Name: Medida de In Vitro Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende a medir la actividad de integración de complejos preintegración del VIH-1 in vitro usando extractos citoplasmáticos de células SupT1 infectadas. Este método cuantifica la integración del ADN viral para investigar factores del huésped y del virus.

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Este trabajo es apoyado en parte por subvenciones DA024558, DA30896, DA033892, y DA021471 del NIDA / NIH en un CD. También reconocemos la G12MD007586 subvención RCMI, el Vanderbilt CTSA conceder UL1RR024975, el Centro de Investigación traslacional Meharry (MeTRC) CTSA U54 subvención RR026140 de la CNRR / NIH, la MD007593 subvención U54 desde el NIMHD / NIH, y el AI110527 P30 subvención Tennessee CFAR.

1. Virus de Producción NOTA: Para generar altos títulos de VIH-1 infeccioso, transfectar la línea celular de riñón embrionario humano (HEK) 293T con un clon molecular infeccioso de VIH-1 usando un reactivo de transfección a base de dendrímero activado. Se ha observado que el método de fosfato de calcio transfección produce resultados comparables. <ol><li> En un laboratorio de bioseguridad de nivel 2 (BSL2), semilla de 3 x 10 6 293T células por placa de 10 cm en 8 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), penicilina, y estreptomicina. Cultivar las células en un incubador a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N. </li><li> El día siguiente, para la transfección de células en cada placa de 10 cm, diluir 8 g de plásmido ADN pNL4-3 (ver Tabla de Materiales) a un volumen final de 300 l de DMEM carente de suero y antibióticos. Añadir 80 l de la reactivo de transfección, mezclar bien pipeteando, y se incuba a TA durante5-10 min para la formación de complejos de transfección. </li><li> Retire el medio de las placas por aspiración y 7 ml por placa de DMEM fresco que contenía suero y antibióticos. </li><li> Añadir 1 ml de DMEM que contenía suero y antibióticos para el complejo de transfección, mezclar con la pipeta, y añadir esta mezcla a las células. Hacer girar suavemente el plato para facilitar la distribución uniforme de los complejos de transfección. </li><li> Inmediatamente transferir las células al laboratorio BSL3, lugar en un incubador a 37 ° C y 5% de CO 2, y cultivar las células durante 48 h. </li><li> Recoger el sobrenadante de cultivo de tejidos que contiene el virus con una pipeta y luego transferirlo a un tubo de centrífuga. Se centrifuga a 300 g durante 5 min para sedimentar las células y los residuos, y después se filtra el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras de tamaño de poro. </li><li> Para eliminar cualquier ADN plásmido remanente en esta preparación de virus libre de células, el tratamiento con DNasa 1 (20 mg / ml) a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Para cuantificar laVIH-1 título, utilice el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas p24-específico (ELISA), ya que es un método rápido y susceptible para el uso rutinario 22. NOTA: Se debe señalar que la p24 ELISA mide el título físico (número de partículas de virus). Como alternativa, la medición de la actividad asociada al virus RT (RT ensayo exógena) o la infectividad del virus (ensayos de infectividad basados ​​en la línea celular indicadora TZM-bl) proporcionará lectura exclusiva de partículas virales infecciosas. </li></ol> 2. infección por el virus de las células Sup-T1 (NBS3 Lab) <ol><li> En un laboratorio BSL2, mantener las células Sup-T1 entre 1,0 x 10 6 y 2,0 x 10 6 células / ml en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementado con 10% FBS inactivado por calor, penicilina y estreptomicina (relación de división de 1 : 2 cada 2 - 3 d). Se combinan las células Sup-T1 a partir de los frascos de cultivo, mezclar bien con la pipeta, y determinar el recuento de células viables utilizando un hemocitómetro y la exclusión de azul de tripano staining método. <ol><li> Prepare el número necesario de alícuotas de 80 x 10 6 células (por infección por el virus) en 50 ml tubos cónicos de centrífuga. </li><li> Centrifugar las células en un rotor oscilante-cubo en 500 xg y 25 ° C durante 5 min. Sin retirar el medio de cultivo celular, la transferencia de los tubos que contienen células sedimentadas al laboratorio BSL3 para su posterior procesamiento. aspirar cuidadosamente el medio de cultivo celular a partir de tubo sin alterar el sedimento celular. </li></ol></li><li> Añadir una cantidad apropiada de inóculo de virus tratado con DNasa I a las células en el tubo y mezclar bien pipeteando suavemente. Durante 80 x 10 6 células, utilizar 30 ml de virus tratado con DNasa I (50 g de virus de la p24-equivalente). NOTA: El aislamiento de PICs funcional requiere la infección de las células diana con muy altas multiplicidades de infección (MOI). </li><li> Distribuir la mezcla en partes iguales entre dos placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (es decir, 12 x alícuotas de 2.5 mL, el uso de 2 planchas por Infection). </li><li> Para espinoculación, colocar las placas de cultivo en portadores de placas y de centrífuga usando un rotor de cubeta oscilante a 480 xg y 25 ° C durante 2 h. </li><li> Se incuban las células spinoculated a 37 ° C y 5% de CO2 durante 5 h. </li></ol> 3. La recolección y lisis de las células infectadas (laboratorio NBS3) <ol><li> Reunir las células correspondientes a cada infección de las placas de cultivo en un tubo de 50 ml de centrífuga cónico (~ 30 ml en total). </li><li> Recoger las células por centrifugación a 300 xg y 25 ° C durante 10 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante del tubo (alternativamente, utilizar una pipeta). </li><li> Para eliminar las partículas virales residuales, lavar cada sedimento celular mediante la adición de 2 ml de tampón de K - / - (KCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,6, 5 mM MgCl 2) y centrifugando la muestra a 300 xg y 25 ° C durante 10 minutos. Entonces, sin alterar el sedimento, retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración o mediante el uso de una pipeta. </li><li> REPEAt paso 3.3. </li><li> Con cuidado, retire cualquier tampón residual mediante el uso de una micropipeta. Resuspender cada sedimento de células en 2 ml de helado de tampón de lisis K + / + (tampón K - / - suplementado con 0,025% de digitonina, DTT 1 mM, 20 mg / ml de aprotinina), mezclar el contenido por pipeteo suave, y la transfiere a una 2 ml tubo de microcentrífuga. </li></ol> 4. Preparación de los PIC citoplasmáticos (laboratorio NBS3) <ol><li> Roca las muestras en un agitador rotatorio a TA durante 10 min. </li><li> Centrifugar las muestras, con el rotor enfriado previamente a 4 ° C, a 1500 xg y 4 ° C durante 4 min. </li><li> Sin perturbar el sedimento, transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo y se centrifuga a 16.000 xg y 4 ° C durante 1 min. </li><li> transferir con cuidado el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Añadir RNasa A (20 mg / ml) a una concentración final de 20 mg / ml (2 l durante 2 ml de PICs) y se incuba el contenido a temperatura ambiente durante 30 min (sin balanceo). &lt;/ Li&gt; <li> Añadir sacarosa (60% w / v en tampón K - / -) a una concentración final de 7% y mezclar bien pipeteando suavemente. Preparar alícuotas (por ejemplo, 200 l) de los PICs en tubos de microcentrífuga, flash-congelación en nitrógeno líquido, y colocar en un congelador -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 5. Integración In Vitro (IVI) ensayos que utilizan VIH-1 PICs <ol><li> Preparar el ADN diana usado en el ensayo IVI mediante la amplificación de una región de 2,0 kb a partir del plásmido de ADN phiX174 con PCR usando los cebadores a medida, phiX174-F y phiX174-R. <ol><li> Montar la mezcla de PCR como se describe en la Tabla 1. Realizar PCR en un ciclador térmico usando las condiciones de ciclos térmicos recomendados en la Tabla 2. Gel-purificar el producto de la PCR usando un kit de purificación en gel (siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante), y almacenar el ADN diana purificada como alícuotas a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Añadir 600 ng de ADN diana de 200 - &amp; #181; L alícuota de los PIC, se mezcla bien y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos. Nota: Las reacciones IVI omitiendo ADN diana o incluyendo un inhibidor de la integrasa (por ejemplo, raltegravir) se recomiendan las reacciones de control. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de IVI SDS, EDTA y proteinasa K a concentraciones finales de 0,5%, 8 mM, y 0,5 mg / ml, respectivamente. Mezclar los contenidos de la reacción a fondo y incubar durante la noche a 56 ° C. </li><li> El día siguiente, purificar el ADN total de la reacción IVI mediante extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol. Llevar a cabo todas las etapas de centrifugación a 16.000 xg y RT. </li><li> Añadir un volumen igual de fenol a la muestra desproteinizado, mezclar vigorosamente por agitación, y se centrifuga durante 2 min. Retire cuidadosamente la fase acuosa superior y la transfiere a un tubo nuevo. </li><li> Repita el paso 5.5. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. </li><li> Añadir un volumen igual de 1: 1 de fenol: cloroformo mezcla, mezclar enérgicamente con el vórtex y centrifugar for 2 min. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. </li><li> Añadir un volumen igual de cloroformo, la mezcla vigorosamente por agitación, y se centrifuga durante 2 min. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. </li><li> Para precipitar el ADN, añadir glucógeno a una concentración final de 0,1 g / l, 3 M de acetato de sodio a una concentración final de 0,3 M, y 2,5 volúmenes de etanol al 100% (enfriado en hielo). Mezclar en vórtex, centrifugar brevemente para recoger el contenido, y colocar el tubo a -80 ° CO / N. </li><li> Al día siguiente, centrifugar la muestra durante 30 min a 16.000 xg y 4 ° C durante 30 min. Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Añadir 500 l de etanol al 80% (enfriado en hielo) al sedimento y se centrifuga a 16.000 xg y 4 ° C durante 10 min. El aire seco de la pastilla de ADN a temperatura ambiente y completamente volver a suspender en 50 l de agua libre de nucleasa. Almacenar las muestras de ADN a -20 ° C. </li></ol> 6. Las pruebas de PCR para cuantificar la actividad de CFP <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; NOTA: El número de copias de VIH-1 de ADN integrado en el ADN diana se cuantifica mediante una estrategia de PCR anidada que emplea 2 juegos de cebadores y 2 rondas secuenciales de PCR. <ol><li> Realizar la primera ronda de PCR convencional utilizando cebadores dirigidos a la LTR viral y el ADN phiX174 (LTR y PhiX174 cebadores, respectivamente) para amplificar las uniones del VIH-1 de ADN integrado. <ol><li> Montar la mezcla de PCR de primera ronda como se describe en la Tabla 3. Montar una mezcla maestra de todos los componentes excluyendo el ADN molde, dispensar alícuotas de 45 mu l en tubos de PCR separadas, y añadir 5 l de ADN plantilla o agua libre de nucleasa (control). </li><li> Realizar PCR en un ciclador térmico usando las condiciones de ciclos térmicos recomendados en la Tabla 4. </li></ol></li><li> Realice la qPCR segunda ronda usando cebadores que flanquean una región corta de la LTR viral (LTR-R y cebadores LTR-U) para amplificar selectivamente las secuencias vDNA integrados de la primera rodadaproductos und PCR. Para determinar los ADNv integrados número de copias, generar una curva estándar mediante el uso de 10x diluciones seriadas de número de copias conocidos (por ejemplo, 10 0 - 10 8) del clon molecular del VIH-1. <ol><li> Montar la mezcla de segunda ronda qPCR como se describe en la Tabla 5. Montar una mezcla maestra de todos los componentes excluyendo el ADN molde, cuidadosamente dispensar 25 alícuotas en el número apropiado de pozos en un pozo de 96 placa de reacción de PCR, y luego añadir 5 l de la no purificado de primera ronda de los productos de PCR o agua libre de nucleasa (controlar). Llevar a cabo todas las reacciones de qPCR por triplicado. </li><li> Cargar la placa de PCR en tiempo real instrumento de PCR y qPCR realizar utilizando las condiciones de los ciclos recomendados en la Tabla 6. </li><li> Analizar los datos utilizando un software adecuado. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran no tener intereses financieros y no financieros en competencia.

Los análisis bioquímicos de los PIC retrovirales han proporcionado ideas fundamentales sobre el mecanismo de integración del ADN retroviral. Medición de la actividad de integración de PICs retrovirales se puede lograr mediante ensayo en placa formación, análisis de transferencia Southern, y anidada qPCR. La estrategia experimental de ensayo de placas es laborioso y utiliza un método indirecto para medir la integración 6, 7, 18....

VIH-1 de replicación en la célula diana implica varios pasos, en términos generales, agrupadas en dos fases: eventos tempranos y tardíos. Los primeros eventos comienzan cuando el VIH-1 secuencialmente une a la superficie de la célula diana receptor CD4 y uno de los dos co-receptores (CCR5 o CXCR4) 1. En consecuencia, el fusible membranas virus-célula, y la cápside viral (CA) de núcleo se libera en el citoplasma 2. El núcleo CA contiene el ARN viral genómico de cadena sencilla (ssRNA) y varias proteínas, tanto virales y celulares de origen. Las proteínas virales CA-asociados incluyen la transcriptasa inversa (RT) y la integrasa (IN), dos enzimas que median pasos críticos durante los primeros eventos en la replicación viral. El RT y EN la función en el contexto de complejos de nucleoproteína, a saber, la transcripción inversa Complex (RTC) y el complejo de pre-integración (PIC), respectivamente 3, 4, 5 &lt;sup&gt;, 6. Los extremos del genoma viral de ARN de cadena simple terminal del puerto de repetición (R) elementos adyacentes a la U5 secuencias únicas (en el extremo 5 &#39;) y U3 (en el extremo 3&#39;). El RTC convierte el genoma ARN de cadena simple viral en un (ds) de copias de ADN de doble cadena (ADNv). Este proceso de transcripción inversa también da lugar a la duplicación de las secuencias U5 y U3, generando así repeticiones terminales largas (LTR) en ambos extremos de la ADNv 7, 8. Posteriormente, el IN PIC-asociado cataliza dos reacciones bioquímicas secuenciales que permiten la integración de la ADNv en el cromosoma huésped 9, 10, 11. En primer lugar, en el citoplasma, IN multímeros participar ambas LTRs 12 y escindir un dinucleótido de cada uno de los extremos 3&#39;-terminales. Este procesamiento extremo 3 &#39;genera un grupo hidroxilo en cada extremo 3&#39; (CA OH) de la ADNv.A continuación, PIC trafica al núcleo, en el que en el ADNv utiliza CA OH como nucleófilo para cortar ambas cadenas del ADN cromosómico de una manera escalonada. Simultáneamente, en empalmes coordinadamente ambos extremos del ADNv a los enlaces fosfodiéster resultantes en cadenas opuestas del ADN cromosómico. Después de esta etapa de transferencia de cadena, la maquinaria de la célula huésped elimina los dos nucleótidos no apareados en los extremos 5 &#39;de la vDNA y reparaciones de las brechas de cadena sencilla consiguientes en la unión del sitio de integración. Así, los primeros eventos culminan con la creación de una copia de ADN integrado (provirus) del genoma del VIH-1. El provirus proporciona un entorno adecuado para la expresión génica viral eficiente, que inicia los eventos posteriores, incluyendo la expresión de las proteínas codificadas por el virus; ensamblaje del virus inmaduro; y en ciernes, la liberación y la maduración en viriones infecciosos 13. Retroviral recombinante purificada EN es competente parallevar a cabo, in vitro, tanto en las actividades de procesamiento y el capítulo de transferencia del extremo 3 &#39;de ADN exógena suministrados sustrato LTR-similares. Los estudios bioquímicos utilizando dicha purificado en recombinante han puesto de manifiesto los aspectos críticos de la integración ADNv 14, 15, 16, 17. Sin embargo, a diferencia de la infección natural, esta reacción bioquímica in vitro no es compatible con la integración concertada de ambos extremos del sustrato de ADN en el ADN objetivo. Por el contrario, PICs retrovirales aisladas de células infectadas de forma aguda se integran concertada ambos extremos de la ADNv endógeno en el ADN diana heterólogo. Esto condujo a la adopción generalizada y posteriores refinamientos de ensayos in vitro de Integración (IVI) E n el uso de los PIC nativas aisladas. En la primera informado ensayo retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas con un recombinante murinoVirus de la leucemia (MLV) que alberga el gen E. coli supF en su LTR sirvió como la fuente de la actividad de IN, y el ADN de un fago lambda mutante defectuoso en el crecimiento lítico fue suministrado exógenamente como el ADN diana. La integración exitosa del ADN recombinante MLV copia en el ADN del fago y la consiguiente p F expresión condujo a la restauración de la capacidad formadora de placa de los fagos recombinantes. Sin embargo, esta estrategia experimental es laborioso y medidas de integración de una manera indirecta. Para hacer frente a estas advertencias, un ensayo de marcaje terminal indirecto basado en la transferencia de Southern, que cuantifica la actividad IVI PIC-asociado como una medida de la ADNv endógeno integrado en el ADN exógeno phiX174 bacteriófago linealizado, se desarrolló 6, 7, 18. Aunque este método proporciona una medida directa de eventos de integración, se requieren cantidades relativamente altas de preparación PIC, que sigue siendo un desafío técnicoesfuerzo. Para evitar esto, ensayos basados en PCR anidados que requieren sólo cantidades modestas de PICs se desarrollaron 4, 5, 19. En este informe se describe una versión actualizada de una PCR anidada-basado en el método in vitro ideado para recapitular la actividad de integración mediada PIC VIH-1 se produce durante la infección natural. Este método utiliza los extractos citoplasmáticos de las células diana infectadas por VIH-1 como fuente de actividad endógena PIC, que se mide con un tiempo real de la polimerasa cuantitativa reacción en cadena (qPCR). Los procedimientos para el aislamiento de los PIC y la medición de sus actividades de integración se adaptan, con modificaciones, a partir de los protocolos publicados por el laboratorio Engelman 20. En este método, la actividad de integración PIC-asociado se inicia proporcionando una diana de ADN exógeno lineal 21, y los productos de ADN resultantes deesta reacción integración se purifican y se utiliza como material de partida para la cuantificación basada en la PCR subsiguiente. En la primera ronda de PCR convencional, las uniones de ADN viral diana se amplifican mediante el uso de cebadores apropiados. En la segunda ronda qPCR, cebadores LTR-específicos se utilizan para enriquecer específicamente a la población a partir de los vDNA primera ronda productos de PCR. Por favor, vea la sección de protocolo para una descripción detallada de este método. Los estudios in vitro con PICs retrovirales han dado lugar a avances significativos en nuestra comprensión del mecanismo de integración del ADN retroviral y en el desarrollo de inhibidores de la IN. Sobre la base de la reciente mayor enfoque en la cartografía del VIH-1 sitios de integración, la determinación del papel de los factores virales y del huésped en el VIH-1 la integración y desarrollo de nuevos fármacos antivirales para combatir la resistencia a los medicamentos, prevemos un aumento del interés y el uso generalizado de los ensayos de IVI , como el descrito en este informe. Esto, a su vez, dará lugar afuturas mejoras en el método, diversificando de esta manera el alcance de sus aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio 1640 </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de penicilina-estreptomicina (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> células HEK293T (293T) </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> clon molecular proviral del VIH-1 pNL4-3 </td><td> Programa de Reactivos de Investigación y Referencia del SIDA de los NIH </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo de transfección PolyFect </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNasa 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1 cells</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.2 - 7.5 (solución lista para usar)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de cloruro de potasio (KCl) </td><td> Sigma-Aldrich< </td><td> p>60142 </td><td></td></tr><tr><td> <solución de cloruro de magnesio (MgCl>2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinina </td><td> Sigma-Aldrich <8/p> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 Forma replicativa 1 ADN </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F imprimación: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R cebador: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen y/o IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA Polymerase </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick kit de extracción de gel </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> Agua destilada ultrapura </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>tampón Tris-EDTA (TE) (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético, solución de sal disódica (EDTA), 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K (20 mg/ml solución lista para usar)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol (equilibrado con 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0 y 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno (solución de 5 mg/mL)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio (3 M, pH 5.2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>Primera ronda LTR primer: 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' Primera ronda phiX174 primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen y/o IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>Segunda ronda LTR-R primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Segunda ronda LTR-U cebador: 5'-CTGACTAAAAAGGGTCTGAGG-3' Segunda ronda de la sonda Taqman: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen y/o IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

medida de in vitro integración actividad del vih-1 preintegration complejos

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

proteínas del VIH-1 del sobre se involucran receptores afines en la superficie de células diana, lo que conduce a la fusión de membranas de células viral seguido por la liberación del núcleo de la cápside viral (CA) en el citoplasma. Posteriormente, el viral transcriptasa inversa (RT), como parte de un complejo de nucleoproteína homónimo denomina la transcripción inversa Complex (RTC), convierte el genoma de ARN de una sola hebra viral en una copia de ADN de doble cadena (ADNv). Esto conduce a la biogénesis de otro complejo de nucleoproteína, llamado el complejo de pre-integración (PIC), compuesto por el vDNA y proteínas del virus asociados y los factores del huésped. La integrasa viral PIC-asociado (IN) orquesta la integración del ADNv en el ADN cromosómico del huésped en un proceso de dos pasos regulado temporal y espacialmente. En primer lugar, en los procesos de la los extremos 3 &#39;de la ADNv en el citoplasma y, segundo, después de que el PIC trafica al núcleo, que media la integración del ADNv procesado en el ADN cromosómico. Los PIC aisladosde las células diana infectadas de forma aguda con VIH-1 son funcionales in vitro, ya que son competentes para integrar el ADNv asociado en un ADN diana heterólogo añadido exógenamente. Tal integración en ensayos in vitro basados en PIC han contribuido significativamente a delinear los detalles de la mecánica de la integración retroviral y para el descubrimiento de inhibidores de la IN. En este informe, se elabora sobre un ensayo de VIH-1 PIC actualizada que emplea una estrategia basada en anidada en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para medir la actividad de integración in vitro de los PIC nativas aisladas.

Aislamiento de VIH-1 PICs Un esquema del protocolo utilizado para el aislamiento de VIH-1 fotografías de células Sup-T1 infectadas de forma aguda se representa en la Figura 1. Este protocolo se deriva de los métodos descritos por Engelman et al. 19, 20. VIH-1 PICs son complejos de nucleoproteína que se ensamblan en las células...

Este informe describe un ensayo in vitro para medir la actividad de integración asociada al complejo de preintegración (PIC) del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en los extractos citoplasmáticos de células infectadas agudamente. La integración del ADN del VIH-1 asociado a PIC en el ADN diana heterólogo se cuantifica mediante el uso de una estrategia de reacción en cadena de la polimerasa anidada en tiempo real.

Medida de In Vitro Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de integración in vitro de complejos de preintegración, o PIC, aislados de células SupT1 infectadas por VIH-1. Este método responderá a algunas de las preguntas clave en la biología del VIH, específicamente cómo ciertos factores del huésped y factores virales, por ejemplo, la cápside viral, juegan un papel en la integración del ADN del VIH-1, y hacerlo nos ayudará a diseñar o identificar nuevos objetivos para la terapia antirretroviral. La principal ventaja de este método es que requiere una cantidad relativamente pequeña de preparación del complejo de preintegración, o PIC, para medir la actividad de integración in vitro.Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse tanto hacia el diagnóstico como hacia la terapia del VIH-1 SIDA, y esto se debe a que las versiones anteriores de esta técnica han sido fundamentales en el descubrimiento de los inhibidores de la integrasa del VIH-1, que son uno de los principales fármacos contra el VIH en uso clínico en la actualidad, por lo que este método no sólo puede utilizarse para comprender la integración del VIH-1, sino también para comprender la integración del VIH-1. pero también se puede aplicar para estudiar otros retrovirus, como el VRS y el MLV. El Dr. Muthukumar Balasubramaniam, quien es becario postdoctoral en el laboratorio, demostrará este protocolo. Para infectar SupT1 con VIH-1, en un laboratorio BSL-2, mantenga las células SupT1 entre una y dos veces 10 a la sexta célula por mililitro en el Roswell Park Memorial Institute o en un medio RPMI suplementado con 10% de FBS y Pen-Strep.Después de generar títulos altos de VIH-1 infeccioso de acuerdo con el protocolo de texto, agrupe las células SupT1 de los matraces de cultivo, mezcle bien mediante pipeteo y use la tinción de exclusión con azul de tripán en un hemocitómetro para determinar el recuento de células viables. Alícuota ocho veces 106 células por infección viral en tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros, luego centrifugar las células en un rotor de cubo oscilante a 500 veces g y 25 grados Celsius durante cinco minutos. Sin retirar el medio de cultivo celular, transfiera los tubos que contienen células granuladas al laboratorio BSL-3 para su posterior procesamiento, luego aspire cuidadosamente el medio del tubo sin alterar el pellet.A continuación, agregue 30 mililitros de inóculo de virus tratado con DNasa I a las células y mezcle pipeteando suavemente, luego distribuya la mezcla uniformemente entre dos placas de cultivo de tejidos de seis pocillos. Para la espinoculación, coloque las placas de cultivo en soportes de placas y centrifugue en un rotor de cubo oscilante a 480 veces g y 25 grados Celsius durante dos horas, luego incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. Para recolectar y lisar las células infectadas, agrupe las células correspondientes a cada infección en un tubo centrífugo cónico de 50 mililitros.Centrifugar las células a 300 veces g y 25 grados centígrados durante 10 minutos, luego aspirar o pipetear cuidadosamente el sobrenadante. Para eliminar las partículas de virus residuales, lave cada gránulo agregando dos mililitros de tampón K menos menos y vuelva a centrifugar la muestra, luego, sin alterar el gránulo, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración o con una pipeta antes de repetir el lavado una vez más. Después de eliminar cuidadosamente cualquier tampón residual con una micropipeta, utilice el tampón de lisis helado K plus plus para volver a suspender suavemente cada gránulo y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.Para preparar complejos de preintegración citoplasmática, o PIC, se agita la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se colocan los tubos en un rotor preenfriado a cuatro grados Celsius y se centrifugan a 1.500 veces g y cuatro grados Celsius durante cuatro minutos. Sin alterar el pellet, transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo y centrifuga a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante un minuto. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo, luego agregue ARNasa A hasta una concentración final de 20 microgramos por mililitro e incube el contenido a temperatura ambiente sin mecer durante 30 minutos.Añadir sacarosa hasta una concentración final del 7% y mezclar bien pipeteando suavemente, luego preparar alícuotas de los PIC en tubos de microcentrífuga. Congele rápidamente en nitrógeno líquido y colóquelo en un congelador a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Para preparar el ADN diana utilizado en la integración in vitro o en el ensayo IVI, ensamble las mezclas de PCR para amplificar una región de 2,0 kilobases del ADN plásmido phiX174 utilizando los cebadores personalizados phiX174-Forward y phiX174-Reverse, y realice la PCR utilizando el programa de acuerdo con el protocolo de texto.Después de purificar en gel y alícuota la muestra, agregue 600 nanogramos de ADN objetivo a 200 microlitros de PIC. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Detenga la reacción IVI agregando SDS, EDTA y proteinasa K, luego mezcle bien el contenido de la reacción e incube a 56 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, para purificar el ADN total de la reacción IVI, agregue un volumen igual de fenol a la muestra desproteinizada. Mezclar vigorosamente por vórtice y centrifugar durante dos minutos. Retire con cuidado la fase acuosa superior y transfiérala a un tubo nuevo antes de repetir la extracción con fenol, luego agregue un volumen igual de cloroformo de fenol de uno a uno.Mezcle la muestra por vórtice y centrifugue el tubo durante dos minutos, luego transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Después de extraer con cloroformo según el protocolo de texto, precipite el ADN de la fase acuosa agregando 0,1 microgramos por microlitro de glucógeno, acetato de sodio 0,3 molar y 2,5 volúmenes de etanol 100% helado. Coloque el tubo a menos 80 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, centrifugar la muestra a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos, luego retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Para llevar a cabo la PCR para cuantificar la actividad de PIC, comience con la primera ronda de PCR convencional utilizando cebadores dirigidos al LTR viral y al ADN phiX174 para amplificar las uniones del ADN integrado del VIH-1. Reúna la mezcla maestra menos el ADN molde como se describe aquí, luego dispense 45 alícuotas de microlitros en tubos de PCR separados y agregue cinco microlitros de ADN molde o agua libre de nucleasas como control.Ejecute la reacción en un termociclador utilizando el programa descrito en el protocolo de texto, luego realice una segunda ronda de PCR cuantitativa y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. En este ensayo IVI, los SupT1 se espinocularon con ADNasa I tratada con VIH-1 y la ausencia o presencia del inhibidor de la integrasa del VIH-1, Raltegravir. Después de la incubación, se aislaron los PIC y se analizó el ADN purificado para la integración del ADN viral.Como se muestra aquí, los PIC del VIH-1 integran de manera robusta el ADN viral asociado en el ADN diana y la eficiencia de los PIC de IVI se redujo en gran medida en las reacciones suplementadas con Raltegravir, lo que implica fuertemente la actividad de integración medida en este ensayo con la integrasa del VIH-1. Las reacciones de control no mostraron ninguna actividad de integración. Además, el control que excluyó la polimerasa Taq en la primera ronda de PCR no amplificó los productos de integración.En particular, los datos de los PIC solos indicaron que la estrategia de qPCR anidada midió específicamente el ADN viral integrado, pero no el ADN viral asociado a PIC. En conjunto, estos datos demuestran la actividad de integración asociada al PIC. Una vez dominado, la preparación del virus y los ensayos de PCR para cuantificar la actividad del PIC se pueden completar en una semana.La infección de las células SupT1 y el aislamiento de las PIC de las células infectadas se pueden realizar en un día. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar los PIC del VIH-1 y medir la actividad de integración in vitro. No olvide que trabajar con títulos altos de VIH-1 infeccioso puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar las precauciones adecuadas, incluida la ropa protectora como delantales y batas, guantes dobles y gafas protectoras mientras se realiza este procedimiento.

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Uncoating es un paso esencial en la fase temprana del ciclo de vida del VIH-1 y se define como el desmontaje de la cápside y la liberación de los complejos de ribonucleoproteína viral (vRNP). En este sentido, demostrar las técnicas para el aislamiento de los núcleos intactos del VIH-1 viriones y cuantificar sus...

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Este video muestra el ensayo de fosfatasa alcalina embrionaria secretada utilizando células reporteras de interferón-α/β HEK-Blue para cuantificar los interferones de tipo I (IFN) liberados después de la estimulación de las células dendríticas plasmocitoides por las células T CD4+ infectadas por el VIH-1.

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Comprender las conformaciones de los antígenos de superficie viral es necesario para evaluar la neutralización de anticuerpos y guiar el diseño de inmunógenos de vacunas efectivos. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de la trimérica VIH-1 Env expresada en la superficie de las células transfectadas por anticuerpos anti-Env específicos.

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Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

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Infección de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ex vivo proporciona un valioso modelo 3D de la patogenesia virus. Aquí, describimos un protocolo e infectar a los especímenes del tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa genital femenina con HIV-1 y mantener en la cultura en la interfase líquido-aire.

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Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

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Medida de In Vitro Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

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