Name: los Drosophila Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende a disecar discos imaginales oculares y cerebros de Drosophila para visualizar y cuantificar cambios en la expresión génica e invasividad tumoral. Este protocolo utiliza análisis de mosaicos MARCM para estudiar mecanismos de desarrollo epitelial y homeostasis.

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Agradecemos al Bloomington Stock Center (Bloomington, EE. UU.), Dirk Bohmann, Katja Brückner e Istvan Ando por las existencias de moscas y los anticuerpos. Agradecemos a Marek Jindra y Colin Donohoe por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Premio Sofja Kovalevskaja a la U.M. de la Fundación Alexander von Humboldt y el proyecto DFG UH243/1-1 a la U.M. de la Fundación Alemana de Investigación.

NOTA: En este trabajo se utiliza el eyFLP1; Ley&gt; y +&gt; Gal4, UAS-GFP; Línea probador FRT82B, bañera-GAL80 MARCM 82B Verde 11. Cruzando las vírgenes probador MARCM 82B verde a los machos de las cepas, tales como W; UAS-a; UAS-RNAi b, c FRT82B genotipo mut producirá progenie en la que se producirá la recombinación mitótica entre los brazos derechos de los cromosomas homólogos de 3ª. De esta manera, los clones mutantes homocigotos para el gen c situado distal al sitio FRT82B se genera dentro de la EAD y neuroepitelio cerebro. Estos clones expresarán GFP, transgén un dsRNA y para el gen de b (Figura 1A). Varias líneas probador eyFLP-MARCM para la recombinación en los ejes X, 2L, 2R, 3R y 3L se han establecido y están disponibles dentro de la comunidad mosca. 1. Manipulación de la mosca, cruces, y estadificación <ol><li> Expandir el probador MARCM madre apropiada a temperatura ambiente por poblar múltiples bottles al mismo tiempo. Voltear los adultos en botellas frescas cada 2-3 días, así que un número suficiente vírgenes pueden ser recogidos para cruces subsiguientes. NOTA: Al recoger vírgenes, evitar una exposición prolongada a CO 2 ya que esto pone en peligro la fecundidad femenina. </li><li> Dependiendo de la escala del experimento, establecer cruces de moscas en viales utilizando al menos 10 vírgenes probador MARCM y 4 hombres (por ejemplo, para la obtención de imágenes de los reporteros fluorescentes y de inmunotinción) o en botellas con al menos 30 vírgenes y 10 machos (por ejemplo, para el aislamiento de ARN y la cuantificación de la invasividad). </li><li> Elevar la progenie a 25 ° C bajo un día largo ciclo de luz-oscuridad / 8 h 16 h. Voltear los padres en nuevos frascos / botellas cada 24 horas para facilitar la puesta en escena reproducible de larvas y para evitar el hacinamiento. NOTA: A partir del día 6 después de la puesta de huevos (AEL), a finales del tercer control de instar larvas dejan de alimentarse, empieza a deambular y entrar pupariation. Por el contrario, el comienzo de la transición larval-pupal se puede Delayed o inexistente en larvas con EAD portadores de tumores clonales hiperplásicas o malignas. </li></ol> 2. El cobro de larvas de tercer estadio <ol><li> Para la inmunotinción, recoger aproximadamente 20 larvas de instar tercero tarde (deambulando en la pared y los de un tamaño de cuerpo comparable de los alimentos). El uso de fórceps para recoger suavemente las larvas del frasco o botella y transferirlos en un plato de cristal embrión llena con solución salina tamponada con fosfato (PBS). <ol><li> Para el aislamiento del ARN y cuantificación de invasividad, recoger al menos 80 finales de las larvas de instar tercero (deambulando en la pared y los de un tamaño de cuerpo comparable de los alimentos). Utilice una botella con atomizador a chorro de PBS en una botella que contiene larvas de mosca hasta que la superficie está cubierta. </li><li> Suavizar las capas superiores de los alimentos con una espátula y vierta el puré de alimentos que contienen larvas en una placa de Petri. Con unas pinzas, elegir con cuidado las larvas y transferirlos a un plato de vidrio lleno de embriones con PBS. </li></ol></li><li> Lavar con PBS larvas until toda la comida residual se elimina. Inspeccionar las larvas bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia con 8 a 16X aumentos para desechar todo &quot;larvas de leopardo&quot; que llevan manchas GFP-positivas al azar en todo el cuerpo de la larva (Figura 2A, 2B y la sección Discusión). NOTA: Para el aislamiento de ARN incluir una etapa de lavado penúltima en EtOH al 70% durante 1 min. </li><li> Coloque el plato que contiene larvas seleccionadas en PBS en hielo hasta la disección. larvas proceso dentro de 30 minutos para evitar los efectos adversos de frío y hambre. </li></ol> 3. La disección de las larvas <ol><li> Para diseccionar el EAD bajo un microscopio estereoscópico, utilice un par de pinzas para presionar suavemente la parte media de la larva en contra de la parte inferior del plato de vidrio. Con la segunda pinza, agarra los ganchos de la boca de larvas y tirar de ellos fuera del cuerpo (Figura 2C). NOTA: La fuerza de tracción es a menudo suficiente para romper los tallos óptica que conectan el EAD pair para los lóbulos cerebrales. Si el cerebro o sus partes se mantienen unidas a EAD y su presencia no se desea para otras aplicaciones, cortar los tallos óptica con la ayuda de los dos pares de pinzas. Para los tumores invasivos (por ejemplo, Ras V12 scrib 1) la conexión entre la EAD y los lóbulos del cerebro se vuelve cada vez oscurecían con el tiempo por el crecimiento excesivo y la migración de células clonales. <ol><li> Para preparar el complejo EAD / cerebro con un cordón nervioso ventral intacta (VNC) (Figura 2D), el uso de fórceps para cortar una larva en el medio del cuerpo. Desechar la mitad posterior. </li><li> Mantenga la mitad anterior del cuerpo de la larva entre las puntas de un fórceps, dar la vuelta a la larva de adentro hacia afuera empujando los ganchos de la boca con la punta de los segundos fórceps y haciendo rodar la cutícula sobre él con el primer par de fórceps. </li></ol></li><li> Con unas pinzas retire con cuidado todos los tejidos extraños (por ejemplo, las glándulas salivales, la grasa corporal, y los intestinos), dejando el par o EADel complejo EAD / cerebro conectado a los ganchos de la boca. Separar los ganchos de la boca de la cutícula que recubre. Libertad para los VNC mediante el corte de las proyecciones axonales se extienden a los músculos del cuerpo y la epidermis (Figuras 1B, 2C, 2D). NOTA: Los ganchos de la boca permiten la manipulación segura del tejido con unas pinzas y facilitan hundimiento más eficiente y fácil reconocimiento del tejido durante el lavado. Diseccionado EAD cambio de morfología relativamente rápido cuando se mantienen sin fijar en PBS. Limitar el tiempo de disección para 20-30 min. </li><li> Para transferir el tejido, capa una punta de micropipeta P20 pipeteando el cuerpo restante de carcasas varias veces arriba y abajo. Para transferir los complejos EAD / cerebro más grande, cortar la punta de la micropipeta P20 con unas tijeras. NOTA: El procedimiento de revestimiento es fundamental para evitar que se pegue y pérdida de tejido diseccionado durante la transferencia. El uso de una micropipeta P20 minimiza la transferencia de PBS en la solución de fijación, dilución limitante no deseado. <ol><li> Para la inmunotinción, transferirel EAD diseccionado en un tubo de 0,5 ml lleno con 400 l de paraformaldehído al 4% fijador (PFA). Usar tubo de 1,5 ml con 1 ml de PFA para EAD mayor / complejos cerebrales destinados para la puntuación de invasividad. PRECAUCIÓN: PFA es altamente tóxico. Use guantes y ropa de protección. Evitar el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas. </li><li> Para el aislamiento de ARN transferir el DEE diseccionado en un nuevo plato de vidrio lleno de PBS frío. El uso de fórceps para limpiar EAD de las glándulas linfáticas en el anillo y, para minimizar la contaminación de la muestra. </li><li> Separar el EAD de los ganchos de la boca mediante el corte de la conexión entre los discos de antena y ganchos de la boca con unas pinzas (Figura 2E). Para evitar la degradación del ARN y los artefactos de expresión génica, limitar el tiempo de disección para 30 min. Continúe con el paso 7. NOTA: Un investigador experimentado puede diseccionar alrededor de 60 larvas en 30 min Tiempo de exclusión necesarios para la recolección de larvas y lavado. los rendimientos totales de ARN dependen del tamaño EAD que varían entre los genotipos y developmentaetapas l. La disección de 80-100 pares de control EAD desde finales de larvas de tercer estadio debe ceder 5-8 g de ARN total. </li></ol></li></ol> 4. Fijación, inmunotinción, y el montaje <ol><li> Fijar las muestras en PFA fijador durante 25 min mientras nutación a temperatura ambiente. El tiempo de fijación se puede extender hasta 60 minutos sin alterar la morfología del tejido y la antigenicidad de las proteínas. </li><li> Retirar las muestras fijador y lavar con PBST (PBS con 0,1% de Triton X-100) tres veces durante 10 minutos usando un nutator. Utilice volumen suficiente de PBST para cada etapa de lavado (tubo de 400 l / 0,5 ml). NOTA: Se ha corregido complejos / EAD cerebrales destinados para la puntuación de invasividad no requieren inmunotinción. GFP señal se mantiene muy visibles después de la fijación. Continúe con el paso 4.4 para la disección final. <ol><li> Para la inmunotinción, tejido bloque en 200 l de una solución de bloqueo (PBST con 0,3% BSA) durante 20 min con agitación suave a temperatura ambiente. <ol><li> Incubar con primanticuerpos ary diluyeron en 100 l de una solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C mientras se agita suavemente. Consulte la hoja de datos anticuerpo primario o la literatura publicada para la dilución de anticuerpos recomendada. NOTA: puede ser necesario optimizar la dilución del anticuerpo primario. </li><li> Después de cinco lavados de 10 min en PBST, tejido mancha con los anticuerpos secundarios fluorescentes diluido en solución de bloqueo mientras agitando suavemente durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> muestras de lavado tres veces en PBST 10 min. </li></ol></li></ol></li><li> Reemplazar PBST con 500 l de solución de tinción DAPI. Para etiquetar F-actina, añadir faloidina conjugada con un colorante fluorescente a la solución de tinción DAPI. Después de 15 min de nutación en la oscuridad, lavar el tejido una vez por 10 min con PBST. NOTA: etiquetado F-actina se puede llevar a cabo de forma independiente de la tinción DAPI. </li><li> Para la etapa de la disección final, la transferencia de tejido nuevo en un recipiente de vidrio lleno de PBS utilizando una pi 1 mlpette. El uso de los dos pares de pinzas recortar de los ganchos de la boca. <ol><li> Separar los cerebros que serán utilizados para la cuantificación de la invasividad de la EAD cortando el tallo óptico como EAD cubierto pueda obstaculizar el análisis. </li></ol></li><li> Colocar una gota de medio de montaje (15 l para un 22 mm x 22 mm cubreobjetos) en una diapositiva objetivo. Con la ayuda de fórceps consejos, distribuir el medio en una capa delgada. Transferir EAD, el cerebro o los complejos de EAD / cerebro en el medio de montaje con una micropipeta P20. </li><li> Use las puntas de las pinzas o una varilla de tungsteno para distribuir los tejidos y enderezar el VNC en la diapositiva. </li><li> Para evitar la formación de burbujas durante el montaje, el primer toque de un borde de un cubreobjetos para el medio de montaje y luego baje lentamente sobre el medio de montaje con la ayuda de unas pinzas. Use pequeños trozos de papel o tejido del filtro toallita para absorber el exceso de medio de montaje alrededor de los bordes cubreobjetos. NOTA: DABCO / poli (alcohol vinílico) 4-88 montaje endurece medianasa 4 ° C en una hora. Las diapositivas se pueden almacenar durante meses a 4 ° C. </li></ol> 5. Imagen confocal <ol><li> Adquirir secciones confocales individuales y pilas utilizando un microscopio confocal equipado con 20X, 40X y objetivos de aceite 60X. </li><li> Evitar la saturación de píxeles. Utilizar los mismos parámetros de adquisición de imágenes, incluyendo resolución de la imagen, la potencia de entrada del láser, la ganancia, offset, promediado marco, un tamaño de paso en una serie Z y mantener estos valores para todos los genotipos para permitir una comparación de intensidades de los píxeles entre los diferentes genotipos 21,22. NOTA: Para la visualización del complejo / cerebro EAD, generar proyecciones de máxima y coser respectivas imágenes, vecinos. Para la preparación imagen final, utilizar el software de procesamiento de imágenes para el montaje posterior del panel y para ajustar el brillo y el contraste. </li></ol> 6. Cuantificación de la invasividad tumoral <ol><li> Definir un sistema de puntuación que va a caracterizar los diferentes niveles de invasivenes tumoraless teniendo en cuenta el patrón espacial de la invasión y la cantidad de células positivas para GFP se extienden en el cerebro y VNC. Preparar hojas de evaluación de la documentación (Figura 3A). </li><li> Monte al menos 80 fija cerebro intacto para cada genotipo en una diapositiva utilizando 40 l de la solución de montaje por 24 mm x 50 mm cubreobjetos. <ol><li> Para permitir que la puntuación objetiva, pida una parte neutral para anonimizar las diapositivas, de modo que el procedimiento de puntuación es imparcial. Evaluar diapositivas anonimizados por dos miembros del laboratorio independiente. Divulgar genotipos sólo después de que se terminó el conteo. </li></ol></li><li> Evaluar el grado de malignidad de una puntuación a ciegas de cerebros montados bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con un conjunto de filtros de GFP. Use un marcador para etiquetar los cerebros que ya han sido vistos para evitar el doble cómputo (Figura 3B). </li><li> Calcular el porcentaje de cerebros que caen en cada una de las categorías definidas invasivos por genotipo. Determinar los s estadísticosignificance utilizando una prueba de chi-cuadrado (Figura 3C). </li></ol> 7. Aislamiento de ARN, tratamiento DNasa, y comprobación de la calidad NOTA: Todos los reactivos (soluciones, recipientes de plástico) que se utiliza en los siguientes pasos debe estar libre de la actividad RNasa. Siempre use guantes y una capucha química para trabajar con disolventes orgánicos. <ol><li> Transferir el DEE limpia con una punta de micropipeta P20 revestido en 1,5 ml tubo. </li><li> Deje disipador de tejido para la parte inferior del tubo, retirar con cuidado PBS y sustituirla por 100 de reactivo de lisis de ARN l (suficiente para un máximo de 140 EAD). </li><li> Lyse tejido por agitación. En este punto, las muestras pueden ser congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C o directamente procesada con un protocolo de aislamiento de ARN estándar. NOTA: Las muestras de genotipos similares de múltiples rondas de disección se pueden agrupar en vez de reactivo de lisis de ARN. </li><li> Llenar el volumen de muestra de 0,9 ml con el reactivo de lisis de ARN. Añadir 0,2 ml de cloroformo y mezclar muestras Vigorously de 15-20 seg. </li><li> Después de 2-3 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferencia incoloro superior ARN que contiene la fase acuosa a un tubo nuevo sin perturbar la interfase. Manténgase alejado de la interfase, ya que contiene proteínas y ADN genómico. NOTA: El volumen recuperado debe ser aproximadamente 60% del volumen de reactivo de lisis de ARN usado para la homogeneización. </li><li> Precipitar el ARN mediante la adición de 0,5 ml de alcohol isopropílico. Vortex e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN una vez con 600 l de etanol al 75%. Después de un corto vórtice y centrifugación (10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C) deseche todo el etanol y dejar que el precipitado de ARN se seque al aire durante 5-10 minutos colocando el tubo abierto en un pañuelo de papel limpio limpie. NOTA: El sedimento de ARN podría ser visible como un pequeño opaca st / blancomadura en la parte inferior del tubo o invisible. Las gotas de etanol restantes pueden eliminarse cuidadosamente con la punta de la micropipeta P10. </li><li> Disolver ARN en 50 l de agua tratada con DEPC por agitación o solución que pasa varias veces a través de una punta de pipeta. </li><li> Para minimizar la contaminación con el ADN genómico, el tratamiento de RNA total con DNasa mediante la adición de 50 l de una mezcla que contiene 1 l de DNasa (2 U / l) y 10 l de 10x tampón de ADNasa en agua tratada con DEPC. Vortex y centrifugar. </li><li> Incubar las muestras a 37 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento durante 30 a 40 min. Después de la incubación, añadir 100 l de agua tratada con DEPC en cada muestra. </li><li> Para inactivar la actividad enzimática y el ARN limpia de DNasa, añadir 200 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) de la solución, de vórtice durante 1 min y centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> transferir con cuidado la fase acuosa superior que contiene el ARN en un tubo nuevo. Añadir un volumen igual (200 l)de cloroformo, mezclar y repetir el paso de centrifugación desde arriba. </li><li> Recoger cuidadosamente la fase superior y precipitar el ARN mediante la adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 preparado en DEPC H 2 O y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar bien con un vórtex. NOTA: La adición de 0,5 l de glucógeno (20 mg / l) a una mezcla de precipitación ayuda a visualizar el sedimento de ARN. Para minimizar la pérdida de ARN, utilizar tubos siliconados, bajo vinculante microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Precipitar ARN a -20 ° C durante al menos 1 hr. NOTA: La incubación puede llevarse a cabo durante la noche. Las muestras se pueden colocar a -80 ° C también. </li><li> ARN de pellets por centrifugación a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Lavar y sedimento seco siguiendo la descripción de 7,9. </li><li> Disolver ARN en 10-15 l de agua tratada con DEPC. ARN almacenar a -80 ° C. </li><li> Determinar la cantidad y pureza del ARN midiendo la DO a 230 nm, 260 nm y 280 nm usando un espectrofotómetro. Calcula ARN concentration mediante la aplicación de la convención de que 1 DO a 260 nm es igual a 40 mg / ml de ARN. NOTA: La relación A 260/280 de ARN &quot;puro&quot; es igual a 2,0, mientras que una relación A 260/230 debe estar en el rango de 2,0 a 2,2. Las muestras de ARN con una relación de A 260/280 entre 1,7 y 2,0 son adecuados para aplicaciones posteriores tales como la síntesis de ADNc. Para la preparación de bibliotecas de ARNm-seq la calidad y la cantidad de ARN se controlen mediante un sistema de electroforesis automatizada. La relación 28S / 18S debe estar por encima de 1,8. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Las técnicas para generar mosaicos genéticos en Drosophila son algunas de las herramientas más sofisticadas para el análisis y la manipulación de la función del gen 33. El sistema eyFLP-MARCM ha demostrado potente y robusto, ya que permite la inducción de, clones genéticamente definidos marcados visualmente de una manera restringida espacialmente, es decir, en los tejidos donde el potenciador sin ojos está activo 9,18. Esto es particularmente importante cuando las lesione...

El cáncer representa uno de los grupos más genéticamente heterogéneo de enfermedades, cuya incidencia y la mortalidad está aumentando de manera espectacular, sobre todo entre las personas de edad en todo el mundo. El cáncer se origina por clonación de una célula de iniciación de tumor que se escapa mecanismos supresores de tumores inherente y divide fuera de control. La acumulación gradual de las lesiones genéticas que cooperativamente promueven el crecimiento, la proliferación y la motilidad, mientras que la inhibición de la muerte y la diferenciación transforma el sobrecrecimiento benigno inicial en un tumor altamente maligno, metastásico y mortal. Se ha hecho evidente que además de las alteraciones genéticas, la progresión del tumor requiere cambios en el estroma circundante y diafonía entre los tipos de células tumorales y múltiple (por ejemplo, fibroblastos, células inmunes y endoteliales) en su microambiente. La comprensión de los principios moleculares que subyacen a la transformación maligna, incluyendo las interacciones del tumor-estroma es de gran importancia para el desarrollo de prevencióny las estrategias de detección temprana, así como tratamientos nuevos y efectivos para combatir la metástasis del cáncer y la resistencia a los medicamentos. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema atractivo para la investigación del cáncer de 1-4 debido a su tiempo de generación rápida, notable conservación de los nodos entre las moscas y los seres humanos, la redundancia genética limitada y la riqueza de herramientas genéticas avanzadas que facilitan la manipulación de casi cualquier gen en la señalización de manera temporal y espacialmente restringida. Tumores genéticamente definidas de malignidad variable pueden ser diseñados de forma reproducible en Drosophila mediante la introducción de ganancia y mutaciones de pérdida de función en un subconjunto de células progenitoras en un tejido de tipo salvaje de otro modo utilizando la técnica MARCM 5. La herramienta combina MARCM FLP / FRT (FLP recombinasa / FLP del prisma) mediada por recombinación mitótica 6 con FLP de salida 7 y GAL4 / UAS (Upstream Secuencia de Activación) 8 gen dianasistemas de expresión de 9. Con esta expresión método de cualquier transgén basada en UAS, incluyendo oncogén o ADNc de proteínas fluorescentes o repeticiones de ADN invertidas para el silenciamiento de genes inducido por dsRNA, se restringirá a un clon de células que han perdido un locus genético específico y un represor Gal4 debido a la recombinación (Figura 1A). Parches clonales marcados con fluorescente verde (GFP) o proteínas fluorescentes de color rojo (por ejemplo, RFP, DsRed, mCherry) puede ser fácilmente seguido en todo el desarrollo, aislado y analizado. Es importante destacar que, su comportamiento se puede comparar directamente con el tejido de tipo salvaje adyacente. Por lo tanto, las preguntas pertinentes a los efectos de células autónomas y no autónomas de lesiones genéticas pueden ser estudiadas convenientemente. Al igual que en los mamíferos, sólo los clones en los que las lesiones oncogénicas múltiples se combinan se vuelven malignas en Drosophila y recapitulan características principales de cáncer de mamífero. Ellos overproliferate, evadir la apoptosis, induce la inflamación, se convierten en inmortales y Invasiva, en última instancia, matar al anfitrión 10-17. A continuación, se describe un protocolo para generar tumores clonales genéticamente definidos en el tejido ocular / antenal y el cerebro de las larvas de Drosophila utilizando la técnica MARCM. El método se basa en un aparato de ensayo de la MARCM que expresa la recombinasa FLP de levadura bajo el control del potenciador sin ojos (eyFLP) 18,19. De esta manera, los clones GFP-etiquetados se generan tanto en el epitelio columnar peripodial y de la EAD y el neuroepitelio del cerebro a través de las etapas embrionarias y de larvas (Figura 1A, B y de referencia 20). Los clones pueden ser fácilmente seguidos hasta la edad adulta como el EAD se desarrolla en el ojo adulto, la antena y la cabeza de la cápsula mientras que el neuroepitelio da lugar a neuroblastos que producen las neuronas del lóbulo óptico diferenciadas. Para facilitar una amplia caracterización molecular y funcional y fenotípica del tejido de mosaico, que deescriba un protocolo para la disección de la EAD y el cerebro de la tercera estadio las larvas y delinear la forma de procesarlos para tres aplicaciones diferentes: (i) la detección de reporteros fluorescentes transgénicos y la inmunotinción, (ii) la cuantificación de la invasividad tumoral y (iii) el análisis de cambios de expresión génica utilizando una cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) o una secuencia de ARNm de alto rendimiento (mRNA-seq) (Figura 1C). El protocolo de la inmunotinción se puede utilizar para visualizar cualquier proteína de interés con un anticuerpo específico. Transgénicos reporteros transcripcionales fluorescentes proporcionan información espacio-temporal conveniente y preciso de la actividad de una vía de señalización particular. reporteros específicos de la célula de linaje, por otra parte, reflejan los cambios cualitativos y cuantitativos en las poblaciones de células dentro del tejido de mosaico y entre los tumores de los genotipos distintos. La cuantificación del comportamiento invasivo facilita la comparación de malignidad del tumor entre el genotipos. Por último, el protocolo de descripción de recogida y tratamiento de EAD mosaico para el aislamiento de ARN es adecuado tanto para aplicaciones posteriores a pequeña y gran escala, tales como la transcripción inversa seguida por QRT-PCR y en todo el genoma de mRNA-seq, respectivamente. Los datos cualitativos y cuantitativos obtenidos de estos ensayos proporcionan nuevos conocimientos sobre el comportamiento social de los tumores clonales. Además, producen una base sólida para estudios funcionales sobre el papel de los genes individuales, redes genéticos y microambiente tumoral en diferentes etapas y aspectos de la tumorigénesis.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&uuml; rzm&uuml; hle Brecht, Eggenstein, Alemania</td><td>00262-0500 Receta de comida para</td><td>moscas: Prepare 20 L de comida para moscas con 160 g de agar, 360 g de levadura, 200 g de harina de soja, 1,6 kg de harina de maíz amarillo, 1,2 L de extracto de malta, 300 ml de jarabe de maíz ligero, 130 ml de ácido propiónico y 200 ml de nipagin al 15%. La comida para moscas debe cocinarse durante 1 hora a 85 &nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Jarabe de maíz</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Alemania</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiónico</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Reforma de harina</td><td>de maízKontor GmbH, Zarrentin, Alemania</td><td>4010155063948</td> Extracto de <td></td></tr><tr><td>malta</td><td>CSM Deutschland GmbH, Bremen, Alemania</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Harina de soja</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Alemania</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Levadura</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Alemania</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Metil-4-benzoato/ Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>H5501</td><td>Prepare una solución madre al 15% con un 70%</td></tr><tr><td>de EtOH Viales de alimento para moscas Drosophila</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Alemania</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de viales</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Alemania</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de comida para moscas Drosophila</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Tapones para botellas</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Alemania</td><td>1002 S Poli</td><td></td></tr><tr><td>(alcohol vinílico) 4-88/[-CH2CHOH-]n</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>81381</td><td>Receta del medio de montaje: Disolver 6 g de poli(alcohol vinílico) 4-88 en 39&nbsp; ml de Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) y 12,5 ml de glicerol. Revuelva durante la noche a 50 &nbsp; &deg; C y centrífuga 20&nbsp; min a 5.000 rpm. Añadir DABCO al sobrenadante para obtener una concentración final del 2,5%. Almacene las alícuotas a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabicitilo[2.2.2]octano/ DABCO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 y 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 en Millipore H2O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Triton X-100 en PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehído/PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>158127</td><td>4% Receta de fijación de PFA: Disolver 4&nbsp; g de PFA en 80 ml de Millipore H2O en una placa agitadora magnética calentada a 55&nbsp; &deg;C. Añadir 1 M de NaOH gota a gota hasta que se disuelvan todas las partículas de PFA. Añadir 10 ml 10x PBS y ajustar el pH a 7,4 con 1 M de HCl. Mezclar en 100 &micro; l Triton X-100 y llénelo con Millipore H2O hasta 100 ml. Guarde las alícuotas a -20 °C. Evite la descongelación repetida. (PRECAUCIÓN: El PFA es altamente tóxico. Prepare el fijador de PFA en una campana extractora. Use un aparato de respiración autónomo, guantes y ropa. Evite el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas).</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>A3059</td><td>Receta de solución bloqueante: Disuelva el 0,3% de BSA en PBST</td></tr><tr><td>Faloidina marcada con fluorescencia</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Sondas moleculares</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Solución madre de faloidina: Disolver el polvo (300 U) en 1,5 ml de metanol. Almacenar a -20 &deg;C. Para la tinción, utilícelo en dilución 1:250 (A12379, A22283) y 1:100 (A22284) en PBST.</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol Dihidrocloruro/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania</td><td>6335</td><td>Solución de tinción DAPI: Prepare una solución madre de 5 mg/ml en Millipore H2O y almacene las alícuotas a 4 &deg;C. Utilizado en dilución 1:1,000 en PBST.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-H2 de ratón</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Utilizado en dilución 1:500 en solución bloqueante</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Reino Unido</td><td>715-175-151</td><td>Utilizado en dilución 1:500 en solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Placa de embrión de vidrio (30&nbsp; mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de tungsteno</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de alfiler niquelado</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24 x 50 mm (0.13-0.16&nbsp; mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de precisión Kimtech Science</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Olympus, Hamburgo, Alemania</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japón)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico fluorescente</td><td>Olympus, Hamburgo, Alemania</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japón) con cámara</td> <td>CCD DP72Equipado con el conjunto de filtros de paso de banda azul estrecho para la excitación de GFP, otros fluorocromos excitables azules (filtro de excitación BP460-480 nm, filtro de barrera BA495-540 nm) y filtro de barrera de excitación verde estrecho y paso largo para RFP y otros fluorocromos excitables verdes (filtro de excitación BP530-550, filtro de barrera BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus, Hamburgo, Alemania</td><td>FV1000</td><td>Equipado con microscopio IX81 invertido. Objetivos: 20 veces; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40 veces; UPlanFL (NA 1.30) y 60&times; UPlanApo (NA 1.35). Láseres: Diodo láser UV LD405 (50&nbsp; mW), Láser de argón, multilínea 457/(476)/ 488/515 (40&nbsp; mW), diodo láser amarillo/verde LD560 (15&nbsp; mW) y diodo láser rojo 635 (20&nbsp; mW). Software: Fluoview 2.1c Software</td></tr><tr><td>Drosophila incubadora refrigerada</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemania</td><td>&nbsp; Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Botella con atomizador</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mezclador</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>ELMI Agitador Mecedora Digital</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Reactivo de lisis Isol-RNA</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>2302700</td><td>El protocolo es compatible con otros reactivos basados en TRIzol, ejemplo, TRIreagent de Sigma (Cat. Nr.T9424), reactivo TRIzol de Thermofisher (Nº de cat. 15596).</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo/ DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>D5758</td><td>Diluir DEPC 1:1.000 en Millipore H2O, agitar durante la noche y esterilizar en autoclave.</td></tr><tr><td>Fenol ultrapuro:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNasa (2 U/&micro; l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio trihidrato</td><td>VWR, Darmstadt, Alemania</td><td>27652.232</td><td>Prepare una solución de acetato de sodio de 3 M con DEPC-H2O y ajuste el pH a 5,2</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td></td>109634</tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>100983</td><td>Prepare una dilución de EtOH al 75% con DEPC-H2O.</td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV/VIS NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf (refrigerada)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Estación de electroforesis automatizada Experion</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III transcriptasa inversa</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica</td><td></td><td>Prepare 100 &micro; M stock de soluciones en DEPC-H2O y almacene a -20 &0 &deg; C</td></tr><tr><td>dNTP Mezcla</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Francia</td><td>4030</td><td>Alícuotas de almacén de 25 &micro; l a -20 y grados; C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Placas de PCR rígidas de 96 pocillos, pared delgada</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Film</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>rp49 Imprimación directa</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica</td><td></td><td>5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'</td></tr><tr><td>rp49 Imprimación inversa</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica</td><td></td><td>5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Imprimación directa</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica</td><td></td><td>5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Imprimación inversa</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovaina, Bélgica</td><td></td><td>5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'</td></tr></tbody></table>

los<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral uso genético mosaicos

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster ha surgido como un poderoso sistema experimental para estudios funcionales y mecanicistas del desarrollo y la progresión tumoral en el contexto de un organismo completo. Las técnicas sofisticadas para generar mosaicos genéticos facilitan la inducción de clones marcados visualmente y genéticamente definidos rodeados de tejido normal. Los clones pueden ser analizados a través de diversos enfoques moleculares, celulares y ómicos. Este estudio describe cómo generar tumores clonales marcados con fluorescencia de diversa malignidad en los discos imaginales oculares/antenales (EAD) de larvas de Drosophila utilizando la técnica de Análisis de Mosaico con un Marcador de Células Represibles (MARCM). Describe los procedimientos, cómo recuperar el mosaico de EAD y el cerebro de las larvas y cómo procesarlos para obtener imágenes simultáneas de reporteros transgénicos fluorescentes y tinción de anticuerpos. Para facilitar la caracterización molecular del tejido mosaico, describimos un protocolo para el aislamiento de ARN total del EAD. El procedimiento de disección es adecuado para recuperar EAD y cerebros de cualquier etapa larvaria. El protocolo de fijación y tinción para discos imaginales funciona con una serie de reporteros transgénicos y anticuerpos que reconocen las proteínas de Drosophila. El protocolo para el aislamiento de ARN se puede aplicar a varios órganos larvarios, larvas enteras y moscas adultas. El ARN total se puede utilizar para la elaboración de perfiles de cambios en la expresión génica mediante enfoques candidatos o de todo el genoma. Por último, detallamos un método para cuantificar la invasividad de los tumores clonales. Aunque este método tiene un uso limitado, su concepto subyacente es ampliamente aplicable a otros estudios cuantitativos en los que se debe evitar el sesgo cognitivo.

Para demostrar el potencial de la técnica eyFLP-MARCM para generar parches GFP-marcado de los genotipos definidos en Drosophila EAD, se indujeron tres tipos de clones: (1) control que expresa solamente GFP, (2) los tumores malignos que expresan una forma oncogénica de la pequeña G-proteína Ras (Ras V12) en un fondo de la pérdida homocigótica de un garabato gen supresor de tumor (scrib 1), y (3) sobrecrecimiento pero no invasiva ras <su...

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo diseccionar los discos imaginales ojo-antena de drosófila y cerebros que portan clones marcados con fluorescencia y definidos genéticamente, y cómo procesarlos para visualizar y cuantificar cambios en la expresión génica y la invasividad celular. Los procedimientos descritos pueden ayudar a obtener nuevos conocimientos sobre el papel de los genes en el desarrollo epitelial, la homeostasis o las enfermedades, y a desentrañar los mecanismos subyacentes a su competencia, proliferación compensatoria o cooperación interclonal. La principal ventaja del estudio es que proporcionamos un conjunto completo de protocolos adaptados para el análisis cualitativo y cuantitativo detallado de los mosaicos genéticos de drosófila.Generalmente, las personas que comienzan a trabajar con el modelo de Drosophila tienen dificultades porque no pueden reconocer el disco imaginario ojo-antenal entre los otros discos imaginarios. Para facilitar el reconocimiento del disco imaginario ojo-antenal que porta clones marcados con fluorescencia dentro del cuerpo de la larva, se recomienda realizar las disecciones iniciales bajo un microscopio de fluorescencia. El análisis de mosaicismo con un marcador celular represible, o MARCM, permite la generación de parches clonales genéticamente definidos en un contexto fenotípicamente silvestre.Una FLP impulsada por un promotor eyeless cataliza la recombinación entre dos elementos FRT que delimitan una caja de paro marcada con un gen amarillo. Después de la replicación del ADN, FLP cataliza el intercambio de cromátidas no hermanas entre los cromosomas homólogos, generando cromátidas hermanas: una que porta el alelo silvestre y el represor Gal80, y la otra el alelo mutante.En la mitosis, estos se separan para producir dos células hijas, una de las cuales es mutante homocigótica y la otra de tipo silvestre. La pérdida del represor Gal80 permite la expresión de GFP en el mutante, mientras que las células de tipo silvestre permanecen negativas para GFP. Para comenzar el experimento, recolecte larvas mosáicas rociando PBS dentro del frasco de moscas hasta cubrir la superficie del alimento.Luego, ablande la capa superior con una espátula y vierta la mezcla de alimento que contiene larvas en una placa de Petri. Seleccione cuidadosamente las larvas y transfiéralas a una placa para embriones llena con PBS. Recopile al menos 20 larvas para inmunomarcado y 80 larvas para la cuantificación de la invasividad tumoral.Lave las larvas con PBS para eliminar todos los restos de alimento. Mediante un microscopio estereoscópico fluorescente a una magnificación de 8:16x, identifique y deseche todas las larvas leopard, que son aquellas que muestran puntos positivos para GFP distribuidos al azar por todo el cuerpo. Coloque la placa que contiene las larvas restantes en PBS sobre hielo hasta la disección.Para diseccionar el disco imaginal ojo-antena bajo el microscopio estereoscópico, use un par de pinzas y tome suavemente la larva aproximadamente a 2/3 de la longitud del cuerpo posterior a la cabeza. Con el segundo par de pinzas, agarre los ganchos bucales de la larva y tírelos hacia afuera del cuerpo. Usando las pinzas, separe los ganchos bucales del cutículo superpuesto y de tejidos accesorios como las glándulas salivales y el cuerpo graso.Alternativamente, para preparar el complejo de disco ojo-antena y cerebro manteniendo intacto el cordón nervioso ventral, use pinzas para cortar una larva en la mitad del cuerpo. Descarte la mitad posterior. Sujete la mitad anterior del cuerpo larval con las puntas de un par de pinzas y luego invierta la larva desde adentro hacia afuera empujando los ganchos bucales hacia adentro con la punta del segundo par y enrollando la cutícula sobre ellos con el primer par de pinzas.Retire cuidadosamente todos los tejidos extraños, incluyendo el intestino, el cuerpo graso y las glándulas salivales. Tire suavemente de los ganchos bucales para separarlos de la cutícula. Libere el complejo cerebro-disco ojo-antenal unido a los ganchos bucales cortando las proyecciones axónicas que se extienden desde el cordón nervioso ventral hacia los músculos y la epidermis.Para transferir el tejido, primero recubra una punta de micropipeta P20 aspirando y expulsando varias veces los restos de cuerpos. Luego utilice la misma punta para transferir el tejido diseccionado. Para transferir complejos más grandes del disco ojo-antenal y cerebro, corte previamente la punta de la P20 para agrandar la abertura. Fije las muestras en 400 microlitros de fijador al 4 % PFA durante 25 minutos a temperatura ambiente mientras se agitan suavemente.Luego, elimine el fijador y lave las muestras con PBST tres veces durante 10 minutos con agitación suave. A continuación, sustituya el PBST por 500 micro-litros de solución de tinción con DAPI y agite suavemente durante 15 minutos en la oscuridad. Lave el tejido una vez durante 10 minutos con PBST.Para completar la disección, utilice una pipeta de un mililitro para transferir el tejido nuevamente a una placa de vidrio con PBS. Usando dos pares de pinzas, separe los cerebros que se utilizarán para la cuantificación de la invasividad de los discos ojo-antenal cortando los tallos ópticos. Libere los discos ojo-antenal recortándolos de los ganchos bucales.Coloque una gota de medio de montaje sobre un portaobjetos y, con pinzas, distribuya el líquido en una capa delgada. Para cuantificar la invasividad, coloque al menos 80 cerebros fijados intactos de cada genotipo sobre un solo portaobjetos. Enderece y coloque el tejido según lo deseado.Toque suavemente un borde de la cubreobjetos al medio y bájela lentamente con la ayuda de pinzas para evitar la formación de burbujas. Utilice un paño de laboratorio para absorber el exceso de medio de montaje en los bordes. Ahora el tejido puede examinarse mediante imágenes confocales.Pida a una parte neutral que anonimice las láminas para que la puntuación sea imparcial. Además, haga que al menos dos investigadores evalúen las láminas de forma independiente. Revele los genotipos solo después de que se complete la puntuación.Evalúe el grado de malignidad bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con un conjunto de filtros GFP. Utilice un marcador para etiquetar los cerebros que ya han sido observados, con el fin de evitar contarlos dos veces. Las imágenes confocales fluorescentes muestran cerebros disecados de larvas que portan tumores malignos clonales GFP-etiquetados, mutantes para RAS V12 y scribble, teñidos con DAPI.Los paneles representan los cuatro grados diferentes de invasividad tumoral. La cuantificación imparcial reveló que la inhibición de la señalización de JNK y los clones de RAS V12 scribbled suprimieron la invasividad tumoral. En discos ojo-antenal de control, el reportero sensible a JNK TRE-DsRED marca solo una franja estrecha de células que se extiende desde la parte antenal hasta la parte ocular.En contraste, la actividad de TRE-DsRED se vio notablemente aumentada en los tumores malignos clonales GFP-positivos. Al día 8, las células tumorales sobrepasaron los discos oculares-antennales y se extendieron hacia la cuerda nerviosa ventral. Las células tumorales invasoras también mostraron una activación aumentada de JNK en comparación con el tejido circundante.Aunque bloquear JNK redujo claramente la actividad de TRE-DsRED en los clones tumorales, aumentar la intensidad del láser reveló una mejora en las células epiteliales vecinas a los clones. Además, un reportero hemolectina delta DsRED mostró que, a diferencia de algunos cúmulos de hemocitos encontrados en las hendiduras del epitelio antenal-control, los hemocitos se acumularon en el tejido antenal y cerebral compuesto por tumores malignos. Tras la inhibición de JNK, el número de células inmunitarias asociadas disminuyó drásticamente.El aumento de la invasividad tumoral, la actividad de JNK y la infiltración de hemocitos estuvieron acompañados por una regulación positiva significativa de MMP1 mNRA, determinada mediante QRTPCR utilizando ARN total aislado de discos ojo-antenal mosaicos diseccionados. Una vez dominado, es posible diseccionar más de 60 pares de discos oculares y cerebros en 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar generar un número suficiente de larvas con los genotipos deseados.Sea rápido pero preciso durante la disección para mantener las muestras destinadas al aislamiento de ARN libres de ARNasa. Tras el procedimiento de disección, se puede utilizar el inmunoblot (western blot) como alternativa a la inmunotinción para evaluar los cambios en la expresión proteica entre diferentes genotipos. La creación de mosaicos genéticos y su análisis mediante los procedimientos descritos permite investigar mutaciones letales y los mecanismos de cooperación oncogénica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar tejidos mosaicos del disco ojo-antenal y cerebros de larvas de tercer estadio, así como de cómo procesarlos para inmunotinción, visualización de actividad transgénica y de promotores, extracción de ARN y cuantificación de la invasividad.Téngase en cuenta que el PFA, así como el fenol-cloroformo y el DAPI, son altamente tóxicos y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y ropa protectora, al manipular estos agentes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

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El uso de PCR cuantitativa, se demuestra cómo la bien establecida chica modelo CAM se puede utilizar para analizar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas a órganos distantes.

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Hemos desarrollado modelos 3D para el cocultivo de células vivas imágenes en tiempo real de las interacciones entre las células tumorales de mama y otras células en el microambiente que afectan la progresión a un fenotipo invasivo. Estos modelos pueden servir como pantallas preclínicos de los medicamentos que se dirigen a paracrinos inducidos por las vías proteolíticas, quimiocinas / citocinas y la quinasa implicados en la invasión.

MAME Modelos de 4D Live de células de imagen de un tumor: Interacciones microambiente que la progresión maligna del impacto

Cooperación entre un oncogén activado como RAS V12 y las mutaciones en los genes de polaridad celular como garabateado, resultar en el crecimiento tumoral en Drosophila donde las células tumorales también muestran comportamientos invasivos. Aquí se presenta un protocolo sencillo para la inducción y la observación de los tumores benignos y invasivos.

Un protocolo para la inducción genética y visualización de tumores benignos y invasoras en cefálica Complejos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

El objetivo de este estudio es demostrar cómo se puede utilizar la estrategia de transgénesis en mosaico en pez cebra para evaluar rápida y eficientemente las contribuciones relativas de múltiples oncogenes en la iniciación y progresión tumoral in vivo.

Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

El análisis de clones mosaicos en el epitelio discal imaginario de Drosophila es un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. Aquí se describe un protocolo para inducir tumores en Drosophila ala imaginal discos utilizando el sistema GAL4-UAS, e introducir un método de diagnóstico para clasificar los tumores fenotipos.

Inducción y diagnóstico de tumores en<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epitelio

Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.

Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Este protocolo proporciona una guía detallada para el alotrasplante generacional inicial y continuo de tumores de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos para estudiar diversos aspectos de la neoplasia. Utilizando un aparato autoinyector, los investigadores pueden lograr una mejor eficiencia y rendimientos tumorales en comparación con los logrados por los métodos manuales tradicionales.

Alotrasplante tumoral en Drosophila melanogaster con un inyector autononalquilador programable

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.

Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente

Aprende a disecar discos imaginales oculares y cerebros de Drosophila para visualizar y cuantificar cambios en la expresión génica e invasividad tumoral. Este protocolo utiliza análisis de mosaicos MARCM para estudiar mecanismos de desarrollo epitelial y homeostasis.

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