los Drosophila Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo diseccionar los discos imaginales y cerebros de las antenas oculares de Drosophila, portadores de clones genéticamente definidos con fluorescencia y cómo procesarlos para visualizar y cuantificar los cambios en la expresión génica y la invasividad celular. Los procedimientos descritos pueden ayudar a proporcionar nuevos conocimientos sobre el papel de los genes y el desarrollo epitelial, la homeostasis o la enfermedad, y a diseccionar los mecanismos que subyacen a su competencia, proliferación compensatoria o corporación interclonal. La principal ventaja del estudio es que proporcionamos un conjunto completo de protocolos adaptados para el análisis cuantitativo y cualitativo en profundidad de los mosaicos genéticos de Drosophila.

Por lo general, los individuos que trabajan con el modelo de Drosophila tienen dificultades porque no pueden reconocer el disco imaginal ojo-antena del otro disco imaginal. Para facilitar el reconocimiento de los discos imaginales oculares con clones marcados fluorescentes dentro del cuerpo de la larva, se recomienda realizar las disecciones iniciales bajo un microscopio fluorescente. El análisis en mosaico con un marcador celular reprimible o MARCM permite la generación de parches clonales definidos genéticamente en un contexto fenotípicamente salvaje.

Una FLP impulsada por un promotor sin ojos cataliza la recombinación entre dos elementos FRT que flanquean un casete de parada marcado con un gen amarillo. Después de la replicación del ADN, FLP cataliza el intercambio de las cromátidas no hermanas entre los cromosomas homólogos generadores de cromátidas hermanas. Uno portador del alelo de tipo salvaje y represor Gal80 y el otro el mutante.

En la mitosis, estas se segregan para producir dos células hijas, una que es un mutante homocigoto y la otra de tipo salvaje. La pérdida del represor Gal80 permite la expresión de GFP en el mutante, mientras que las células de tipo salvaje permanecen GFP negativas. Para comenzar el experimento, coseche las larvas de mosaico rociando PBS en la botella de moscas para cubrir la superficie de la comida.

A continuación, ablande la capa superior con una espátula y vierta la lechada de comida que contiene larvas en una placa de Petri. Recoja suavemente las larvas y transfiéralas a una placa de embriones llena de PBS. Recolectar al menos 20 larvas para inmunotinción y 80 larvas para cuantificar la invasividad tumoral.

Lave las larvas con PBS para eliminar todos los residuos de comida. Usando un microscopio estereoscópico fluorescente con un aumento de 8:16x, identifique y descarte todas las larvas de leopardo, que son las que muestran puntos positivos aleatorios de GFP en todo el cuerpo. Coloque el plato que contiene las larvas restantes en PBS sobre hielo hasta la disección.

Para diseccionar el disco imaginal ojo-antena bajo el microscopio estereoscópico, use un par de pinzas y agarre suavemente la larva a aproximadamente 2/3 de la longitud del cuerpo posterior a la cabeza. Con el segundo par de pinzas, agarre los ganchos bucales de las larvas y retírelas del cuerpo. El uso de pinzas desenreda los ganchos bucales de la cutícula superpuesta y el tejido extraño, como las glándulas salivales y el cuerpo graso.

Alternativamente, para preparar el complejo cerebro, el disco ocular y antenal, manteniendo intacto el cordón nervioso ventral, use fórceps para cortar una larva en el centro del cuerpo. Deseche la mitad posterior. Sostenga la mitad anterior del cuerpo de la larva con las puntas de un par de pinzas, luego voltee la larva al revés empujando los ganchos bucales hacia adentro con la punta del segundo par y enrollando la cutícula sobre ella con el primer par de pinzas.

Retire con cuidado todo el tejido extraño, incluyendo el intestino, el cuerpo graso y las glándulas salivales. Tira suavemente de los ganchos bucales para separarlos de la cutícula. Libera el complejo cerebro, el disco ocular y antena unido a los ganchos bucales cortando las proyecciones axonales que se extienden desde el cordón nervioso ventral hasta los músculos y la epidermis.

Para transferir el tejido, primero recubra una punta de micropipeta P20 pipeteando los cadáveres restantes del cuerpo hacia arriba y hacia abajo varias veces y, a continuación, utilice la misma punta para transferir el tejido disecado. Para transferir complejos cerebrales de disco ojo-antena más grandes, precorte la punta P20 para ampliar la abertura. Fije las muestras en 400 microlitros de fijador de PFA al 4% durante 25 minutos a temperatura ambiente mientras nuta.

A continuación, retire el fijador y lave las muestras con PBST tres veces durante 10 minutos con nutación. A continuación, sustituya el PBST por 500 microlitros de solución de tinción DAPI y nutato durante 15 minutos en la oscuridad. Lave el pañuelo una vez durante 10 minutos con PBST.

Para completar la disección, use una pipeta de un mililitro para transferir el tejido de nuevo a un plato de vidrio lleno de PBS. Con el uso de dos pares de pinzas, separe los cerebros que se utilizarán para la cuantificación de la invasividad de los discos oculares y antenales cortando los tallos ópticos. Libere los discos de las antenas oculares recortándolos de los ganchos bucales.

Coloque una gota de medio de montaje en un portaobjetos abductivo y, con pinzas, distribuya el líquido en una capa delgada. Para cuantificar la invasividad, coloque al menos 80 cerebros intactos fijos para cada genotipo en un solo portaobjetos. Endereza y coloca el tejido como desees.

Toque suavemente un borde de un cubreobjetos con el medio y bájelo lentamente con la ayuda de pinzas para evitar la creación de burbujas. Utilice una toallita de laboratorio para absorber el exceso de medio de montaje en los bordes. El tejido ahora se puede examinar mediante imágenes confocal.

Pídele a una parte neutral que anonimice las diapositivas para que la puntuación sea imparcial. Y que las diapositivas sean evaluadas de forma independiente por al menos dos investigadores. Divulgue los genotipos solo después de que se complete la calificación.

Evaluar el grado de malignidad bajo un microscopio estereoscópico fluorescente equipado con un juego de filtros GFP. El uso de un marcador etiqueta los cerebros que ya se han visto para evitar el doble conteo. Las imágenes confocales fluorescentes muestran cerebros disecados de larvas portadoras de tumores clonales malignos marcados con GFP con mutación de garabatos RAS V12 teñidos con DAPI.

Los paneles representan los cuatro grados diferentes de invasividad tumoral. La cuantificación no sesgada reveló que la inhibición de la señalización de JNK y RAS V12 garabateado por un clon suprimió la invasividad tumoral. En los discos de control ojo-antena, el reportero TRE-DsRED sensible a JNK etiqueta solo una estrecha franja de células que va desde la antena hasta la parte ocular.

Por el contrario, la actividad de TRE-DsRED aumentó notablemente en los tumores clonales malignos positivos para GFP. Para el día 8, las células tumorales crecieron más allá de los discos de las antenas oculares y se diseminaron al cordón nervioso ventral. Las células tumorales invasoras también mostraron una mayor activación de JNK en comparación con el tejido circundante.

Mientras que el bloqueo de JNK redujo claramente la actividad de TRE-DsRED en los clones tumorales, el aumento de la intensidad del láser reveló una mejora en las células epiteliales vecinas a los clones. Además, un indicador de hemolectina delta DsRED mostró que, en contraste con unos pocos grupos de hemocitos encontrados en las hendiduras del epitelio ocular de control, los hemocitos se acumularon en el tejido ocular y cerebral compuesto por tumores malignos. Tras la inhibición de JNK, el número de células inmunitarias asociadas disminuyó drásticamente.

El aumento de la invasividad tumoral, la actividad de JNK y la infiltración de hemocitos se acompañaron de una regulación positiva significativa del ARNm de MMP1 según lo determinado por QRTPCR utilizando ARN total aislado de discos oculares y antenales en mosaico disecados. Una vez dominados, se pueden diseccionar más de 60 pares de discos oculares y cerebros en 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar generar un número suficiente de larvas de los genotipos deseados.

Sea rápido pero preciso al diseccionar para mantener las muestras destinadas al aislamiento de ARN libres de RNS. Después del procedimiento de disección, el Western blot se puede utilizar como alternativa a la inmunotinción para evaluar los cambios en la expresión de proteínas entre diferentes genotipos. La creación de mosaicos genéticos y su análisis con los procedimientos descritos permite la investigación de mutaciones que de otro modo serían letales y de los mecanismos de la corporación de oncogenes y la corrosión de los genes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar los tejidos del mosaico del disco antena ocular y el cerebro de las larvas del tercer estadio y cómo procesarlos para la inmunotinción, la visualización de la actividad transgénica y portuaria, Extracción de ARN y cuantificación de la invasividad.

Recuerde que el PFA, así como el fenol-cloroformo y el DAPI, son altamente tóxicos y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y ropa protectora, mientras se trabaja con estos agentes.