Name: Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a cuantificar eventos de tráfico vesicular en levaduras vivas mediante pHluorin y microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar mutaciones y cambios en la expresión proteica durante la endocitosis.

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Nos gustaría agradecer a Gero Miesenböck y Tim Ryan por compartir el ADNc de pHluorin utilizado para generar reactivos en este estudio, a Nathan Wright, Joanna Poprawski y Lydia Nyasae por su excelente asistencia técnica, a los miembros del laboratorio de Wendland por sus útiles discusiones, y a Michael McCaffery y Erin Pryce en el Centro Integrado de Imágenes (Johns Hopkins) por su asesoramiento y asistencia con la microscopía y la citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (a B.W., GM60979) y la Fundación Nacional de Ciencias (a B.W., MCB 1024818). K.W. fue apoyado en parte por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud (T32-GM007231). A.F.O. contó con el apoyo de fondos de desarrollo del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Duquesne y la beca CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias 553143.

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
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<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
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<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
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<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
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<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Aplicaciones de la pHluorin para la cuantificación de eventos endocítica en células de levadura hace uso de cargas transmembrana en el que la etiqueta fluorescente está fusionada a la cola citoplasmática de la proteína (Figura 1A). Para los ensayos descritos aquí, son cargas con fluorescencia brillante cuando la etiqueta pHluorin se expone a ambientes neutros, pero se convierten en extinguió cuando la etiqueta se encuentra con pHluorin condiciones ácidas. Por lo tanto, un cargamento endocítica-etiquetad...

el tráfico vesicular juega un papel importante en el mantenimiento de la identidad y la función orgánulo en células eucariotas, y es un mecanismo clave para la regulación de proteínas y de la membrana composición de compartimientos celulares individuales. En la membrana de plasma, fusión de vesículas exocytic ofrece nuevas proteínas y las membranas de la superficie de la célula, mientras que las vesículas generadas a través de endocitosis eliminar membrana y proteínas de la superficie para el reciclaje o la orientación al lisosoma posterior. Por lo tanto, la endocitosis es importante para la absorción de nutrientes y para respuestas al entorno extracelular. Exocitosis y endocitosis están equilibrados para regular el área de superficie de la membrana plasmática, y para permitir renovación de las proteínas dañadas. Los estudios en levaduras y células de mamíferos han identificado un gran número de proteínas implicadas en la endocitosis, así como múltiples vías endocítica que promueven la internalización de cargas específicas o que actúan en respuesta a una variedad de encondiciones ambientales. La vía mejor estudiada es la endocitosis mediada por clatrina (CME), en la que las proteínas de clatrina y accesorias citosólicas se ensamblan en una estructura de capa para estabilizar la vesícula endocítica naciente. Los experimentos en los ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae han arrojado información clave en la dinámica y la orden de contratación para muchas proteínas endocítica 1-3. En particular, la maquinaria CME está altamente conservada a través de la evolución de tal manera que la mayoría de las proteínas relacionadas con el CME en la levadura tiene ortólogos humanos; por lo tanto, la levadura en ciernes ha sido una herramienta importante para la comprensión de los mecanismos de endocitosis que están conservados en eucariotas superiores. Por ejemplo, los estudios que utilizan levadura en ciernes determinaron que la formación y la maduración de las estructuras de CME (denominado a los parches de actina como corticales en la levadura) implica el reclutamiento secuencial de muchas proteínas, a partir de clatrina y adaptador de proteínas de unión con la carga, seguido por reclutamiento de accesorio endocítica adicional proteínas,la activación de la polimerización de actina mediada por 3 Arp2 /, y el reclutamiento de las proteínas implicadas en 1,2 vesícula escisión. El reclutamiento de proteínas de maquinaria CME a cortical parches de actina es un proceso altamente ordenado y estereotipada, y el orden preciso de la contratación para muchas proteínas se ha establecido con respecto a otros componentes de la maquinaria de CME. Es importante destacar que estudios recientes han confirmado una orden similar de reclutamiento para las proteínas de CME en depresiones revestidas de clatrina en células de mamífero 4. Además de CME, muchos tipos de células poseen una o más vías de clatrina independiente endocítica (CIE) que se basan en mecanismos alternativos para promover la formación de vesículas y la internalización de la membrana plasmática 5-7. En la levadura, recientemente hemos identificado una vía de CIE que utiliza la pequeña GTPasa Rho1 y su factor de activación de guanina intercambio de nucleótidos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa el formin Bni1 para promover la polimerización de la actina 10,11, que se requiere para esta forma de endocitosis clathrin-independiente en la levadura 12. Por otra parte, la familia α-arrestina de proteínas reclutar la ubiquitina ligasa Rsp5 para promover la ubiquitinación de carga y la posterior interiorización a través de CME 13-17, y también promover la internalización de carga a través de la vía de CIE, posiblemente a través de la interacción directa con proteínas implicadas en la CIE 18. Una variedad de vías CIE también existen en células de mamífero, incluyendo las vías de clathrin independiente y fagocíticas que se basan en la ortholog Rho1, RhoA 9,19. El papel de RhoA en mamíferos CIE es poco conocida; por lo tanto, los estudios en levadura en ciernes pueden proporcionar conocimientos mecánicos adicionales que son aplicables a CIE mamíferos. la cuantificación exacta de los acontecimientos de endocitosis puede proporcionar información importante acerca de las funciones de las proteínas específicas en la regulación de la endocitosis, y puede revelar los efectos de las mutaciones sobre la internalización de carga o progression a través de la vía endocítica. Para este propósito, los métodos bioquímicos se pueden utilizar para controlar la absorción de ligando o para medir las tasas de degradación de las proteínas de carga endocítica. En las células vivas, la fusión de proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes a cargas de interés permite la visualización directa de transporte de carga. Sin embargo, cargas GFP-etiquetados son de uso limitado para la cuantificación de la endocitosis porque GFP es resistente a la degradación en el lisosoma (o vacuola en levaduras). Por otra parte, la fluorescencia de GFP es sólo parcialmente sensible a los cambios en el pH, y permanece detectable dentro de la vacuola lumen 20,21. Por consiguiente, la fluorescencia de la etiqueta GFP persiste en la vacuola mucho después de que el resto de la carga se ha degradado, y toda la cuantificación basada en células de la intensidad de la carga puede ser inexacto debido a la fluorescencia de GFP a largo plazo en la vacuola. Con el fin de superar los inconvenientes de la fluorescencia GFP vacuolar, que previamente hizo uso de pH supereclipticluorin, una variante sensible al pH de GFP que fluoresce brillantemente a pH neutro, pero pierde la fluorescencia en ambientes ácidos, tales como el lumen de la vacuola / lisosoma 20,22,23. La colocación de una etiqueta pHluorin en la cola citoplásmica de cargas endocítica permite la visualización de las cargas en la membrana plasmática y en los endosomas tempranos, donde la etiqueta pHluorin permanece expuesto al citoplasma (Figura 1A). A medida que maduran los endosomas tempranos, el complejo endosomal clasificación exigida en los paquetes de transporte (ESCRT) maquinaria cargas localizadas en la superficie en vesículas que brotan en el lumen del endosoma, la generación de cuerpos multivesiculares (MVBs) 24. Para las cargas que se han incorporado en vesículas internas MVB, la etiqueta pHluorin mira hacia el lumen de la vesícula. vesículas MVB internos se acidifican; por lo tanto, cargas marcadas con fluorescencia pHluorin pierden en los endosomas tempranos a medida que maduran en MVBs 20. fusión subsiguiente de la MVB con la vacuola entrega los contenidos luminales MVBpara la degradación, las etiquetas y pHluorin permanecen apagados en el ambiente ácido del lumen vacuola. Este documento proporciona una descripción detallada de los ensayos cuantitativos endocítica utilizando cargas con etiquetas pHluorin citoplasmáticos en la levadura. Las cepas que expresan cargas de etiquetado pHluorin se pueden utilizar en ensayos cinéticos y / o de punto final, dependiendo de las propiedades y el tráfico de comportamiento de la carga específica. Además, algunos cargamentos de etiquetado pHluorin son susceptibles de métodos de análisis de alto rendimiento, incluyendo citometría de flujo. Es importante destacar que la etiqueta pHluorin es una herramienta versátil para el estudio de eventos endocítica en las células vivas, lo que permite la cuantificación de la endocitosis y la comparación de la función endocítica de tipo salvaje y cepas mutantes.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626-25G</td><td>Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Uso para la preparación de medios de placa</td></tr><tr><td>BD Difco Levadura Base de nitrógeno (sin aminoácidos)</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Uso para la preparación de medios líquidos y de placa</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>Uso para el recubrimiento de la cámara portaobjetos</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher</td><td>BP350-1</td><td>Uso para la preparación de medios líquidos y en placa</td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Fisher</td><td>BP382-100</td><td>Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Acros 125121000</td><td></td><td>Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Fisher</td><td>BP386-100</td><td>Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>L-Triptófano</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>Uso para la preparación de mezcla de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara ( 8 pocillos)</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Uso para ensayos cinéticos y de punto final de la internalización de Mup1-pHluorin</td></tr><tr><td>Uracil</td><td></td><td>Sigma U0750-100G</td><td>Uso para la preparación de mezclas de aminoácidos y solución madre</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Axiovert 200</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Lens</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Objective debe ser 100X, 1.4NA o superior</td></tr><tr><td>La cámara Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>debe tener un rango dinámico de 12 bits o superior</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q Fuente de iluminación</td><td>Software Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td> Software ImageJ Institutos <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nacionales de Salud</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

aplicaciones de phluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes son ampliamente utilizados para el estudio de las herramientas de localización de la proteína y la dinámica de los acontecimientos tales como la remodelación del citoesqueleto y el tráfico vesicular en las células vivas. utilizando metodologías cuantitativas GFP fusiones quiméricas se han desarrollado para muchas aplicaciones; Sin embargo, la GFP es algo resistente a la proteolisis, por tanto, su fluorescencia persiste en el lisosoma / vacuola, lo cual puede dificultar la cuantificación del tráfico de carga en la vía endocítica. Un método alternativo para la cuantificación de los eventos de tráfico de endocitosis y post-endocítica hace uso de superecliptic pHluorin, una variante sensible al pH de GFP que se apaga en ambientes ácidos. fusión quimérica de pHluorin a la cola citoplasmática de carga transmembrana proteínas resulta en una amortiguación de la fluorescencia tras la incorporación de la carga en los cuerpos multivesiculares (MVBs) y la entrega a la luz del lisosoma / vacuola. Por lo tanto, extinción de la fluorescencia vacuolar facilita cuantificación de endocitosis y primeros eventos en la vía endocítica. Este documento describe los métodos que utilizan cargas de etiquetado pHluorin para la cuantificación de la endocitosis por medio de microscopía de fluorescencia, así como ensayos basados ​​en la población usando citometría de flujo.

La localización de estado estacionario y la cuantificación de la carga de proteínas endocítica constitutivamente internalizado Ste3 Para demostrar que cargamentos de etiquetado pHluorin pueden ser utilizados para la cuantificación de la endocitosis en las células vivas, la localización de GFP quimérico y fusiones pHluorin con la cola citoplásmica C-terminal de Ste3, el receptor de feromonas un factor en la lev...

La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los eventos de tráfico vesicular en la vía endocítica de células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico vesicular, como cómo las mutaciones o los cambios en la expresión de proteínas afectan las tasas y la eficiencia de los eventos de tráfico. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación directa del tráfico endocítico en células vivas mediante la medición de la intensidad de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia.Después de preparar las soluciones y los medios según el protocolo descrito en el texto, inocular dos a tres colonias de células de levadura en cinco mililitros de medio YNB, sin nutrientes adicionales para mantener la selección del plásmido. Incubar los cultivos a 30 grados Celsius con agitación durante 16 a 24 horas. Aproximadamente tres horas antes de la adquisición de imágenes, medir la DO 600 de cada cultivo nocturno.Luego, prepare diluciones de cinco mililitros con una DO 600 de 0,35 a 0,4 en medio YNB, sin nutrientes adicionales para el mantenimiento del plásmido, y cultive a 30 grados Celsius con agitación durante tres horas. Durante la incubación, pre-equilibre la cámara ambiental del microscopio o la platina calefaccionada a 30 grados Celsius. Después de preparar un portaobjetos de vidrio tratado con ocho pocillos y cámara para imágenes según el protocolo descrito en el texto, agregue 200 microlitros de medio YNB sin nutrientes adicionales para la selección del plásmido a cada pocillo.Cuando los cultivos estén listos, transfiera un mililitro a un tubo microfridge y haga el pellet de las células a 8.000 RPM durante dos minutos. Luego, retire 975 microlitros del sobrenadante. Reuspenda el pellet celular en el sobrenadante restante.Luego, agregue 2,5 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada pocillo de la placa de ocho pocillos. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para dispersar las células y permita que las células sedimenten durante cinco a 10 minutos. Coloque la cámara portaobjeto en un microscopio de fluorescencia invertido equilibrado a 30 grados Celsius.Luego, utilice la iluminación de campo brillante para localizar un campo de células. Añada 50 microlitros de medio YNB precalentado que contenga 100 microgramos por mililitro de metionina al medio de 200 microlitros en el pocillo para obtener una concentración final de metionina de 20 microgramos por mililitro. Permita que las células se equilibren durante dos minutos antes de comenzar la adquisición de imágenes.Luego, inmediatamente antes de la adquisición de imágenes, ajuste el microscopio al plano focal deseado. Adquiera GFP en campos brillantes o imágenes DIC a intervalos de 5 minutos durante un periodo de 45 a 60 minutos. Utilice parámetros de adquisición idénticos para todas las imágenes dentro de una serie temporal.Consulte el protocolo escrito para obtener detalles adicionales. Cuantifique la intensidad de fluorescencia de células individuales en cada punto temporal y exprese los valores como un porcentaje de la intensidad inicial de la primera imagen. Después de exportar las imágenes según el protocolo escrito en ImageJ, abra los archivos en el menú de archivo utilizando la opción Abrir.Utilice la imagen de fluorescencia para la cuantificación y la imagen de campo claro o DIC como referencia para identificar la ubicación de las células. Excluya las células muertas, si están presentes, que aparecen más oscuras que las células vivas cuando se observan mediante DIC y presentan autofluorescencia en el canal GFP. Para imágenes con un fondo irregular, en el menú Procesar, seleccione el algoritmo de sustracción de fondo y elija la configuración predeterminada.Una vez que se han adquirido las imágenes, es importante realizar la sustracción del fondo antes de continuar con el procedimiento de cuantificación. Este paso es particularmente importante porque la señal de fondo podría enmascarar o atenuar las diferencias entre muestras. Utilizando la herramienta de selección manual, delimite una célula asegurándose de incluir toda la célula, pero con la menor área posible fuera de ella.Luego, en el menú Analizar, utilice la función establecer mediciones para medir el área, la densidad integrada y el valor medio de escala de grises. Abra el Administrador de ROI haciendo clic en Analizar y luego en Herramientas. En la ventana del Administrador de ROI, haga clic en el botón Agregar para ingresar la región resaltada como una nueva ROI.Repita el trazado y la toma de mediciones para las restantes células en la imagen, excluyendo cualquier célula muerta o células que toquen el borde de la imagen. Guarde las ROI seleccionadas como un archivo zip haciendo clic en el botón de medición, lo cual mostrará los valores medidos en una nueva ventana. Luego haga clic en el botón más y exporte todas las mediciones a una hoja de cálculo o software de análisis estadístico.Inocular de dos a tres colonias de células de levadura y 0,5 mililitros de medio YNB, sin nutrientes adicionales para mantener la selección del plásmido. Incubar las células en un tambor rotatorio a 30 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Añadir un mililitro de medio YNB sin nutrientes adicionales para el mantenimiento del plásmido y cultivar durante tres horas adicionales.A continuación, transfiera un mililitro de células a cada uno de dos tubos redondos de cinco mililitros. Luego agregue 0,25 mililitros de medio YNB Met al primer tubo y 0,25 mililitros de medio YNB que contenga 100 microgramos por mililitro de metionina al segundo tubo, para obtener una concentración final de 20 microgramos por mililitro. Para un gran número de muestras, agregue la metionina de forma escalonada para disponer de tiempo suficiente para el análisis de los datos.Nuestro citómetro de flujo puede medir hasta 40 muestras por corrida. Añadimos metionina en lotes. Ocho muestras cada cinco minutos.Esto asegura que todas las muestras se midan entre 45 y 50 minutos después de la adición de metionina. Incubar las células durante 45 minutos. Luego analizar las células mediante citometría de flujo, seleccionando la dispersión directa o FS como medida del tamaño celular y representar una intensidad de fluorescencia en flujo proveniente de un filtro FITC como medida de la internalización del cargo.Durante la incubación de 45 minutos, utilice los botones deslizantes para ajustar el voltaje de los canales FS y FITC con el fin de optimizar la detección según el rango de tamaño e intensidad de fluorescencia de las células de levadura que se estén utilizando. Mida la dispersión frontal (FS) e intensidad de fluorescencia en 10.000 células de cada condición. Utilizando la configuración de flujo alto, genere un diagrama de dispersión de FS frente a intensidad de fluorescencia haciendo clic en agregar gráfico.Luego, seleccione FITC para el eje x y FS para el eje y y grafique 1000 puntos. Utilizando la función de selección y la condición de tipo salvaje Met, asigne una puerta vertical de modo que aproximadamente el 5 % de las células más brillantes queden a la derecha de la puerta. Utilice esta selección para todas las demás condiciones del experimento.Como se muestra aquí, se realizó imágenes de lapso de tiempo de células a intervalos de cinco minutos en ausencia o presencia de metionina para monitorear la internalización de Mup1 marcado con GFP o fluorina y los cambios en la fluorescencia. Como era de esperar, Mup1 marcado con GFP y fluorina permaneció en la membrana plasmática en ausencia de metionina. En contraste, las células observadas en presencia de metionina mostraron una disminución progresiva de la señal fluorescente desde la superficie celular, lo que es consistente con la internalización del cargamento.Sin embargo, la cinética de la pérdida de fluorescencia en presencia de metionina se retrasó en las células Mup1 GFP en comparación con las células Mup1 pHlourin. Estos diagramas de dispersión comparan la intensidad de fluorescencia de células silvestres o de cuatro células delta ENTH1 en presencia o ausencia de metionina tras aplicar una compuerta vertical. El 4 % de las células silvestres Met se encontraron en el lado derecho de la compuerta, correspondiente a las células más brillantes de la población, mientras que el 65 % de las células silvestres no tratadas estuvieron contenidas dentro de la compuerta.En contraste, las cuatro células delta ENTH1 no mostraron diferencia en la distribución de células brillantes frente a débiles, lo que es consistente con un defecto en la endocitosis. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar espaciar los tiempos de inicio al realizar experimentos simultáneos, de modo que los datos del punto final puedan recopilarse tras el mismo tiempo de tratamiento para todas las muestras.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como análisis genéticos florales para responder preguntas adicionales, como qué factores novedosos contribuyen al tráfico vesicular. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico vesicular exploraran aspectos de la reducción de endosomas, así como una vía recientemente descubierta, independiente de la clatrina y ácida, en levaduras en gemación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar cargas del tipo florentina para cuantificar eventos endocíticos en células vivas.

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Investigación

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Biology

Biología

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los...

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Levadura en ciernes es un modelo ventajoso para el estudio de la dinámica de microtúbulos in vivo debido a sus potentes genética y la simplicidad de su citoesqueleto de microtúbulos. El siguiente protocolo describe cómo transformar células de levadura y la cultura, adquirir imágenes de microscopía confocal, y analizar cuantitativamente la dinámica de microtúbulos en las células vivas de levadura.

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Esta sola molécula fluorescencia en situ hibridación protocolo está optimizado para cuantificar el número de moléculas de ARN en levadura de florecimiento durante la meiosis y crecimiento vegetativo.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende a cuantificar eventos de tráfico vesicular en levaduras vivas mediante pHluorin y microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar mutaciones y cambios en la expresión proteica durante la endocitosis.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

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