. Para infectar SupT1 con VIH-1, en un laboratorio BSL-2, mantenga las células SupT1 entre una y dos veces 10 a la sexta célula por mililitro en el Roswell Park Memorial Institute o en un medio RPMI suplementado con 10% de FBS y Pen-Strep.

Después de generar títulos altos de VIH-1 infeccioso de acuerdo con el protocolo de texto, agrupe las células SupT1 de los matraces de cultivo, mezcle bien mediante pipeteo y use la tinción de exclusión con azul de tripán en un hemocitómetro para determinar el recuento de células viables. Alícuota ocho veces 106 células por infección viral en tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros, luego centrifugar las células en un rotor de cubo oscilante a 500 veces g y 25 grados Celsius durante cinco minutos. Sin retirar el medio de cultivo celular, transfiera los tubos que contienen células granuladas al laboratorio BSL-3 para su posterior procesamiento, luego aspire cuidadosamente el medio del tubo sin alterar el pellet.

A continuación, agregue 30 mililitros de inóculo de virus tratado con DNasa I a las células y mezcle pipeteando suavemente, luego distribuya la mezcla uniformemente entre dos placas de cultivo de tejidos de seis pocillos. Para la espinoculación, coloque las placas de cultivo en soportes de placas y centrifugue en un rotor de cubo oscilante a 480 veces g y 25 grados Celsius durante dos horas, luego incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. Para recolectar y lisar las células infectadas, agrupe las células correspondientes a cada infección en un tubo centrífugo cónico de 50 mililitros.

Centrifugar las células a 300 veces g y 25 grados centígrados durante 10 minutos, luego aspirar o pipetear cuidadosamente el sobrenadante. Para eliminar las partículas de virus residuales, lave cada gránulo agregando dos mililitros de tampón K menos menos y vuelva a centrifugar la muestra, luego, sin alterar el gránulo, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración o con una pipeta antes de repetir el lavado una vez más. Después de eliminar cuidadosamente cualquier tampón residual con una micropipeta, utilice el tampón de lisis helado K plus plus para volver a suspender suavemente cada gránulo y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

Para preparar complejos de preintegración citoplasmática, o PIC, se agita la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se colocan los tubos en un rotor preenfriado a cuatro grados Celsius y se centrifugan a 1.500 veces g y cuatro grados Celsius durante cuatro minutos. Sin alterar el pellet, transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo y centrifuga a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante un minuto. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo, luego agregue ARNasa A hasta una concentración final de 20 microgramos por mililitro e incube el contenido a temperatura ambiente sin mecer durante 30 minutos.

Añadir sacarosa hasta una concentración final del 7% y mezclar bien pipeteando suavemente, luego preparar alícuotas de los PIC en tubos de microcentrífuga. Congele rápidamente en nitrógeno líquido y colóquelo en un congelador a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Para preparar el ADN diana utilizado en la integración in vitro o en el ensayo IVI, ensamble las mezclas de PCR para amplificar una región de 2,0 kilobases del ADN plásmido phiX174 utilizando los cebadores personalizados phiX174-Forward y phiX174-Reverse, y realice la PCR utilizando el programa de acuerdo con el protocolo de texto.

Después de purificar en gel y alícuota la muestra, agregue 600 nanogramos de ADN objetivo a 200 microlitros de PIC. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Detenga la reacción IVI agregando SDS, EDTA y proteinasa K, luego mezcle bien el contenido de la reacción e incube a 56 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, para purificar el ADN total de la reacción IVI, agregue un volumen igual de fenol a la muestra desproteinizada. Mezclar vigorosamente por vórtice y centrifugar durante dos minutos. Retire con cuidado la fase acuosa superior y transfiérala a un tubo nuevo antes de repetir la extracción con fenol, luego agregue un volumen igual de cloroformo de fenol de uno a uno.

Mezcle la muestra por vórtice y centrifugue el tubo durante dos minutos, luego transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Después de extraer con cloroformo según el protocolo de texto, precipite el ADN de la fase acuosa agregando 0,1 microgramos por microlitro de glucógeno, acetato de sodio 0,3 molar y 2,5 volúmenes de etanol 100% helado. Coloque el tubo a menos 80 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, centrifugar la muestra a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos, luego retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Para llevar a cabo la PCR para cuantificar la actividad de PIC, comience con la primera ronda de PCR convencional utilizando cebadores dirigidos al LTR viral y al ADN phiX174 para amplificar las uniones del ADN integrado del VIH-1. Reúna la mezcla maestra menos el ADN molde como se describe aquí, luego dispense 45 alícuotas de microlitros en tubos de PCR separados y agregue cinco microlitros de ADN molde o agua libre de nucleasas como control.

Ejecute la reacción en un termociclador utilizando el programa descrito en el protocolo de texto, luego realice una segunda ronda de PCR cuantitativa y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. En este ensayo IVI, los SupT1 se espinocularon con ADNasa I tratada con VIH-1 y la ausencia o presencia del inhibidor de la integrasa del VIH-1, Raltegravir. Después de la incubación, se aislaron los PIC y se analizó el ADN purificado para la integración del ADN viral.

Como se muestra aquí, los PIC del VIH-1 integran de manera robusta el ADN viral asociado en el ADN diana y la eficiencia de los PIC de IVI se redujo en gran medida en las reacciones suplementadas con Raltegravir, lo que implica fuertemente la actividad de integración medida en este ensayo con la integrasa del VIH-1. Las reacciones de control no mostraron ninguna actividad de integración. Además, el control que excluyó la polimerasa Taq en la primera ronda de PCR no amplificó los productos de integración.

En particular, los datos de los PIC solos indicaron que la estrategia de qPCR anidada midió específicamente el ADN viral integrado, pero no el ADN viral asociado a PIC. En conjunto, estos datos demuestran la actividad de integración asociada al PIC. Una vez dominado, la preparación del virus y los ensayos de PCR para cuantificar la actividad del PIC se pueden completar en una semana.

La infección de las células SupT1 y el aislamiento de las PIC de las células infectadas se pueden realizar en un día. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar los PIC del VIH-1 y medir la actividad de integración in vitro. No olvide que trabajar con títulos altos de VIH-1 infeccioso puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar las precauciones adecuadas, incluida la ropa protectora como delantales y batas, guantes dobles y gafas protectoras mientras se realiza este procedimiento.