Name: Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a analizar fenotipos circadianos en Arabidopsis mediante protoplastos transfectados con un reportero luminiscente. Este método permite evaluar rápidamente períodos circadianos sin necesidad de líneas transgénicas estables.

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Nos gustaría agradecer al Prof. David Somers y al Dr. Jeongsik Kim por el plásmido reportero de luciferasa y el desarrollo inicial del método. La Prof. Karen Halliday amablemente proporcionó todas las líneas de mutantes circadianos utilizadas en este estudio. Esta investigación fue apoyada por las becas de investigación de la Royal Society RS120372 y RS140275. GvO es miembro de investigación de la Royal Society University (UF110173).

NOTA: En este protocolo, los reactivos y los volúmenes descritos se expresan por línea de Arabidopsis que se prueba, y dará lugar a seis pocillos replicados para que el genotipo. Multiplicar los materiales con el número de líneas que deben analizarse en el análisis de más de una línea. En el video, de tipo salvaje de Arabidopsis se comparará con el reloj circadiano ZTL línea mutante (aunque se proporcionarán los resultados representativos de las líneas adicionales posteriormente). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> solución de la enzima </td><td></td></tr><tr><td> celulasa </td><td> 0.5% (w / v) </td></tr><tr><td> pectinasa R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solución W5 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solución MMg </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solución de PEG </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solución de imagen </td><td></td></tr><tr><td> solución W5 </td><td> hasta el volumen final </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> luciferina </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> ampicilina </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Lista de soluciones. 1. Preparación de Materiales y búferes <ol><li> Materiales de plantas <ol><li> Mantenga Arabidopsis Col -0 semillas en agua en un tubo de 1,5 ml a 4 ° C en la oscuridad durante cuatro días. Pipetear las semillas al suelo, goteo en una olla y transferir a las condiciones de día largo (16 horas de luz 8 h de oscuridad) a 21 ° C durante 7 días. Deja un tapa en la olla durante los tres primeros días para asegurar una alta humedad. Trasplante de plántulas de seis a una nueva olla de 8 cm x 13 cm x 5 cm y seguir creciendo las plantas en las mismas condiciones para another 21 días. Asegúrese de que el suelo está húmedo en todo momento. </li></ol></li><li> plásmido reportero <ol><li> Se purifica el CCA1pro: reportero plásmido LUC 19 de cultivo bacteriano con antelación, utilizando un kit de aislamiento de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Se requiere 20 mg plásmido indicador (10 l a 2 mg / l de dH 2 O) para una transfección. </li></ol></li><li> soluciones NOTA: Para este protocolo se necesitan cinco soluciones: Solución de la enzima, la solución de lavado 5 (W5) solución, manitol-magnesio (MMg), polietilenglicol (PEG) solución y solución de imágenes (Tabla 1). Preparar estos antes de pasar a la etapa de aislamiento de protoplastos. <ol><li> Preparar 10 ml de solución de enzima según la Tabla 1, la adición de las enzimas pasado, y el filtro de esterilizar la solución a través de un filtro de 0,22 micras jeringa. </li><li> Preparar las soluciones restantes en los siguientes volúmenes: 15 ml de solución W5, 10 ml MMg slución, 1 ml de solución de PEG y solución de imagen de 1,5 ml según la Tabla 1. NOTA: Es importante que la solución de PEG se preparó no menos de una hora antes de la transfección para asegurar que el PEG se ha disuelto completamente. Filtro de esterilizar la solución de imagen a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figura 1:. Aislamiento de protoplastos Las hojas de las plantas de Arabidopsis adultos (A) se fija en cinta de autoclave con la capa epidérmica inferior hacia arriba (B). (C) cinta mágica se presiona suavemente sobre la capa epidérmica inferior con la punta de un tubo cónico de 15 ml. (D) La cinta mágica se quita para exponer las células del mesófilo (E). (F) Las tiras de cinta de autoclave con licencias adjuntos están flotando en la solución de enzima que contiene celulasa y pectinasa, la liberación de protoplastos en la solución. (G) La hoja de esqueletos permanecen en la cinta autoclave después de la digestión enzimática y se descartan, dejando a los protoplastos en solución de enzima (H). (I) protoplastos de mesófilo resultantes finales (Barra de escala = 50 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Aislamiento de protoplastos <ol><li> Etiqueta de una placa de Petri y añadir 10 ml de solución de enzima esterilizada por filtración. </li><li> Fijar cuatro tiras de cinta de autoclave con la cara adhesiva hacia arriba en una superficie de laboratorio limpia, y marcar el tamaño de la placa de Petri en las tiras. </li><li> Cortar las hojas de 4 semanas de edad plantas (Figura 1a), y presione la epidermis superior a la cinta de autoclave (es decir, la superficie epidérmica inferior hacia arriba ( <strong&gt; Figura 1b)). </li><li> Presione suavemente tiras de cinta mágica sobre la superficie epidérmica inferior utilizando un tubo cónico de 15 ml. Tenga cuidado de no aplastar el tejido de la hoja (Figura 1c). Tire con cuidado la cinta mágica fuera para despojar a la epidermis inferior (Figura 1d) y exponer las células del mesófilo (Figura 1e). </li><li> Cortar la cinta de autoclave para adaptarse a la placa de Petri, utilizar pinzas para mover la cinta en la placa de Petri y flotar en la solución de enzima (Figura 1F), las hojas hacia abajo. Girar a 60 rpm en un agitador de plataforma durante 60 min, durante los cuales los protoplastos se liberan en la solución. </li><li> Utilice pinzas para retirar y desechar las tiras de cinta de autoclave (Figura 1g) y pipeta de la solución que contiene los protoplastos (Figura 1h) en un tubo cónico de 50 ml. Utilice una punta de pipeta de gran calibre (tal como una punta P5000 o P1000 con una punta al final cortados). </li><li> Centrifugar los protoplastos en 100 xg durante 3 min a 4 ° C y separar el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado, ya que el sedimento es muy floja. </li><li> Añadir solución W5 10 ml a los protoplastos y resuspender girando suavemente el tubo. </li><li> Descansar los protoplastos en hielo durante 30-60 min. Durante este paso, evaluar el rendimiento mediante el recuento de protoplastos en un hemocitómetro (Figura 1i). </li><li> Recoger los protoplastos por centrifugación a 100 x g durante 3 min a 4 ° C y separar el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado, ya que el sedimento es muy floja. </li><li> Resuspender los protoplastos a una concentración de 5 x 10 5 protoplastos / ml en solución MMg. </li></ol> 3. La transfección de protoplastos <ol><li> Añadir 10 l de plásmido reportero (2 g / l) a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir 400 protoplastos mu l al tubo. </li><li> Añadir un volumen (410 l) y la solución de PEG mezclar invirtiendo el tubo suavemente 12 veces para transfectar los protoplastos. </li><li> Después de 8-15 min incubation a temperatura ambiente, diluir la mezcla de protoplastos-DNA-PEG con cuatro volúmenes (1.640 l) de solución W5 y mezclar por inversión suave seis veces. </li><li> Recoger los protoplastos transfectados por centrifugación a 100 xg durante 2 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante con una pipeta. Una vez más, tenga cuidado, ya que el sedimento es muy floja. </li><li> Resuspender los protoplastos en la solución de formación de imágenes 1250 l. </li><li> L alícuota de 200 en seis replican pocillos de una placa de 96 pocillos, llenar los pozos vacíos con solución W5, y sellar la placa con una tapa transparente adhesivo adecuado para la imagen luminiscente. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> La transferencia de la placa para cualquier configuración de imagen luminiscente adecuado para la imagen de la planta. Cambiar las tapas adhesivas en las placas de 10-15 minutos después de la transferencia para evitar diferencias de presión de condensación y entre los pozos, a continuación, iniciar la imagen. Lea la placa de cada ~ 45 min (3 segundos por pocillo) durante cinco días a temperatura ambiente. Nota lafrecuencia de la placa lee y el tiempo de lectura por pozo podría variar dependiendo de la configuración de imagen. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Analizar los resultados de luminiscencia usando cualquier software de análisis (por ejemplo, Biological Rhythms Sistema de Software de Análisis (latón) 22). Comparación de la línea mutante de tipo salvaje controles para revelar defectos circadianos. </li></ol>

<ol><li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).</li>
<li>Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li>
<li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968(2011).</li>
<li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li>
<li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis%2C+growth%2C+survival%2C+and+competitive+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li>
<li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130(2008).</li>
<li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological%2C+Metabolic%2C+and+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li>
<li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li>
<li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li>
<li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li>
<li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9%2C+7%2C+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li>
<li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li>
<li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+circadian+clock+protein%2C+TOC1%2C+is+a+DNA-binding+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li>
<li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheels+within+wheels%3A+the+plant+circadian+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li>
<li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li>
<li>Portolés, S., Más, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li>
<li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16(2009).</li>
<li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase%3A+the+structure+is+known%2C+but+the+mystery+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li>
<li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).</li>
<li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li>
<li>Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+%28CCA1%29+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li>
<li>Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li>
<li>Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light%2Fchloroplast-related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30(2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, presentamos un ensayo rápido para detectar defectos período circadiano en líneas de Arabidopsis, como el aislamiento de protoplastos, la transfección, y las imágenes luminecent. El período circadiano de tipo salvaje de Arabidopsis y el reloj mutantes CCA1 / lhy, ZTL, y CCA1 -OX se calculó a partir de mediciones de luminiscencia de un CCA1pro: reportero LUC y se encontró que ser consistente con los datos publicados generados a partir de plantas enteras utilizando más tiempo- consumen enfoques transgénicos (Tabla 2). Utilizando este ensayo para detectar mutantes de Arabidopsis evita el requisito inicial para generar líneas luminiscentes transgénicos, lo que consume tiempo y sólo podría revelar que un mutante particular, exhibe ritmos de tipo salvaje. Una clara ventaja de este protocolo es que cualquier línea de Arabidopsis se puede examinar en breve periodo de tiempo para alterados los ritmos circadianos de la transcripción, que ayudarán a la identificación de más genes que afectan a la hora normal en las plantas. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Aislamiento de protoplastos puede ser laborioso, especialmente si la línea mutante muestra un fenotipo enano. Métodos previamente reportados para generar protoplastos implican cortar hojas o plantas de semillero en tiras finas y el vacío que infiltran las tiras con la solución de enzima para permitir que las enzimas lleguen a las paredes celulares 26,27. La digestión subsiguiente requiere al menos 3 horas de incubación en la oscuridad para liberar los protoplastos en la solución de enzima. Cuando no se aplica infiltración al vacío, se aconseja tiempo de incubación de hasta 18 h. En el protocolo que se presenta aquí, la infiltración de vacío es innecesario porque la capa de células epidérmicas impenetrable a las enzimas se elimina por cinta. Al generar protoplastos mediante la reducción de material vegetal es necesario protoplastos separados de los desechos de la pared celular después de la digestión; Esto normalmente se hace mediante el filtrado de la solución o la purificación en un gradiente de 27,26 azúcar. Aquí, cualquier tejido sin digerir permanece en la cinta de autoclave despuésla digestión, por lo que la filtración y purificación en gradiente de azúcar de los protoplastos se puede omitir. Hay una posibilidad de que el estrés resultante de procedimientos de protoplastos prolongados afecta a la viabilidad celular y el reloj circadiano. El método de protoplastos basado en cinta 20 visualizada aquí se obtiene un alto número de protoplastos; y dada la viabilidad de las células a través de una serie de tiempo circadiano y las longitudes de época a juego de protoplastos y plantas enteras (Tabla 2), la metodología descrita aquí se prefieren sobre los métodos alternativos para generar protoplastos. La etapa de transfección del protocolo es un paso crítico que los impactos sobre la viabilidad de los protoplastos. La solución de PEG permite al DNA a ser entregado en la célula, y tanto el tiempo de incubación en esta solución (paso 3.4) y el porcentaje de PEG debe ser determinada empíricamente. La concentración estándar es de 20%, con concentraciones más bajas que reducen la eficiencia de transformación y mayorconcentraciones que reducen la viabilidad 28. El tiempo de incubación tan corto como cinco minutos podría producir la transfección eficiente de los protoplastos 27. Los protoplastos se pueden obtener imágenes en cualquier plataforma de imágenes luminiscente. En este vídeo, hemos utilizado un lector de placas de luminiscencia equipado con luces externas (rojo y LEDs azules, 630 y 470 nm, respectivamente, a una intensidad combinada de ~ 20 E ·), que permite la selección de alto rendimiento y mediciones frecuentes. Otros equipos de imagen que detecta la luminiscencia, tales como lectores de placas alternativas o configuraciones basadas en torno a una cámara del dispositivo (CCD) acoplado de carga, podría aplicarse igualmente bien, siempre y cuando la iluminación está disponible para la fotosíntesis. La ventaja de usar una cámara CCD montada en un gabinete controlable es que la luz y la temperatura se puede programar. Una desventaja es el tiempo de captura más largo, la introducción de períodos prolongados de oscuridad que pueden causar estrés a los protoplastos, además de perturbaring cronometraje endógeno. Independientemente de la plataforma experimental que se elija, es probable que sea necesario, en comparación con la configuración de plántulas o plantas maduras ajuste de la configuración. En nuestra experiencia, el aumento de las concentraciones de plásmido reportero durante la transfección y / o luciferina en la memoria intermedia de imágenes podría resolver cualquier ritmos irregulares o de mojado rápido que pudieran ocurrir en los experimentos iniciales. En experimentos futuros, la metodología descrita aquí se puede aplicar para estudiar el fenotipo circadiano de cualquier línea de Arabidopsis mutante. Con pequeñas modificaciones, por ejemplo, el efecto de los diferentes medicamentos en la hora normal podría ser estudiado en esta configuración. Además, la transfección puede ser modificado para incluir microARN artificial para el silenciamiento de genes 19, ampliando aún más la versatilidad de este protocolo. Protocolos para generar protoplastos de arroz están bien establecidos 29 y el protocolo de formación de imágenes que aquí se presenta igualmente se podrían aplicar para mejorar nuestra uOMPRENDER del reloj en económicamente importantes plantas de cultivo monocotiledóneas.

La mayoría de los organismos vivos poseen un cronometrador endógeno para ayudar negociación eficiente de los cambios diarios en el medio ambiente. Este cronometrador, el reloj circadiano, regula muchos aspectos del metabolismo y la fisiología de un organismo para anticiparse a los cambios previsibles en el entorno externo. En las plantas, por ejemplo, la anticipación de los ataques de patógenos o herbívoros temporalmente predecibles reduce fuertemente la susceptibilidad general de 1 - 4. El metabolismo del almidón está estrechamente regulada por el reloj circadiano para asegurar que las reservas de almidón última hasta el amanecer si crecido en condiciones largas o cortas del día 5. De hecho, las plantas con los relojes circadianos que coinciden con los medio ambiente muestran un aumento de las tasas de crecimiento de 24 h, las tasas de fijación de carbono y las tasas de supervivencia en comparación con las plantas que ejecutan un reloj de tiempo coincidentes 6. La amplia influencia de los ritmos circadianos en todos estos procesos surge en gran medida de la regulación rítmica de hasta un terciodel transcriptoma total de 7 en Arabidopsis. Estos productos génicos rítmicos están involucrados en una amplia gama de procesos celulares, incluyendo las vías metabólicas, de señalización de la hormona, y las respuestas al estrés 7. Además de eso, la regulación circadiana directa de la función de las proteínas es establecido por la regulación circadiana de la fosforilación de 8 y más probablemente otras modificaciones post-traduccionales (PTM). En el centro del reloj circadiano que impulsa esta reprogramación transcripcional diaria se encuentra una red de transcripción / retroalimentación de traslación bucles (TTFLs), incluyendo los genes de la mañana-expresado reloj circadiano ASOCIADOS 1 (CCA1) y tardía alargada hipocotilo (PGA) que reprimen la expresión genes de la noche MOMENTO dE CABINA 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) y los miembros del complejo de la tarde (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), floración temprana 3 (ELF3), y ELF4 9-11. junto ingenioh los -genes REGULADOR DE PSEUDO de respuesta (PRR3, 5, 7 y 9), TOC1 reprime la expresión CCA1 / PGA mientras que la CE actúa como un regulador positivo 12 - 14. Adicional a los mecanismos de retroalimentación, post-transcripcional y post-translacional regulación de los componentes de la red TTFL juega un papel importante en el ajuste de los ritmos circadianos. Hasta la fecha, el PTM identificado más abundante en las proteínas del reloj circadiano es la fosforilación 15. La fosforilación de CCA1 por caseína quinasa 2 (CK2) afecta su unión a orientar promotores 16 y es importante para la compensación de temperatura del reloj circadiano de 17. Las proteínas PRR son fosforilados diferencialmente durante el ciclo circadiano, y la fosforilación de TOC1 afecta a la interacción con su regulador negativo, el componente de reloj Zeitlupe la tarde-etapas (ZTL) 18. Estos ejemplos ilustran cómo PTM y las interacciones proteína-proteína sintonizar la red TTFL en un 24 hroscilador transcripcional. Para una introducción más detallada a la red de reloj de la transcripción y su regulación, excelentes críticas recientes están disponibles (por ejemplo, referencia 15). Sin embargo, lo que queda menos claro es el grado en que los procesos regulados rítmicamente y otros aspectos del metabolismo celular se alimentan de nuevo en el propio mecanismo de relojería. Revisión exhaustiva de los mutantes de Arabidopsis por defectos de reloj podría lograr una mejor comprensión de qué mecanismos o vías de señalización podrían estar involucrados en la generación de ritmos 24 hr desde una red TTFL. Con este fin, Kim y Somers publicados previamente un método de desintegración a través de para el análisis rápido y eficiente de las funciones de tiempo en cualquier línea de Arabidopsis 19. Basado en el uso de la expresión transitoria en protoplastos, esta metodología supera la necesidad de líneas transgénicas estables o cruza a las líneas de marca de ciclo luminiscentes. Aquí, visualizamos un alto rendimiento de protoplastos isolatiométodo n 20 combinado con un protocolo optimizado para la pantalla defectos circadianos por imágenes luminiscente de marcadores de reloj expresadas transitoriamente en un lector de placas de 96 pocillos. Compararemos de tipo salvaje de Arabidopsis Col- 0 a mutantes de reloj bien caracterizados para confirmar la metodología descrita aquí con éxito detecta la alteración de los ritmos circadianos. Protoplastos derivados de estas líneas son transfectadas con un constructo indicador que expresa la luciferasa de luciérnaga a partir del promotor CCA1 circadiano; CCA1pro: LUC 19. Luciferasa cataliza la reacción de múltiples etapas en la que la luciferina se convierte en electrónicamente excitado oxiluciferina que emite luz 21, que es imaginada con el tiempo para evaluar el período, amplitud y fase de los ritmos de la transcripción en estos protoplastos. El protocolo consta de tres partes principales; el aislamiento de los protoplastos, la transfección de los protoplastos con el plásmido reportero, y im luminiscenteenvejecimiento. Estas tres partes siempre deben realizarse en un solo día, utilizando tampones y reactivos recién preparados. crecimiento de las plantas y la purificación de cantidades suficientes de plásmido reportero deben realizarse por adelantado y no se visualizan en este protocolo.

<table><tbody><tr><td>CELULOSA Celulasa, Trichoderma viride&nbsp; </td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinasa R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Disuelva el polvo de luciferina en tampón de trifosfato de 0,1 M pH 8,0 a una concentración de 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Cinta indicadora de vapor</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Cinta mágica</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td> <td>de PetriSuministros de laboratorio científico</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, 96 pocillos, fondo plano, blanco</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, tapas adhesivas para placas de 96 pocillos</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 10 ml, sin aguja</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa filtro 0,22 y micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de software de análisis de ritmos biológicos (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Descarga gratuita en amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Fuch-Rosenthal modificada, doble celda</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro</td><td>Microscopio Optika</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar2 lector multimodo, con módulo de luminiscencia</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis rápido de los fenotipos circadianos en arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes reportero

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

El reloj circadiano de la planta permite anticipar los cambios diarios en el entorno. Esta anticipación ayuda a las respuestas al estrés biótico y abiótico temporalmente predecible. Por el contrario, la interrupción del cronometraje circadiano compromete gravemente la salud de las plantas y reduce el rendimiento de los cultivos agrícolas. Por lo tanto, es imperativo que comprendamos la intrincada regulación de los ritmos circadianos en las plantas, incluidos los factores que afectan el movimiento del propio mecanismo de relojería transcripcional.
La prueba de defectos circadianos en la planta modelo Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) tradicionalmente implica cruzar líneas mutantes específicas a una línea que expresa rítmicamente luciferasa de luciérnaga de un promotor de genes de reloj circadiano. Este enfoque es laborioso, requiere mucho tiempo y podría ser infructuoso si un mutante no tiene fenotipo circadiano. La metodología aquí presentada permite una evaluación inicial rápida de los fenotipos circadianos. Los protoplastos derivados de Arabidopsis mutante y de tipo salvaje se aíslan, se transfectan con un reportero luminiscente expresado rítmicamente y se obtienen imágenes en condiciones de luz constante durante 5 días. Los trazos luminiscentes revelarán directamente si el período de funcionamiento libre de las plantas mutantes es diferente al de las plantas de tipo silvestre. La ventaja del método es que cualquier línea de Arabidopsis puede ser filtrada de manera eficiente, sin la necesidad de generar una línea de marcador de reloj luminiscente transgénica estable en ese fondo mutante.

Los protoplastos de tipo salvaje de Arabidopsis se compararon con el reloj mutantes conocidos CCA1 / lhy (corto período mutante 2), ZTL (largo período mutante 23), y la línea de sobreexpresión CCA1 -OX (arrítmicos 24). Todos fueron transfectadas transitoriamente con el CCA1pro: reportero LUC y la imagen en luz constante en un lector de placas durante 5 días. Aquí nos muestran que en el mutante CCA1 / lhy, el período de funcionamiento libre de la expresión génica-circadiano controlada se acorta (Figura 2a), de acuerdo con el período analizado publicada por la expresión transgénica estable de reloj de 2,9 luminiscentes marcadores. El período de las oscilaciones circadianas en protoplastos del mutante ZTL es más largo que en el tipo salvaje (Figura 2b), de acuerdo con los resultados publicados anteriormente de las plantas de semillero, la suspensión de células cultures y protoplastos 19,23,25. La sobreexpresión de CCA1 bloquea el reloj en la mañana de fase y la transcripción global se vuelve arrítmico 24. Consistentemente, se observó que no oscilaciones en CCA1pro: LUC expresión en protoplastos -oX CCA1 (Figura 2c). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figura 2: protoplastos Los protoplastos ritmos circadianos de Col- 0, CCA1 / lhy, ZTL, y CCA1 -OX fueron transformados transitoriamente con el CCA1pro: LUC y los ritmos circadianos en la luminiscencia se obtuvieron imágenes de más de 5 días (A - C). (D) Las estimaciones período circadiano en base a las huellas de luminiscencia en Col -0, CCA1 / lhy y ZTL (A - B). Youn ± SEM, n = 3-5, t-test, p-valor que se indica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo </td><td> Período (protoplastos) </td><td> Período (transgénicos) </td><td> Reportado por: </td><td> referencias </td></tr><tr><td> 0 co- </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC en Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC en Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> ARN en el fondo L er </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC en el ecotipo C24 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arrítmico </td><td> arrítmico </td><td> pCCA1: LUC (datos LD solamente) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arrítmico </td><td> ARN y proteína en fondo Col -0 </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Los ritmos circadianos en comparación con protoplastos transgénicos plántulas El período circadiano de pCCA1:. LUC expresión en protoplastos en comparación con la longitud del período reportado por primera vez para la mutación y, si están disponibles, con pCCA1: LUC expresión de Col -0.

El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

El objetivo general de este ensayo es determinar el período circadiano en líneas de Arabidopsis mediante la medición de la luminiscencia emitida por protoplastos transfectados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología circadiana, como qué genes retroalimentan el mecanismo de control del tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis rápido del período circadiano de cualquier mutante de Arabidopsis sin necesidad de generar líneas transgénicas estables.Para comenzar este procedimiento, etiquete una placa de Petri y añádale 10 mililitros de solución enzimática filtrada y esterilizada. Fije cuatro tiras de cinta para autoclave con el lado adhesivo hacia arriba sobre una superficie de laboratorio limpia, y marque el tamaño de la placa de Petri en las tiras. Recoja las plantas de la sala de crecimiento.Corte las hojas de plantas de cuatro semanas de edad y presione la epidermis superior sobre la cinta para autoclave, de modo que la superficie epidermal inferior quede orientada hacia arriba. Coloque tiras de cinta adhesiva mágica sobre la superficie epidermal inferior. Utilizando un tubo cónico de 15 mililitros, presione suavemente las tiras sobre las hojas, teniendo cuidado de no aplastar el tejido foliar.Retire cuidadosamente la cinta para desprender la epidermis inferior y exponer las células del mesófilo. A continuación, corte la cinta autoclavable para que se ajuste a la placa de Petri y use pinzas para colocar la cinta en la placa, dejándola flotar sobre la solución enzimática con las hojas hacia abajo. Incube a 60 RPM en un agitador rotatorio durante 60 minutos, tiempo durante el cual los protoplastos se liberarán en la solución.Después de 60 minutos, use pinzas para retirar y desechar las tiras de cinta para autoclave. Utilizando una punta de pipeta de gran orificio, aspire la solución que contiene los protoplastos y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue los protoplastos a 100 ×g durante tres minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante, ya que el precipitado es muy suelto.Añada 10 mililitros de solución W5 a los protoplastos y resuspenda mediante un suave movimiento de giro del tubo. Retire una alícuota de protoplastos para el recuento. Incube los protoplastos en hielo durante 30 a 60 minutos.Mientras los protoplastos están en hielo, evalúe el rendimiento contando los protoplastos en un hemocitómetro. Recolecte los protoplastos mediante centrifugación a 100 gee durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Retire con cuidado el sobrenadante, ya que el sedimento es muy suelto.Por último, reponga en suspensión los protoplastos en solución MMg hasta una concentración de 500.000 protoplastos por mililitro. Comience el procedimiento de transfección de protoplastos añadiendo diez microlitros de plásmido reportero a un tubo cónico de 15 mililitros, seguido de 400 microlitros de protoplastos. Añada un volumen de solución de polietilenglicol, o PEG, y mezcle invirtiendo suavemente el tubo 12 veces para transfectar los protoplastos.Incube de ocho a 15 minutos a temperatura ambiente. Los protoplastos deben incubarse el tiempo suficiente para garantizar una transfección eficiente, pero no demasiado tiempo, ya que esto reduciría su viabilidad. A continuación, diluya la mezcla de ADN-PEG de protoplastos con cuatro volúmenes de solución W5 y mezcle invirtiendo suavemente seis veces.Recoger los protoplastos transfectados por centrifugación a 100 gee durante dos minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante con una pipeta, teniendo nuevamente mucho cuidado ya que el sedimento es muy suelto. Suspender nuevamente los protoplastos en 1.250 microlitros de solución de imagen.Los protoplastos deben resuspenderse bastante fácilmente, lo que indica que están intactos tras la transfección. Aliquotar 200 microlitros por pocillo en seis pocillos replicados de una placa de 96 pocillos y llenar cualquier pocillo vacío con solución W5. Sellar la placa con una tapa adhesiva transparente adecuada para imágenes luminiscentes.Para obtener imágenes de los protoplastos, transfiera la placa de 96 pocillos a cualquier sistema de imagen luminiscente adecuado para imágenes de plantas. Cambie la tapa adhesiva de la placa entre 10 y 15 minutos después de la transferencia para evitar la condensación y diferencias de presión entre los pocillos. Inicie la adquisición de imágenes.Lea la placa cada 45 minutos durante cinco días a temperatura ambiente. Posteriormente, analice los resultados de luminiscencia utilizando cualquier software de análisis, por ejemplo, el Sistema de Software de Análisis de Ritmos Biológicos. Los protoplastos de mesófilo aislados mediante este protocolo se muestran en esta imagen con una magnificación de 200 veces.Los protoplastos son de arabidopsis tipo salvaje y el mutante cca1/lhy se transfirieron e imagedieron en luz constante en un lector de placas durante cinco días. Como se esperaba, el período libre de la expresión génica controlada por el reloj se acorta en este mutante. En contraste, el período de las oscilaciones circadianas en protoplastos del mutante ztl se alarga.En protoplastos que sobreexpresan CCA1, no hubo oscilaciones en la expresión del constructo reportero porque la sobreexpresión de CCA1 conduce a arritmia. Este gráfico de barras muestra las estimaciones del período circadiano basadas en trazas de luminiscencia en protoplastos de tipo salvaje y mutantes del reloj. Estos períodos circadianos son consistentes con datos publicados generados a partir de plantas completas utilizando enfoques transgénicos que requieren mucho tiempo.Al intentar este procedimiento, es importante utilizar plantas sanas y manipular los protoplastos con cuidado, ya que son frágiles. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, transfectar y observar mediante imágenes protoplastos de Arabidopsis.Estas técnicas ahora pueden aplicarse a cualquier línea mutante, o incluso modificarse para obtener imágenes de protoplastos de otras especies vegetales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específicas de fitocromo.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

Luciferase genéticamente codificado es un popular reportero no invasivo de la expresión génica. Uso de un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) permite la grabación longitudinal de células bioluminiscentes bajo una amplia gama de condiciones. Aquí mostramos cómo cocodrilo puede utilizarse en el contexto de la investigación de los ritmos circadianos.

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Esta nueva tecnología basada en la fluorescencia permite la monitorización a largo plazo de la transcripción de los genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático (SCN) de mover libremente ratones en tiempo real y con una alta resolución temporal.

En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros

El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Este informe describe un método que involucra un script R en el software de código abierto RStudio para analizar conjuntos de datos a gran escala obtenidos de experimentos de series temporales.

Un análisis R potente y fácil de usar de conjuntos de datos a gran escala

Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.

El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana</em

Aprende a analizar fenotipos circadianos en Arabidopsis mediante protoplastos transfectados con un reportero luminiscente. Este método permite evaluar rápidamente períodos circadianos sin necesidad de líneas transgénicas estables.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

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