Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero
September 17th, 2016
El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.
El objetivo general de este ensayo es determinar el período circadiano en las líneas de Arabidopsis midiendo la luminiscencia emitida por los protoplastos transfectados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología circadiana, como qué genes retroalimentan el propio mecanismo de cronometraje. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis rápido del periodo circadiano de cualquier mutante de Arabidopsis sin necesidad de generar líneas transgénicas estables.
Para comenzar este procedimiento, etiquete una placa de Petri y agréguele 10 mililitros de solución enzimática esterilizada filtrada. Fije cuatro tiras de cinta adhesiva para autoclave con el lado adhesivo hacia arriba sobre una superficie de laboratorio limpia y marque el tamaño de la placa de Petri en las tiras. Recoge los planos de la sala de crecimiento.
Corta las hojas de las plantas de cuatro semanas y presiona la epidermis superior sobre la cinta de autoclave, de modo que la superficie epidérmica inferior quede hacia arriba. Coloque tiras de cinta adhesiva mágica en la superficie epidérmica inferior. Con un tubo cónico de 15 mililitros, presione suavemente las tiras sobre las hojas, teniendo cuidado de no aplastar el tejido de la hoja.
Retire con cuidado la cinta para pelar la epidermis inferior y exponer las células del mesófilo. A continuación, corte la cinta de autoclave para que se ajuste a la placa de Petri y use pinzas para mover la cinta a la placa de Petri y hacerla flotar sobre la solución enzimática, con las hojas hacia abajo. Gire a 60 RPM en un agitador de plataforma durante 60 minutos, durante los cuales los protoplastos se liberarán en la solución.
Después de 60 minutos, use pinzas para quitar y desechar las tiras de cinta de autoclave. Con una punta de pipeta de diámetro ancho, pipetee la solución que contiene los protoplastos en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar los protoplastos a 100 gee durante tres minutos a cuatro grados centígrados, y retirar el sobrenadante con cuidado, ya que el pellet está muy suelto.
Agregue 10 mililitros de solución W5 a los protoplastos y vuelva a suspender agitando suavemente el tubo. Retire una alícuota de protoplastos para contar. Deje reposar los protoplastos en hielo durante 30 a 60 minutos.
Mientras los protoplastos están en hielo, evalúe el rendimiento contando los protoplastos en un hemocitómetro. Recoja los protoplastos por centrifugación a 100 gee durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante con cuidado, ya que el pellet está muy suelto.
Por último, resuspender los protoplastos en una solución de MMg hasta una concentración de 500.000 protoplastos por mililitro. Comience el procedimiento para la transfección de protoplastos agregando diez microlitros de plásmido reportero a un tubo cónico de 15 mililitros, seguido de 400 microlitros de protoplastos. Agregue un volumen de solución de polietilenglicol, o PEG, y mezcle invirtiendo el tubo suavemente 12 veces para transfectar los protoplastos.
Incubar durante ocho a 15 minutos a temperatura ambiente. Los protoplastos deben incubarse el tiempo suficiente para garantizar una transfección eficiente, pero no demasiado, ya que eso reducirá su viabilidad. A continuación, diluya la mezcla de PROTOPLAST DNA PEG con cuatro volúmenes de solución W5 y mezcle invirtiendo suavemente seis veces.
Recoja los protoplastos transfectados por centrifugación a 100 gee durante dos minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con una pipeta, de nuevo teniendo mucho cuidado ya que el pellet está muy suelto. Vuelva a suspender los protoplastos en 1.250 microlitros de solución de imagen.
Los protoplastos deben resuspenderse con bastante facilidad, lo que indica que están intactos después de la transfección. Alícuota 200 microlitros por pocillo en seis pocillos replicados de una placa de 96 pocillos, y llene los pocillos vacíos con solución W5. Selle la placa con una tapa transparente adhesiva adecuada para imágenes luminiscentes.
Para obtener imágenes de los protoplastos, transfiera la placa de 96 pocillos a cualquier configuración de imágenes luminiscentes adecuada para la obtención de imágenes de plantas. Cambie la tapa adhesiva de la placa de 10 a 15 minutos después de la transferencia para evitar la condensación y las diferencias de presión entre los pocillos. Empieza a tomar imágenes.
Lea el plato cada 45 minutos durante cinco días a temperatura ambiente. Posteriormente, analice los resultados de luminiscencia utilizando cualquier software de análisis, por ejemplo, el Sistema de software de análisis de ritmos biológicos. Los protoplastos mesófilos aislados por este protocolo se muestran en esta imagen con un aumento de 200 veces.
Los proplastos son arabidopsis de tipo salvaje y el mutante cca1/lhy fueron transfectados y fotografiados en luz constante en un lector de placas durante cinco días. Como era de esperar, el período de funcionamiento libre de la expresión génica controlada por reloj se acorta en este mutante. Por el contrario, se alarga el período de oscilaciones circadianas en los protoplastos del mutante ztl.
En los protoplastos que sobreexpresan CCA1, no hubo oscilaciones en la expresión del constructo reportero porque la sobreexpresión de CCA1 conduce a la arritmia. Este gráfico de barras muestra las estimaciones del período circadiano basadas en trazas de luminiscencia en los protoplastos de tipo salvaje y mutantes de reloj. Estos períodos circadianos son consistentes con los datos publicados generados a partir de plantas enteras utilizando enfoques transgénicos que consumen mucho tiempo.
Al intentar este procedimiento, es importante utilizar plantas sanas y manipular los protoplastos con cuidado, ya que son frágiles. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, transfectar e obtener imágenes de los protoplastos de Arabidopsis.
Estas técnicas ahora se pueden aplicar a cualquier línea mutante, o incluso modificarse para obtener imágenes de protoplastos de otras especies de plantas.
Visión general
Este estudio presenta un método para evaluar fenotipos circadianos en Arabidopsis mediante la obtención de imágenes luminiscentes de protoplastos. La técnica permite un análisis rápido de los períodos circadianos en varias líneas mutantes sin necesidad de líneas transgénicas estables.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología circadiana
- Fisiología vegetal
- Análisis genético
Antecedentes
- El reloj circadiano influye en una parte significativa del transcriptoma de Arabidopsis.
- Entender qué genes contribuyen a la cronometría es crucial para la biología circadiana.
- Los métodos tradicionales requieren líneas transgénicas estables, que son costosas en tiempo.
- Este nuevo método simplifica el proceso utilizando reporteros circadianos expresados transitoriamente.
Propósito del estudio
- Determinar el período circadiano en líneas de Arabidopsis.
- Identificar genes que retroalimentan el mecanismo de cronometría circadiana.
- Proporcionar un método rápido y eficiente para analizar los ritmos circadianos en líneas mutantes.
Métodos utilizados
- Aislamiento de protoplastos de mesofilo de hojas de Arabidopsis.
- Transfección de protoplastos con un reportero circadiano luminiscente.
- Medición de luminiscencia para evaluar los ritmos circadianos.
- Análisis de datos de luminiscencia utilizando software especializado.
Principales resultados
- Demostró la capacidad de medir períodos circadianos en varios mutantes de Arabidopsis.
- Confirmó que el mutante cca1/lhy exhibe un período libre de ejecución acortado.
- Demostró que el mutante ztl tiene un período de oscilación circadiana prolongado.
- Validó el método frente a los enfoques transgénicos tradicionales.
Conclusiones
- Este método permite una evaluación rápida de los ritmos circadianos en Arabidopsis.
- Puede aplicarse a cualquier línea mutante, mejorando la investigación en biología circadiana.
- Las futuras aplicaciones pueden extenderse a otras especies de plantas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Rapid phenotyping of circadian clock function in Arabidopsis protoplasts using luminescent reporters enables accelerated target validation and mechanistic de-risking in plant biology R&D. This approach streamlines the assessment of genetic perturbations on circadian regulation, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. The method's flexibility allows broad portfolio screening without the bottleneck of generating stable transgenic lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in circadian regulation through transient reporter assays.
- Facilitates rapid biological de-risking by distinguishing mutants with altered clock phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection by providing quantitative period measurements.
- Accelerates portfolio triage by allowing high-throughput mutant screening.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protoplast-based systems for downstream functional genomics workflows.
- Delivers standardized, reproducible luminescent readouts for quantitative assay development.
- Enables scalable screening of diverse genetic backgrounds without stable transformation.
- Supports reliable evaluation of gene perturbations in a controlled environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking gene function to circadian outputs.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation in plant systems.
- Reduces risk in advancing candidates by confirming mechanistic impact on clock function.
- Offers predictive de-risking for traits relevant to agricultural productivity.
Pipeline & Workflow Integration
This luminescent protoplast assay fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional screening before resource-intensive transgenic work.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function in circadian regulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative luminescence data for comparative analysis.
- Analytics: Generates time-series outputs suitable for statistical period estimation and phenotype classification.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in plant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse mutant and species backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible phenotyping workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency in early R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protoplast isolation, transfection, and luminescent imaging.
- Needs access to plate-based luminescence readers and compatible analysis software.
- Demands careful handling and standardization to ensure protoplast viability and data quality.
- Adaptable to other plant species with protocol optimization.
- Limited by the transient nature of reporter expression and protoplast stability.
