Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los eventos de tráfico vesicular en la vía endocítica de las células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico vesicular, como cómo la mutación o los cambios en la expresión de proteínas afectan las tasas y la eficiencia de los eventos de tráfico. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación directa del tráfico endocítico y de las células vivas mediante la medición de la intensidad de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia.

Después de preparar las soluciones y los medios de acuerdo con el protocolo de texto, inocule dos o tres colonias de células de levadura en cinco mililitros de medio YNB, faltando nutrientes adicionales para mantener la selección de plásmidos. Cultive los cultivos a 30 grados centígrados agitando durante 16 a 24 horas. Aproximadamente tres horas antes de la toma de imágenes, mida el OD 600 de cada cultivo durante la noche.

Luego prepare diluciones de cinco mililitros a un OD 600 de 0.35 a 0.4 en medio YNB, faltando nutrientes adicionales para el mantenimiento del plásmido y crezca a 30 grados centígrados con agitación durante tres horas. Durante la incubación, preequilibre la cámara ambiental del microscopio o la etapa calentada a 30 grados centígrados. Después de preparar una olla de vidrio de ocho pocillos tratada en lata y un portaobjetos de cámara para obtener imágenes de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 200 microlitros de medio YNB que carece de nutrientes adicionales para la selección de plasma a cada pocillo.

Cuando los cultivos estén listos, transfiera un mililitro a un tubo de micronevera y pegue las células a 8.000 RPM durante dos minutos. A continuación, retire 975 microlitros del sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de la célula en el sobrenadante restante.

A continuación, deje caer 2,5 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada pocillo de la placa de ocho pocillos. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para dispersar las células y permitir que se asienten durante cinco a 10 minutos. Coloque el portaobjetos de la cámara en un microscopio de fluorescencia invertida equilibrado a 30 grados Celsius.

A continuación, utilice la iluminación de campo claro para localizar un campo de células. Agregue 50 microlitros de medio YNB precalentado que contenga 100 microgramos por mililitro de metionina a los 200 microlitros de medio en el pocillo para obtener una concentración final de metionina de 20 microgramos por mililitro. Deje que las células se equilibren durante dos minutos antes de comenzar la toma de imágenes.

A continuación, inmediatamente antes de la toma de imágenes, ajuste el microscopio al plano focal deseado. Adquiera GFP en imágenes de campo claro o DIC a intervalos de 5 minutos durante 45 a 60 minutos. Uso de parámetros de adquisición idénticos para todas las imágenes dentro de una serie temporal.

Consulte el protocolo de texto para obtener detalles adicionales. Cuantifique la intensidad de fluorescencia de las células individuales en cada punto de tiempo y exprese los valores como un porcentaje de la intensidad inicial de la primera imagen. Después de exportar imágenes de acuerdo con el protocolo de texto en la imagen j, abra los archivos en el menú de archivos usando la opción Abrir.

Utilice la imagen de fluorescencia para la cuantificación y la imagen de campo claro o DIC como referencia para identificar la ubicación de las células. Excluya las células muertas presentes, que parecen más oscuras que las células vivas cuando se observan mediante DIC y autofluorescentes bajo el canal GFP. Para las imágenes con un fondo desigual en el menú Proceso, elija el algoritmo de sustracción de fondo y elija la configuración predeterminada.

Una vez que se han adquirido las imágenes, es importante realizar la sustracción de fondo antes de continuar con el procedimiento de cuantificación. Este paso es particularmente importante porque la señal de fondo podría enmascarar o amortiguar las diferencias entre las muestras. Con la herramienta de selección a mano alzada, delinee una celda asegurándose de incluir toda la celda, pero la menor cantidad posible de área fuera de la celda.

A continuación, en el menú Analizar, utilice la función de establecer mediciones para medir el área, la densidad integrada y el valor medio de gris. Abra el Administrador de ROI haciendo clic en Analizar, luego en Herramientas. En la ventana Administrador de ROI, haga clic en el botón Agregar para ingresar la región resaltada como un nuevo ROI.

Repita el contorno y la toma de medidas para las celdas restantes de la imagen, excluyendo las celdas muertas o las celdas que toquen el borde de la imagen. Guarde los ROI seleccionados como archivo zip haciendo clic en el botón de medición que mostrará los valores medidos en una nueva ventana. A continuación, haga clic en el botón más y exporte todas las mediciones a una hoja de cálculo o a un software de análisis estadístico.

Inocular dos o tres colonias de células de levadura y 0,5 mililitros de medio YNB, faltando nutrientes adicionales para mantener la selección de plásmidos. Cultive las células en un tambor de rodillo a 30 grados centígrados durante 16 a 24 horas. Agregue un mililitro de medio YNB que carezca de nutrientes adicionales para el mantenimiento del plásmido y crezca durante tres horas adicionales.

A continuación, transfiera un mililitro de células a cada uno de los dos tubos de fondo redondo de cinco mililitros. A continuación, añada 0,25 mililitros de medio YNB Met al primer tubo y 0,25 mililitros de medio YNB que contenga 100 microgramos por mililitro de metionina al segundo tubo para obtener una concentración final de 20 microgramos por mililitro. Para un gran número de muestras, escalonar la adición de metionina para acomodar el tiempo para el análisis de hechos.

Nuestro citómetro de flujo puede medir hasta 40 muestras por corrida. Añadimos metionina en lotes. Ocho muestras cada cinco minutos.

Esto asegura que todas las muestras se midan entre 45 y 50 minutos después de la adición de metionina. Incuba las células durante 45 minutos. A continuación, analice las células mediante citometría de flujo, seleccionando la dispersión directa o FS como medida del tamaño de la célula y mapee una intensidad de fluorescencia fluida de un filtro FITC como medida de la internalización de la carga.

Durante la incubación de 45 minutos, use los botones deslizantes para ajustar el voltaje de los canales FS y FITC para optimizar la detección del rango de tamaño y la intensidad de fluorescencia de las celdas de levadura que se utilizan. Mida la FS y la intensidad de fluorescencia para 10.000 células de cada condición. Con la configuración de velocidad de flujo alto, genere un diagrama de dispersión de FS contra la intensidad de fluorescencia haciendo clic en agregar gráfico.

A continuación, seleccione FITC para el eje x y FS para el eje y y grafique 1000 puntos. Utilizando la función de puerta y la condición Met de tipo salvaje, asigne una puerta vertical de modo que aproximadamente el 5% de las celdas más brillantes queden a la derecha de la puerta. Utilice esta compuerta para todas las demás condiciones del experimento.

Como se muestra aquí, se realizaron imágenes de lapso de tiempo de las células a intervalos de cinco minutos en ausencia o presencia de metionina para monitorear la internalización de GFP o Mup1 marcada con flúor y los cambios en la fluorescencia. Como era de esperar, la GFP y la Mup1 marcada con flúor permanecieron en la membrana plasmática en ausencia de metionina. Por el contrario, las células fotografiadas en presencia de metionina mostraron un agotamiento progresivo de la señal fluorescente de la superficie celular consistente con la internalización de la carga.

Sin embargo, la cinética de fluorescencia perdida en presencia de metionina se retrasó en las células Mup1 GFP en comparación con las células pHlourin Mup1. Estos diagramas de dispersión comparan la intensidad de fluorescencia de células ENTH1 de tipo salvaje o cuatro delta en presencia o ausencia de metionina después de aplicar una puerta vertical. El 4% de las células Met de tipo salvaje estaban contenidas en el lado derecho de la puerta correspondiente a las células más brillantes de la población, mientras que el 65% de las células de tipo salvaje no tratadas estaban contenidas en la puerta.

Por el contrario, las cuatro células delta ENTH1 no mostraron diferencias en la distribución de las células brillantes frente a las tenues, lo que es coherente con un defecto en la endocitosis. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar escalonar las horas de inicio de la realización de experimentos simultáneos, de modo que los datos del punto final se puedan recopilar después del mismo tiempo de tratamiento para todas las muestras.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los cribados genéticos florales, con el fin de responder a preguntas adicionales, como qué factores novedosos contribuyen al tráfico vesicular. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico vesicular exploraran aspectos de la atrición del endosoma, así como una vía ácida e independiente de la clatrina recién descubierta en la levadura en ciernes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar cargas de tipo florent para cuantificar eventos endocíticos en células vivas.