Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

El objetivo general de este procedimiento es aprovechar el control de calidad del plegamiento de la vía de translocación de arginina gemela para diseñar la unión de fragmentos de anticuerpos y el plegamiento intracelular en un solo paso, lo que tendrá aplicaciones en la ingeniería de anticuerpos para funcionar intracelularmente. Este método puede ayudar a superar desafíos clave en el campo de la ingeniería de anticuerpos, como superar la dificultad de diseñar anticuerpos para plegarse y funcionar correctamente en el entorno citoplasmático reductor. Solo los anticuerpos que se pliegan bien en el citoplasma se muestran y se analizan para su unión.

Proporciona una ventaja sobre la visualización de levaduras y fagos, que dependen de las vías de secreción para su visualización. Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia de enfermedades neurodegenerativas, cáncer e infecciones virales, ya que estas enfermedades involucran una patogénesis intracelular que podría ser atacada por anticuerpos. La demostración visual de este método es fundamental porque comprender cómo generar y trabajar con esferoplastos es un desafío.

Después de fusionar la biblioteca scFv con la secuencia de señal ssTorA y hacerla crecer a 37 grados Celsius con agitación durante tres horas, permita la expresión de la biblioteca scFv a 20 grados Celsius y 225 rpm durante la noche durante 15 a 22 horas. Después de la incubación, use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica a 600 nanómetros. A continuación, centrifugar el volumen calculado de cultivo inducido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a 12.000 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante y utilice 100 microlitros de tampón de fraccionamiento helado o fB para resuspender los pellets. A continuación, centrifugar las muestras a 12.000 veces g y a temperatura ambiente durante un minuto. Después de eliminar el sobrenadante, use 350 microlitros de fB helado suplementado con 3,5 microlitros de 10 miligramos por mililitro de lisozima para resuspender los gránulos.

A continuación, mientras se agitan lentamente los tubos, agregue gota a gota 700 microlitros de EDTA 1 milimolar y luego incube los tubos en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos para mezclar las muestras. Retire los tubos del rotor. Agregue 50 microlitros de MgCl2 molar punto cinco molares helado a cada tubo e incube en hielo durante 10 minutos.

A continuación, centrifugar las muestras a 11.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Ahora, con una micropipeta y una punta de un mililitro, extraiga lentamente una porción del pellet. A continuación, mientras sujeta el tubo, en ángulo con la abertura directamente encima de un nuevo tubo de 1,5 mililitros, levante lentamente la punta de la pipeta para sacarla del sobrenadante y deslice el gránulo en el nuevo tubo.

Después de eliminar el exceso de sobrenadante, use un mililitro de PBS helado para resuspender los esferoplastos. Los esferoplastos deben resuspenderse por completo antes del panoplastio, ya que los scFv no vinculantes presentes en los agregados darán lugar a falsos positivos del panoramizado. Después de biotinilar el antígeno diana de acuerdo con el protocolo de texto, vuelva a suspender las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en su vial original.

Luego transfiera de siete a 10 veces 10 a la novena cuentas a un tubo de 1,5 mililitros. Coloque el tubo de cuentas en la rejilla magnética durante dos minutos para recoger las cuentas en el costado del tubo y pipetear para eliminar con cuidado el sobrenadante. Retire el tubo del imán y use PBS para volver a suspender las cuentas sin generar burbujas.

A continuación, vuelva a colocar el tubo en el imán y retire el tampón antes de lavar las perlas dos veces más con PBS. Agregue un mililitro de lisado que contenga el antígeno biotinilado a las perlas e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira suavemente. Después de la incubación, use PBS con 1%BSA para lavar las perlas cinco veces.

A continuación, utilice PBS con 1%BSA para volver a suspender las cuentas. Para examinar la biblioteca de scFv, comience agregando cuatro veces 10 a los esferoplastos 9 y ocho veces 10 a las perlas 8 a un tubo estéril de 15 mililitros. Agregue un x PBS con 1%BSA para llevar el volumen total a cuatro mililitros.

A continuación, alícuota de la solución en cuatro tubos de 1,5 mililitros de un mililitro cada uno e incubar las reacciones a cuatro grados centígrados girando suavemente durante cinco horas. Para preparar los esferoplastos unidos a perlas para la PCR, coloque los tubos de reacción de paneo en el imán durante tres minutos. Retire el sobrenadante y lave las perlas con un x PBS con 1%BSA cuatro veces como antes.

A continuación, utilice 25 microlitros de ddH20 por tubo para resuspender las perlas. Como se describe en el protocolo de texto, realice la PCR de plásmido completo para amplificar los genes de scFvs unidos a perlas y, a continuación, recircularice el plásmido a partir del producto de PCR. Transforme toda la reacción en celdas ecualizadas MC4100 de acuerdo con el protocolo de texto.

Para identificar clones usando ELISA, descongele un tubo de la subbiblioteca panorámico y la placa en placas de agar LB. Agregue 200 microlitros de LB con 20 microgramos por mililitro de cloranfenicol en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo. Con una punta de pipeta, elija una colonia individual de la placa de agar.

A continuación, coloque la punta en el primer pocillo de la placa de 96 pocillos y revuelva suavemente para inocular. Continúe inocular una colonia en cada pozo. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas en un agitador de microplacas.

Después de preparar una solución de recubrimiento de antígeno objetivo de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 50 microlitros de la solución a cada pocillo de una placa ELISA de poliestireno transparente de alta unión de 96 pocillos. Incubar las placas a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, replique las colonias de las placas de cultivo de 96 pocillos en placas de agar de acuerdo con el protocolo de texto.

A continuación, vacíe la solución de recubrimiento de las placas ELISA y añada a cada pocillo 100 microlitros de solución de bloqueo preparada según el protocolo de texto. Incubar a temperatura ambiente durante al menos dos horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Agregue 20 microlitros de un detergente concentrado para lisis celular a cada pocillo de la placa de cultivo de fondo redondo e incube la placa de cultivo en un agitador de microplacas a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos.

Vacíe la solución de bloqueo de las placas ELISA y lave los pocillos cuatro veces con 200 microlitros de tampón de lavado preparado de acuerdo con el protocolo de texto. Después de retirar el lavado final, transfiera 50 microlitros de cada pocillo de la placa de lisis celular al pocillo correspondiente de la placa ELISA. Incube las placas a temperatura ambiente durante una o dos horas.

Proceda a vaciar las muestras de la placa ELISA y lave los pocillos cuatro veces. A continuación, prepare la solución de anticuerpos para detectar scFvs de acuerdo con el protocolo de texto. Agregue 50 microlitros del anticuerpo a cada pocillo e incube durante una o dos horas a temperatura ambiente.

Lave las placas ELISA cuatro veces con tampón de lavado antes de agregar 200 microlitros por pocillo de sustrato HRP preparado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Incube las placas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Para apagar la reacción, agregue 50 microlitros de H2SO4 molar a cada pocillo y pipetee suavemente para mezclar la solución.

Finalmente, mida la absorbancia usando una lectura de placa a 492 nanómetros. En este experimento, se utilizaron los anticuerpos scFv13 y scFv13. R4 se fusionaron a la secuencia nativa de ssTorA o a un ssTorA modificado que no es reconocido por la vía de translocación de arginina gemela, también llamada vía Tat.

R4 se pliega bien y se expresa en la membrana interna cuando se infunde a ssTorA nativo. ScFv13 no se pliega bien y no se muestra en la membrana interna, independientemente del péptido señal Tat al que se fusione. Estos resultados demuestran que solo las proteínas que contienen el péptido señal Tat y están correctamente plegadas en el citoplasma se muestran en la membrana interna, lo que permite que la vía Tat funcione como una pantalla para el plegamiento intracelular.

En este experimento, una biblioteca de PCR propensa a errores basada en scFv13, que tiene un bajo nivel de afinidad de unión a la beta-galactosidasa, se comparó con la beta-gal. ScFv 1-4 fue aislado y mostró una mayor afinidad de unión a beta-gal que scFv13, así como un mayor nivel de solubilidad citoplasmática. Utilizando scFv 1-4 como competidor contra la biblioteca scFv 1-4 de segunda generación, scFv 2-1 y 2-3 se aislaron y demostraron afinidades de unión aún mayores para beta-gal que scFv13 1-4, lo que pone de manifiesto la ingeniería simultánea de la solubilidad y la unión al antígeno.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el de ELISA, que utilizan lisado purificado para verificar la especificidad del antígeno y determinar la afinidad de unión de los clones aislados. Después de ver este video, debe comprender cómo seleccionar un anticuerpo para que opere la unión a un antígeno de interés mediante el uso de la vía Tat para mostrar esa biblioteca y el paneo magnético de perlas para enriquecer y aislar los aglutinantes de antígenos. No olvide que trabajar con ácido sulfúrico puede ser extremadamente peligroso y es necesario usar un equipo de protección personal adecuado.