Name: Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprende a seleccionar fragmentos de anticuerpos para afinidad de unión y solubilidad utilizando la vía de translocación twin-arginina de Escherichia coli. Este método aprovecha el control de calidad del plegamiento proteico para la ingeniería de anticuerpos intracelulares.

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Agradecemos a Tomer Zohar por su trabajo en los ensayos de cribado y caracterización de scFv. Una parte de este trabajo fue apoyada por el premio número F32CA150622 del Instituto Nacional del Cáncer (a AJK). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o de los Institutos Nacionales de Salud.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Ingeniería de anticuerpos para la actividad citoplasmática es una tarea difícil debido al medio reductor del citoplasma, lo que impide la formación de enlaces disulfuro estabilizador 6,7. Esto hace que la mayoría de los anticuerpos para ser citoplásmicamente inactiva a no ser que se han diseñado para la estabilidad y la solubilidad en el citoplasma, además de estar diseñado para la afinidad de unión. Los métodos existentes de presentación de fagos, presentación de superficie bacteriana, y métodos de presentación en superficie de levadura todo el uso de la vía secretora 14-16 para la visualización de anticuerpos manipulados, pero estos métodos no tienen medios para diseñar plegado intracelular. Los anticuerpos manipulados utilizando la pantalla-membrana interna han mejorado la estabilidad y la solubilidad citoplásmica debido a que el control de calidad de plegado de la vía Tat evita la translocación de anticuerpos que están mal plegadas e inestables en el citoplasma. Este método simplifica el proceso iterativo de anticuerpos intracelulares de ingeniería para la afinidad de unand solubilidad, ya que las dos propiedades están diseñados en un solo paso. Aunque este método fue diseñado para la ingeniería de anticuerpos con una solubilidad en el entorno intracelular reductor, también se podría aplicar a los anticuerpos de ingeniería para funcionar en condiciones no reductoras, ya que las proteínas por ingeniería genética usando este método mantienen su plegado en el ambiente oxidante del periplasma. Aunque esta técnica simplifica el proceso de ingeniería de anticuerpos con alta afinidad y alta solubilidad citoplasmática, varias limitaciones son importantes a considerar cuando se utiliza este protocolo. Al analizar las señales de ELISA pantalla secundaria para identificar variantes de scFv prometedor, el umbral para discernir entre variantes potencialmente interesantes y los que no pueden exhibir adecuada de unión al antígeno no es probable que sea evidente hasta después de varios clones se han caracterizado más. Es importante buscar unión mejorada sobre el anticuerpo parental; sin embargo,una señal anormalmente alta podría ser indicativo de avidez 29 o los efectos de agregación 30, un reto que no es única para el enfoque de detección de visualización de la membrana interior. Una limitación clave a recordar cuando se utiliza este protocolo es la incapacidad para recuperar esferoplastos después del encuadre, ya que son inviables (datos no publicados). Esto requiere las etapas de amplificación de ADN y de transformación para recuperar los plásmidos que codifican el anticuerpo. Varios pasos críticos del protocolo permiten la ingeniería simultánea de plegado y unión de los anticuerpos. Para el cribado para tener éxito, la biblioteca de scFv se proyectará debe expresarse como una fusión con el péptido señal ssTorA. Sin esta secuencia, los anticuerpos no serán dirigidos a la vía Tat y por lo tanto no se translocan al periplasma 19. Además, es imperativo que una etiqueta de epítopo C-terminal se fusiona a los anticuerpos para permitir la detección de los anticuerpos que se muestran en el binding ensayos. Claramente, la E. coli cepa utilizada para expresar los scFv además, debe tener la maquinaria vía Tat es necesario, pero esto es cierto de la E. comúnmente utilizado cepas de E. coli. Las modificaciones de este protocolo son posibles para mejorar su potencial para aislar anticuerpos con las características deseadas. Un paso panorámica de sustracción puede ser completado antes de la toma panorámica contra el antígeno diana para agotar la biblioteca de scFv de constituyentes no deseados. Los esferoplastos de la biblioteca se pueden incubar con perlas magnéticas recubiertas con BCCP solo o revestido con una proteína no deseada, y de los esferoplastos que se unen a las perlas pueden ser descartadas antes de cribado de los esferoplastos no unidos restantes para la unión a la diana deseada. Como se mencionó en los resultados representativos, un método para mejorar la afinidad de un scFv aislado es incluir un competidor soluble en la reacción de panning para competir con los scFv que se muestran en los esferoplastos. Debido a que el borrador solublesetitor es una proteína purificada, sin ADN se amplificó a partir de ella, de modo que sólo las secuencias de los scFv que se muestran en los esferoplastos se recuperarán en la reacción de PCR. Además, este método podría extenderse a la ingeniería de otros tipos de anticuerpos o a proteínas de unión que no son anticuerpos. E. pantalla del centro de la membrana coli es una potente plataforma de ingeniería anticuerpos con alta afinidad y altos niveles de solubilidad intracelular. Este método es particularmente adecuado para la ingeniería eficiente de anticuerpos diseñados para funcionar en el medio ambiente intracelular. Estos anticuerpos intracelulares que ya se están estudiando como agentes terapéuticos potenciales en varios campos, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas, cáncer y las infecciones virales 31. Esta técnica permitirá un uso más generalizado de anticuerpos intracelulares como herramientas para la investigación y la medicina en estos campos y cualquier otro campo en el que se desea estudiar es un objetivo proteína in situ.

Anticuerpos capaces de doblar y funcionando en el entorno intracelular son herramientas prometedoras tanto para aplicaciones terapéuticas y de investigación. Tienen la capacidad de modular la actividad de la proteína mediante la unión a una proteína diana dentro de las células para evitar interacciones proteína-proteína, interrumpir las interacciones proteína-ácido nucleico, o impedir el acceso de sustrato a las enzimas 1-5. Aunque los anticuerpos tienen un gran potencial para aplicaciones intracelulares, ingeniería ellos para el plegamiento adecuado y la solubilidad en el medio ambiente intracelular, mientras que se mantiene la capacidad de unirse a un antígeno diana es un reto. El entorno citoplásmico reducir evita la formación de los enlaces disulfuro que normalmente se requieren para el plegado estable de anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos, incluyendo anticuerpo de cadena sencilla (scFv) anticuerpos 6,7. Una serie de enfoques de evolución dirigida se han empleado para diseñar anticuerpos con hafinidades IGH para encauzar antígenos 8-10. Estos enfoques utilizan comúnmente presentación de fagos, presentación de superficie de levadura, o presentación de superficie bacteriana para cribar grandes bibliotecas de anticuerpos 11-13. Estos métodos son de gran alcance y eficaz para la identificación de anticuerpos que se unen a objetivos, sin embargo, dependen de la vía secretora para el transporte de las proteínas que se mostrarán 14-16. La vía secretora transloca proteínas desplegadas desde el citoplasma reducción en el lumen del retículo endoplasmático en la levadura o en el periplasma en bacterias. Las proteínas se pliegan a continuación en condiciones oxidantes y se muestran en la superficie celular o empaquetados en partículas de fago para la detección de la afinidad de unión a 17,18. Como resultado, los anticuerpos aislados usando estas técnicas no necesariamente plegar bien en el citoplasma, y ​​la solubilidad intracelular a menudo deben ser diseñados por separado si se utilizan los anticuerpos en aplicaciones intracelulares. Mejorarla eficacia de los anticuerpos de ingeniería que están bien plegadas en el citoplasma, se informó anteriormente el éxito de MAD-TRAP (pantalla anclada a la membrana para el reconocimiento basado en Tat de proteínas que asocian), un método para el cribado de una biblioteca de anticuerpos scFv utilizando Escherichia coli inervación pantalla membrana 19. visualización del centro de la membrana bacteriana se basa en la vía de doble arginina translocación (Tat) para el transporte de los anticuerpos que se muestran, en contraste con otros métodos de visualización común que utilizan la vía secretora. La vía de Tat contiene un mecanismo de control de calidad que sólo permite, proteínas correctamente plegadas solubles para ser transportados de la E. citoplasma coli, a través de la membrana interna, y en el periplasma 20,21. Sustratos sobreexpresa Tat (es decir., Proteínas dirigidas a la vía de Tat con una fusión N-terminal con el péptido señal Tat ssTorA) que son bien doblado en el citoplasma forman una translocación de larga vida intermedio con el N-terminal in el citoplasma y el C-terminal en el periplasma 19. Esto permite la visualización de Tat sustratos correctamente plegadas, incluyendo fragmentos de anticuerpos, en la cara periplásmico de la E. membrana interna coli. Después de retirar la membrana externa mediante digestión enzimática para generar esferoplastos, los anticuerpos están expuestos al espacio extracelular (Figura 1). Esto permite Tat sustratos que se muestran en la membrana interna que se proyectarán por la unión a un objetivo específico. Es importante destacar que, el aprovechamiento de la vía de Tat para la visualización de la superficie celular asegura que sólo los anticuerpos de la biblioteca que son bien plegadas en el citoplasma serán interrogados por la unión, lo que permite la ingeniería simultánea de afinidad y plegado intracelular de unión. En este protocolo, se describe cómo mostrar una biblioteca de scFv en el E. membrana interna coli, Pan la biblioteca contra un antígeno diana, y llevar a cabo una pantalla secundaria para identificar los componentes más prometedores de la biblioteca. Mientras nos centramos<html> el protocolo de scFv, el método podría ser aplicado a la ingeniería de cualquier proteína cuya aplicación requiere de plegado y unión intracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Figura 1. Pantalla-Tat membrana interna. En E. coli, los anticuerpos scFv que se expresan como una fusión con la secuencia señal ssTorA y correctamente plegadas en el citoplasma son transportados a través de la membrana interna. Una translocación formas intermedias, donde los scFv están anclados en la membrana interna con el extremo N-terminal en el citoplasma y el C-terminal en el periplasma. El E. membrana externa coli se digiere enzimáticamente para formar esferoplastos, exponiendo de este modo los anticuerpos anclados al espacio extracelular y ponerlos a disposición para la detección mediante el uso de un anticuerpo que se une a la etiqueta epítopo fusionado C-terminal en el anticuerpo visualizada.carga / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<table><tbody><tr><td></td><td>Una biblioteca</td><td></td><td>scFv adecuada debe obtenerse de una fuente comercial o académica.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli células</td><td>Centro de Stock Genético de Coli</td><td>6152</td><td>Las células deben ser químicamente competentes o electrocompetentes, según el método de transformación seleccionado.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco medio de cultivo deshidratado LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, dibásico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (detergente para lisis celular)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3,000&nbsp; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Antígeno diana</td><td>Varía</td><td>N/A El</td><td>antígeno diana purificado puede comprarse o producirse/purificarse.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubos</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>Cebadores PCR IDT</td><td></td><td>N/A</td><td>Las secuencias de cebadores son las descritas en el protocolo.</td></tr><tr><td>10x Tampón de reacción de ADN ligasa T4</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Poniucelotide quinasa (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Asegúrese de que el tampón de ligasa T4 utilizado en la reacción de fosforilación del cebador contenga 1 mM de ATP.</td></tr><tr><td>5x Paquete de tampones Phusion HF</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>B0518S Mezcla</td><td></td></tr><tr><td>de solución de desoxinucleótidos (dNTP), 10 mM cada uno dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td> Se <td>pueden utilizar otras polimerasas de alta fidelidad como alternativa, pero se debe ajustar la temperatura de recocido en <fuerte>Tabla 3</fuerte>.</td></tr><tr><td>Termociclador C1000 Touch con doble módulo de reacción rápida 48/48</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Tinción de gel de ADN segura</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV sistema de limpieza de gel y PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdiálisis filtro de membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar general Tapas de placas de ensayo de poliestireno</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas de microtitulación</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 pocillos EIA/RIA Easy Wash Poliestireno transparente de fondo plano microplaca de alta unión</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-secante policarbonato de 96 pocillos herramienta replicadora</td><td>Bel-Art Products 378760002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada instantánea</td><td>Calidad Biológica</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbato 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo PopCulture (detergente concentrado para lisis celular)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidasa (HRP) producido en ratón</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4), 10&nbsp; Solución N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap papel de aluminio</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch espectrofotómetro de microplacas</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Los anticuerpos diseñados para la función intracelular no solo deben tener afinidad por su antígeno diana, sino que también deben ser solubles y estar correctamente plegados en el citoplasma. Los métodos comúnmente utilizados para la visualización y el cribado de bibliotecas de anticuerpos recombinantes no incorporan el control de calidad del plegamiento de proteínas intracelulares y, por lo tanto, la capacidad de unión al antígeno y el plegamiento citoplasmático y la solubilidad de los anticuerpos diseñados con estos métodos a menudo deben diseñarse por separado. Aquí, describimos un protocolo para examinar una biblioteca recombinante de anticuerpos de fragmento variable de cadena única (scFv) para la unión al antígeno y el plegamiento citoplasmático adecuado simultáneamente. El método aprovecha el mecanismo de control de calidad de plegamiento intracelular intrínseco de la vía de translocación de arginina gemela (Tat) de Escherichia coli para mostrar una biblioteca de scFv en la membrana interna de E. coli. La vía Tat garantiza que solo las proteínas solubles y bien plegadas sean transportadas fuera del citoplasma y se muestren en la membrana interna, eliminando así las scFvs mal plegadas antes de la interrogación para la unión al antígeno. Después de la extracción de la membrana externa, los scFvs que se muestran en la membrana interna se desplazan contra un antígeno objetivo inmovilizado en perlas magnéticas para aislar los scFvs que se unen al antígeno objetivo. Se utiliza un cribado secundario basado en un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para identificar los scFvs más prometedores para su caracterización adicional. La unión a antígenos y la solubilidad citoplasmática se pueden mejorar con rondas posteriores de mutagénesis y cribado para diseñar anticuerpos con alta afinidad y alta solubilidad citoplasmática para aplicaciones intracelulares.

El plegamiento de la proteína mecanismo de control de calidad intracelular de la vía de Tat en E. coli limita el transporte a través de la membrana interna de la célula a las proteínas que son bien plegadas en el ambiente citoplasmático de reducción. Por la sobreexpresión de una fusión de un scFv a la secuencia señal ssTorA (la secuencia señal de la proteína de TORA, que es, naturalmente, transportado por la vía de Tat 20), la translocación está estancado, lo que resulta en la pantalla de los scFv en la membrana interna 19. Después de la interrupción enzimática de la membrana externa, los anticuerpos que se muestran se hacen disponibles para el cribado para la actividad de unión al antígeno. La capacidad de tomar ventaja de la vía de Tat para la visualización de scFv se demostró por Karlsson et al. 19 (Figura 6). Los anticuerpos scFv y scFv13 scFv13.R4 se fusionaron a ya sea la secuencia de ssTorA nativo o un ssTorA modificada que carece de la par de residuos de arginina-arginina reconocido porla vía de Tat. scFv13.R4 fue diseñado por Martineau et al. de scFv13 a través de cuatro rondas de evolución dirigida y es conocido para plegar bien en el citoplasma 9. Este scFv se muestra en la membrana interna, pero sólo cuando se expresa como una fusión con la secuencia señal nativa ssTorA (Figura 6). Por el contrario, scFv13 no está bien doblada citoplásmicamente 9, por lo que no se muestra bien en la membrana interna, independientemente de la secuencia señal a la que se fusiona. Además, si los scFv se expresaron en células que carecían de la proteína tatC, un componente vital de la maquinaria Tat 20,28, no se observó la pantalla, mostrando la importancia del vínculo entre la pantalla del centro de la membrana y la vía Tat. Estos resultados demuestran que sólo las proteínas que contienen el péptido señal Tat y que se pliegan correctamente en el citoplasma se muestran en la membrana interna, que permite el transporte a través de la vía de Tat para funcionar como una pantalla para fol intracelulartimbre. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Figura 6. Detección de scFv que se muestran en la membrana interna. La citometría de flujo se realizó un análisis para detectar la pantalla de mal plegada scFv13 y bien plegada scFv13.R4 en la membrana interna. scFv se fusionaron a ssTorA nativo o ssTorA (KK), donde el par Arg-Arg en la secuencia ssTorA se modificó para Lys-Lys. Las etiquetas de epítopo FLAG C-terminal de los scFv se detectaron con un isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo anti-FLAG. Las células sin la proteína tatC (ΔtatC) y ssTorA-scFv13 sin la etiqueta FLAG se probaron como controles. M indica el valor mediana de la fluorescencia. Reproducido de la referencia 19 con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; pantalla interna de la membrana puede aislar con éxito anticuerpos scFv con altos niveles de afinidad para una proteína diana y los altos niveles de solubilidad citoplasmática. Además, las siguientes rondas de evolución dirigida utilizando visualización membrana interna mejoran las características de anticuerpos 19. Para demostrar esto, una biblioteca de PCR propensa a error sobre la base de scFv13, que tiene un bajo nivel de afinidad de unión para β-galactosidasa, se panorámica contra el antígeno diana β-galactosidasa utilizando la pantalla y paneo método descrito en el protocolo. scFv 1-4 fue aislado después de una ronda de mutagénesis y la panorámica, y exhibió mayor afinidad de unión a beta-galactosidasa de scFv13 (Figura 7A) y un mayor nivel de solubilidad citoplásmica (Figura 7B). Una nueva biblioteca, basado en scFv 1-4, se hizo usando PCR propensa a error, y la panorámica de esta biblioteca de segunda generación contraβ-galactosidasa se realizó utilizando una modificación del protocolo descrito. El paneo contra la β-galactosidasa para la segunda ronda de la evolución se llevó a cabo en presencia de purificado, scFv soluble 14 como un competidor para mejorar la probabilidad de aislar clones con mayor afinidad que scFv 1-4. Después de esta segunda ronda de mutagénesis y la panorámica, scFv y scFv 2-1 2-3 se aislaron utilizando la selección secundaria basados ​​en ELISA. Estos scFv no sólo exhiben mayor afinidad de unión para la β-galactosidasa de scFv13, pero también mostraron una mejor unión de la primera ronda del clon de scFv 1-4. scFv 2-1 exhibió β-galactosidasa de unión comparable a la de scFv13.R4 (Figura 7A). scFv 2-3 también muestra un aumento adicional de la solubilidad citoplásmica en comparación con scFv 14, destacando la ingeniería simultánea de solubilidad y de unión al antígeno. Desde afinidad y la expresión soluble de los scFv son examinados para detectar simultáneamente, es posible que un scFv seleccionado ha modsolubilidad eRate pero de alta versa vinculante o vicio. Por ejemplo, scFv 2-1 tiene soluble expresión más baja que scFv 2-3, pero exhibe una mayor afinidad de unión a la ß-galactosidasa. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Figura 7. Objetivo de unión y la expresión citoplasmática de scFv variantes aislado utilizando la pantalla del centro de la membrana. ScFv (A) se expresaron en el citoplasma de E. células de E. coli (por ejemplo., sin la secuencia señal ssTorA) con una hexahistidina tag (6 x His) y se purificó usando ácido spin-columnas de níquel-nitrilotriacético. La unión de los scFv purificados a ß-galactosidasa se midió con un ELISA. scFv purificados se cargaron en placas de ELISA de β-galactosidasa-revestido, y se detectaron los scFv unidos con un anticuerpo anti-6 x His. Los datos son un promedio de seis réplicas, y la barra de error muestra el error estándar de la media.(B) Las fracciones soluble e insoluble de los lisados celulares de células que expresan los scFv citoplásmicamente fueron analizados por una transferencia Western sondada con un anticuerpo anti-6 x His. La concentración total de proteína se utilizó para normalizar la carga de las muestras. Reproducido (A) y adaptado (B) de la referencia 19 con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Proporcionamos un método para cribar simultáneamente una biblioteca de fragmentos de anticuerpos para determinar la afinidad de unión y la solubilidad citoplasmática utilizando la vía de translocación de arginina gemela de Escherichia coli, que tiene un mecanismo de control de calidad inherente para el plegamiento de proteínas intracelulares, para mostrar los fragmentos de anticuerpos en la membrana interna.

Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

El objetivo general de este procedimiento es aprovechar el control de calidad del plegamiento de la vía de translocación de doble arginina para diseñar simultáneamente la unión de fragmentos de anticuerpos y su plegamiento intracelular en una sola etapa, lo que tendrá aplicaciones en la ingeniería de anticuerpos para que funcionen intracelularmente. Este método puede ayudar a superar desafíos clave en el campo de la ingeniería de anticuerpos, como la dificultad para diseñar anticuerpos que se plieguen y funcionen adecuadamente en el entorno citoplasmático reductor. Solo los anticuerpos que se pliegan correctamente en el citoplasma se muestran y analizan para evaluar su capacidad de unión.Proporciona una ventaja frente a la presentación en levaduras y fagos, que dependen de las vías secretoras para la exposición. Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestro tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, cáncer e infecciones virales, ya que estas enfermedades implican una patogénesis intracelular que podría ser blanco de los anticuerpos. La demostración visual de este método es fundamental porque comprender cómo generar y trabajar con esferoplastos resulta complicado.Después de fusionar la biblioteca de scFv con la secuencia señal ssTorA y cultivarla a 37 grados Celsius con agitación durante tres horas, permita la expresión de la biblioteca de scFv a 20 grados Celsius y 225 rpm durante la noche, entre 15 y 22 horas. Tras la incubación, utilice un espectrofotómetro para medir la densidad óptica a 600 nanómetros. A continuación, centrifugue el volumen calculado del cultivo inducido en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros a 12.000 ×g y temperatura ambiente durante cinco minutos.Elimine el sobrenadante y use 100 microlitros de tampón de fraccionamiento frío o fB para resuspender los pellet. Luego, centrifugue las muestras a 12.000 × g y temperatura ambiente durante un minuto. Después de eliminar el sobrenadante, use 350 microlitros de fB frío suplementado con 3,5 microlitros de lisozima al 10 miligramos por mililitro para resuspender los pellet.A continuación, mientras se agitan lentamente los tubos en vórtex, añádanse gota a gota 700 microlitros de EDTA 1 milimolar y luego incúbense los tubos en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos para mezclar las muestras. Retírense los tubos del rotador. Añádanse 50 microlitros de MgCl2 frío con hielo 0,5 molar a cada tubo y incúbense en hielo durante 10 minutos.Luego, centrifugue las muestras a 11,000 × g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Ahora, con una micropipeta y una punta de un mililitro, aspire lentamente una porción del precipitado. A continuación, sosteniendo el tubo en un ángulo con la abertura directamente sobre un nuevo tubo de 1,5 mililitros, saque lentamente la punta de la pipeta del sobrenadante y deslice el precipitado dentro del nuevo tubo.Después de eliminar el sobrenadante en exceso, use un mililitro de PBS frío con hielo para resuspender los esferoplastos. Los esferoplastos deben resuspenderse completamente antes del panning, ya que las scFv no ligadas presentes en agregados darán lugar a falsos positivos durante el panning. Después de biotinilar el antígeno diana según el protocolo descrito en el texto, resuspenda las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en su vial original.Luego, transfiera de siete a diez veces 10 a la novena potencia de perlas a un tubo de 1,5 mililitros. Coloque el tubo con perlas en el soporte magnético durante dos minutos para recoger las perlas en la pared del tubo y pipetee cuidadosamente para eliminar el sobrenadante. Retire el tubo del imán y use PBS para resuspender las perlas sin generar burbujas.Luego, devuelva el tubo al imán y elimine el tampón antes de lavar las perlas dos veces más con PBS. Añada un mililitro de lisado que contenga el antígeno biotinilado a las perlas e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos con rotación suave. Tras la incubación, use PBS con 1% de BSA para lavar las perlas cinco veces.Luego, use PBS con 1 % de BSA para resuspender las perlas. Para tamizar la biblioteca de scFv, comience añadiendo cuatro veces 10 a la novena potencia de esferoplastos y ocho veces 10 a la octava potencia de perlas a un tubo estéril de 15 mililitros. Añada PBS 1x con 1 % de BSA para llevar el volumen total a cuatro mililitros.Luego, alícuote la solución en cuatro tubos de 1,5 mililitros con un mililitro cada uno e incube las reacciones a cuatro grados Celsius rotando suavemente durante cinco horas. Para preparar los esferoplastos unidos a perlas para PCR, coloque los tubos de reacción de selección en el imán durante tres minutos. Retire el sobrenadante y lave las perlas con PBS 1x con 1 % BSA cuatro veces como antes.Luego, utilice 25 microlitros de ddH2O por tubo para resuspender las perlas. Como se describe en el protocolo escrito, realice una PCR del plásmido completo para amplificar los genes de los scFv unidos a las perlas y luego recircularice el plásmido a partir del producto de PCR. Transforme toda la reacción en células MC4100 igualadas según el protocolo escrito.Para identificar clones mediante ELISA, descongele un tubo de la sublibrería seleccionada y siembre en placas de agar LB. Añada 200 microlitros de LB con 20 microgramos por mililitro de cloranfenicolol en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos con fondo redondo. Con la punta de una pipeta, seleccione una colonia individual de la placa de agar.Luego, coloque la punta en el primer pocillo de la placa de 96 pocillos y agite suavemente para inocular. Continúe inocular una colonia en cada pocillo. Incube a 37 grados Celsius durante 20 a 24 horas en un agitador para microplacas.Después de preparar una solución de recubrimiento con el antígeno diana según el protocolo descrito en el texto, añada 50 microlitros de la solución a cada pocillo de una placa ELISA de poliestireno transparente de 96 pocillos de alta unión. Incube las placas durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, replique las colonias de las placas de cultivo de 96 pocillos en placas de agar según el protocolo descrito en el texto.Luego, retire la solución de recubrimiento de las placas de ELISA y agregue 100 microlitros de la solución bloqueadora preparada según el protocolo descrito en el texto a cada pocillo. Incube a temperatura ambiente durante al menos dos horas o a cuatro grados Celsius durante la noche. Añada 20 microlitros de un detergente concentrado para lisis celular a cada pocillo de la placa de cultivo de fondo redondo e incube la placa de cultivo en un agitador para microplacas a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos.Vacíe la solución de bloqueo de las placas de ELISA y lave los pocillos cuatro veces con 200 microlitros de tampón de lavado preparado según el protocolo descrito en el texto. Después de eliminar el último lavado, transfiera 50 microlitros de cada pocillo de la placa de lisis celular al pocillo correspondiente de la placa de ELISA. Incube las placas a temperatura ambiente durante una a dos horas.Proceda a vaciar las muestras de la placa de ELISA y lave los pocillos cuatro veces. Posteriormente, prepare la solución de anticuerpo para detectar los scFv según el protocolo descrito en el texto. Añada 50 microlitros de anticuerpo a cada pocillo e incube de una a dos horas a temperatura ambiente.Lave las placas de ELISA cuatro veces con tampón de lavado antes de añadir 200 microlitros por pocillo de sustrato de HRP preparado según el protocolo del fabricante. Incube las placas a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 a 60 minutos. Para detener la reacción, añada 50 microlitros de H2SO4 tres molar a cada pocillo y pipetee suavemente para mezclar la solución.Finalmente, mida la absorbancia utilizando un lector de placas a 492 nanómetros. En este experimento, los anticuerpos scFv scFv13 y scFv13.R4 se fusionaron con la secuencia ssTorA nativa o con una ssTorA modificada que no es reconocida por la vía de translocación de arginina doble, también llamada vía Tat. ScFv.R4 se pliega adecuadamente y se expresa en la membrana interna cuando se fusiona con ssTorA nativo. ScFv13 no se pliega adecuadamente y no se muestra en la membrana interna, independientemente del péptido señal Tat al que esté fusionado. Estos resultados demuestran que solo las proteínas que contienen el péptido señal Tat y que se pliegan correctamente en el citoplasma se muestran en la membrana interna, lo que permite que la vía Tat funcione como una prueba para el plegamiento intracelular.En este experimento, se realizó un cribado frente a beta-gal sobre una biblioteca de PCR con errores basada en scFv13, que presenta un bajo nivel de afinidad de unión para beta-galactosidasa. Se aisló el scFv 1-4, el cual mostró una mayor afinidad de unión a beta-gal que el scFv13, así como un mayor nivel de solubilidad citoplasmática. Utilizando el scFv 1-4 como competidor frente a la biblioteca de segunda generación de scFv 1-4, se aislaron los scFv 2-1 y 2-3, que demostraron afinidades de unión aún mayores para beta-gal que el scFv13 1-4, destacando la ingeniería simultánea de solubilidad y unión al antígeno.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ELISA utilizando lisado purificado, con el fin de verificar la especificidad del antígeno y determinar la afinidad de unión de los clones aislados. Después de ver este video, debería comprender cómo seleccionar un anticuerpo para su unión a un antígeno de interés mediante el uso de la vía Tat para mostrar esa biblioteca y el tamizado con perlas magnéticas para enriquecer y aislar los ligandos del antígeno. No olvide que trabajar con ácido sulfúrico puede ser extremadamente peligroso y que es necesario usar equipo de protección personal adecuado.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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