Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los eventos de tráfico vesicular en la vía endocítica de células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico vesicular, como cómo las mutaciones o los cambios en la expresión de proteínas afectan las tasas y la eficiencia de los eventos de tráfico. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación directa del tráfico endocítico en células vivas mediante la medición de la intensidad de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia.

Después de preparar las soluciones y los medios según el protocolo descrito en el texto, inocular dos a tres colonias de células de levadura en cinco mililitros de medio YNB, sin nutrientes adicionales para mantener la selección del plásmido. Incubar los cultivos a 30 grados Celsius con agitación durante 16 a 24 horas. Aproximadamente tres horas antes de la adquisición de imágenes, medir la DO 600 de cada cultivo nocturno.

Luego, prepare diluciones de cinco mililitros con una DO 600 de 0,35 a 0,4 en medio YNB, sin nutrientes adicionales para el mantenimiento del plásmido, y cultive a 30 grados Celsius con agitación durante tres horas. Durante la incubación, pre-equilibre la cámara ambiental del microscopio o la platina calefaccionada a 30 grados Celsius. Después de preparar un portaobjetos de vidrio tratado con ocho pocillos y cámara para imágenes según el protocolo descrito en el texto, agregue 200 microlitros de medio YNB sin nutrientes adicionales para la selección del plásmido a cada pocillo.

Cuando los cultivos estén listos, transfiera un mililitro a un tubo microfridge y haga el pellet de las células a 8.000 RPM durante dos minutos. Luego, retire 975 microlitros del sobrenadante. Reuspenda el pellet celular en el sobrenadante restante.

Luego, agregue 2,5 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada pocillo de la placa de ocho pocillos. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para dispersar las células y permita que las células sedimenten durante cinco a 10 minutos. Coloque la cámara portaobjeto en un microscopio de fluorescencia invertido equilibrado a 30 grados Celsius.

Luego, utilice la iluminación de campo brillante para localizar un campo de células. Añada 50 microlitros de medio YNB precalentado que contenga 100 microgramos por mililitro de metionina al medio de 200 microlitros en el pocillo para obtener una concentración final de metionina de 20 microgramos por mililitro. Permita que las células se equilibren durante dos minutos antes de comenzar la adquisición de imágenes.

Luego, inmediatamente antes de la adquisición de imágenes, ajuste el microscopio al plano focal deseado. Adquiera GFP en campos brillantes o imágenes DIC a intervalos de 5 minutos durante un periodo de 45 a 60 minutos. Utilice parámetros de adquisición idénticos para todas las imágenes dentro de una serie temporal.

Consulte el protocolo escrito para obtener detalles adicionales. Cuantifique la intensidad de fluorescencia de células individuales en cada punto temporal y exprese los valores como un porcentaje de la intensidad inicial de la primera imagen. Después de exportar las imágenes según el protocolo escrito en ImageJ, abra los archivos en el menú de archivo utilizando la opción Abrir.

Utilice la imagen de fluorescencia para la cuantificación y la imagen de campo claro o DIC como referencia para identificar la ubicación de las células. Excluya las células muertas, si están presentes, que aparecen más oscuras que las células vivas cuando se observan mediante DIC y presentan autofluorescencia en el canal GFP. Para imágenes con un fondo irregular, en el menú Procesar, seleccione el algoritmo de sustracción de fondo y elija la configuración predeterminada.

Una vez que se han adquirido las imágenes, es importante realizar la sustracción del fondo antes de continuar con el procedimiento de cuantificación. Este paso es particularmente importante porque la señal de fondo podría enmascarar o atenuar las diferencias entre muestras. Utilizando la herramienta de selección manual, delimite una célula asegurándose de incluir toda la célula, pero con la menor área posible fuera de ella.

Luego, en el menú Analizar, utilice la función establecer mediciones para medir el área, la densidad integrada y el valor medio de escala de grises. Abra el Administrador de ROI haciendo clic en Analizar y luego en Herramientas. En la ventana del Administrador de ROI, haga clic en el botón Agregar para ingresar la región resaltada como una nueva ROI.

Repita el trazado y la toma de mediciones para las restantes células en la imagen, excluyendo cualquier célula muerta o células que toquen el borde de la imagen. Guarde las ROI seleccionadas como un archivo zip haciendo clic en el botón de medición, lo cual mostrará los valores medidos en una nueva ventana. Luego haga clic en el botón más y exporte todas las mediciones a una hoja de cálculo o software de análisis estadístico.

Inocular de dos a tres colonias de células de levadura y 0,5 mililitros de medio YNB, sin nutrientes adicionales para mantener la selección del plásmido. Incubar las células en un tambor rotatorio a 30 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Añadir un mililitro de medio YNB sin nutrientes adicionales para el mantenimiento del plásmido y cultivar durante tres horas adicionales.

A continuación, transfiera un mililitro de células a cada uno de dos tubos redondos de cinco mililitros. Luego agregue 0,25 mililitros de medio YNB Met al primer tubo y 0,25 mililitros de medio YNB que contenga 100 microgramos por mililitro de metionina al segundo tubo, para obtener una concentración final de 20 microgramos por mililitro. Para un gran número de muestras, agregue la metionina de forma escalonada para disponer de tiempo suficiente para el análisis de los datos.

Nuestro citómetro de flujo puede medir hasta 40 muestras por corrida. Añadimos metionina en lotes. Ocho muestras cada cinco minutos.

Esto asegura que todas las muestras se midan entre 45 y 50 minutos después de la adición de metionina. Incubar las células durante 45 minutos. Luego analizar las células mediante citometría de flujo, seleccionando la dispersión directa o FS como medida del tamaño celular y representar una intensidad de fluorescencia en flujo proveniente de un filtro FITC como medida de la internalización del cargo.

Durante la incubación de 45 minutos, utilice los botones deslizantes para ajustar el voltaje de los canales FS y FITC con el fin de optimizar la detección según el rango de tamaño e intensidad de fluorescencia de las células de levadura que se estén utilizando. Mida la dispersión frontal (FS) e intensidad de fluorescencia en 10.000 células de cada condición. Utilizando la configuración de flujo alto, genere un diagrama de dispersión de FS frente a intensidad de fluorescencia haciendo clic en agregar gráfico.

Luego, seleccione FITC para el eje x y FS para el eje y y grafique 1000 puntos. Utilizando la función de selección y la condición de tipo salvaje Met, asigne una puerta vertical de modo que aproximadamente el 5 % de las células más brillantes queden a la derecha de la puerta. Utilice esta selección para todas las demás condiciones del experimento.

Como se muestra aquí, se realizó imágenes de lapso de tiempo de células a intervalos de cinco minutos en ausencia o presencia de metionina para monitorear la internalización de Mup1 marcado con GFP o fluorina y los cambios en la fluorescencia. Como era de esperar, Mup1 marcado con GFP y fluorina permaneció en la membrana plasmática en ausencia de metionina. En contraste, las células observadas en presencia de metionina mostraron una disminución progresiva de la señal fluorescente desde la superficie celular, lo que es consistente con la internalización del cargamento.

Sin embargo, la cinética de la pérdida de fluorescencia en presencia de metionina se retrasó en las células Mup1 GFP en comparación con las células Mup1 pHlourin. Estos diagramas de dispersión comparan la intensidad de fluorescencia de células silvestres o de cuatro células delta ENTH1 en presencia o ausencia de metionina tras aplicar una compuerta vertical. El 4 % de las células silvestres Met se encontraron en el lado derecho de la compuerta, correspondiente a las células más brillantes de la población, mientras que el 65 % de las células silvestres no tratadas estuvieron contenidas dentro de la compuerta.

En contraste, las cuatro células delta ENTH1 no mostraron diferencia en la distribución de células brillantes frente a débiles, lo que es consistente con un defecto en la endocitosis. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar espaciar los tiempos de inicio al realizar experimentos simultáneos, de modo que los datos del punto final puedan recopilarse tras el mismo tiempo de tratamiento para todas las muestras.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como análisis genéticos florales para responder preguntas adicionales, como qué factores novedosos contribuyen al tráfico vesicular. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico vesicular exploraran aspectos de la reducción de endosomas, así como una vía recientemente descubierta, independiente de la clatrina y ácida, en levaduras en gemación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar cargas del tipo florentina para cuantificar eventos endocíticos en células vivas.