Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos
1 de noviembre de 2016
Los ácidos nucleicos son analitos comunes para evaluar sistemas biológicos; sin embargo, el sesgo de la manipulación enzimática puede causar preocupación. Aquí se describe un método para la detección sin marcadores de ácidos nucleicos utilizando polianilina. Esta tecnología de sensores sensible y rentable puede distinguir las diferencias de un solo nucleótido entre moléculas.
El objetivo general de este procedimiento es sintetizar polianilina dispersa en agua que podría usarse para detectar ácidos nucleicos de una manera libre de etiquetas. Esta técnica es un método rentable para detectar ácidos nucleicos. Los laboratorios que lo adopten lo encontrarán fácil, robusto y sensible.
La principal ventaja de la técnica es que no contiene marcadores y se puede utilizar para detectar directamente ARN y ADN, sin necesidad de manipulación enzimática. Esta técnica tiene potencial para nuevas tecnologías de diagnóstico y, dado que no utiliza una etiqueta, se puede utilizar para procesar muestras de pacientes con poca manipulación. La demostración visual ayudará a desmitificar el sensor.
Esta plataforma incluye la ciencia y la biología de los polímeros, que parecen muy exóticas, pero que, de hecho, son extraordinariamente fáciles de implementar. Disolver completamente la anilina en 60 ml de cloroformo en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Después de remover a 600 RPM durante cinco minutos, enfríe de cero a cinco grados centígrados con hielo.
Esto suele tardar de 15 a 20 minutos. A continuación, agregue dodecilbencenosulfonato de sodio a la solución de anilina en un matraz de fondo redondo mientras revuelve a 600 RPM. Disuelva el persulfato de amonio en 20 ml de agua y agréguelo gota a gota durante 30 minutos para evitar sobrecalentar la reacción.
Lleve a cabo la reacción a cero a cinco grados centígrados durante 24 horas. Observe que la mezcla de reacción inicialmente se vuelve de color blanco lechoso después de 15 minutos, luego marrón oscuro después de dos horas y finalmente a verde oscuro después de 24 horas. Luego deje que alcance la temperatura ambiente durante otras 24 horas.
Filtre la solución de dodecilbencenosulfonato de sodio PANI con un embudo buchner. Mezclar el filtrado con 80 ml de cloroformo y 120 ml de agua en un embudo de separación. Incubar la solución durante 24 horas a temperatura ambiente y luego recoger el PANI verde oscuro del embudo de separación, dejando sin reaccionar el dodecilbencenosulfonato de sodio y el APS en el sobrenadante acuoso.
Diluya la solución de PANI 10 X con agua de cloroformo, luego mezcle 200 microlitros de PANI diluido con 6,4 micromoles de oligonucleótidos de ADN de sonda meciendo suavemente durante 15 minutos en un tubo de microfuga. Irradie la solución de ADN PANI con 1200 microjulios por centímetro cuadrado de UV en un reticulante durante dos minutos. Es fundamental que la exposición a los rayos UV se limite a la cantidad indicada.
La exposición prolongada a los rayos UV compromete el cambio de fluorescencia en el PANI, probablemente debido a la fuga cruzada covalente de PANI y ADN. Complejos de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante seis minutos y lavado con solución salina tamponada con fosfato o PBS. Después de peletizar por segunda vez, vuelva a suspender en PBS.
Agregue ocho microlitros de 100 micromoles de oligonucleótidos de ADN complementarios o ácidos nucleicos objetivo a 200 microlitros de complejos de sonda PANI. Realice la hibridación meciendo la mezcla de solución durante 15 minutos a 40 grados centígrados. Después de peletizar los complejos PANI por centrifugación a 17.000 x g durante seis minutos, lavar con PBS y volver a suspender en agua.
Agregue PANI de diferentes tratamientos en una microplaca de 96 pocillos y mida la fluorescencia de emisión en el rango de 270 a 850 nanómetros por excitación a 250 nanómetros. Un pico de emisión para el PANI debería observarse alrededor de 500 nanómetros. Para realizar la medición de microscopía de fluorescencia del dúplex hibridado, aplique una capa de PANI sobre una cubierta de vidrio de borosilicato y séquela a 40 grados centígrados durante 48 horas.
Agregue ocho microlitros de sonda de 100 micromoles en una película PANI seca y luego irradie con luz ultravioleta durante dos minutos. Después de la radiación, lave la película de la sonda PANI con PBS y seque a 40 grados centígrados durante 48 horas. Realice la hibridación durante 15 minutos mediante la adición de ácidos nucleicos objetivo.
Puede tratarse de una muestra biológica o de un oligonucleótido objetivo controlado. Siga con un lavado PBS. Obtenga las imágenes fluorescentes con un aumento de 40x con un filtro de paso largo de 500 nanómetros.
Aquí se muestra la interacción electrostática de PANI y las sondas de ADN mejorada por la irradiación UV. La hibridación del ácido nucleico objetivo desencadena la formación de dúplex, cambiando la confirmación estructural, lo que resulta en la disociación del objetivo de la sonda de la superficie PANI. Esta figura muestra el cambio en la fluorescencia de PANI en ausencia o presencia de sonda, tanto en solución como en medio de recubrimiento sólido.
El aumento de la fluorescencia se debe al flujo de electrones del ADN cargado negativamente, lo que aumenta la densidad de electrones del polímero. Tras la hibridación de oligonucleótidos diana complementarios, las sondas se desprenden, lo que lleva a la restauración de la fluorescencia de la albahaca. Por el contrario, la hibridación con oligonucleótidos objetivo no coincidentes no da lugar a esta restauración de la fluorescencia de la albahaca.
La principal novedad de esta técnica es que utiliza rayos UV suaves para una interacción exacta y eso le ayuda a distinguir la interacción inespecífica de la luz. Una vez dominada, esta técnica podía tardar hasta dos horas, excluyendo el tiempo de los sentidos y el tiempo de secado de los recubrimientos. Al probar este procedimiento, es importante recordar que el ADN se disuelve en agua y el té ácido en realidad cambia la propiedad electrónica del PANI.
Después de ver este video, los espectadores deben tener una buena comprensión de cómo sintetizar polianilina dispersa en agua y usar sus propiedades fluorescentes para detectar ácidos nucleicos. Serán capaces de inmovilizar el ADN de la sonda y realizar la hibridación para detectar objetivos. Al trabajar con el monómero, es importante recordar que esta síntesis es peligrosa y debe realizarse en una capucha con equipos de protección como gafas de seguridad, guantes y batas de laboratorio.
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Resumen
Este artículo presenta un método para la detección libre de marcadores de ácidos nucleicos utilizando polianilina. La técnica es rentable y sensible, lo que permite distinguir diferencias de un solo nucleótido sin manipulación enzimática.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Química analítica
- Tecnologías diagnósticas
Antecedentes
- Los ácidos nucleicos son cruciales para evaluar los sistemas biológicos.
- La manipulación enzimática puede introducir sesgos en los métodos de detección.
- La detección sin etiquetas ofrece ventajas en el procesamiento de muestras.
- La polianilina es un material prometedor para la detección sensible.
Objetivo del estudio
- Sintetizar policloruro de anilina dispersado en agua para la detección de ácidos nucleicos.
- Desarrollar un método de detección robusto y de fácil uso.
- Explorar aplicaciones potenciales en tecnologías diagnósticas.
Métodos Utilizados
- Síntesis de polianilina dispersada en agua.
- Detección sin etiquetas de ARN y ADN.
- Demuestras visuales para facilitar la comprensión del sensor.
- Evaluación de la sensibilidad y rentabilidad.
Resultados principales
- El sensor puede detectar ácidos nucleicos sin etiquetas.
- Muestra alta sensibilidad frente a diferencias de un solo nucleótido.
- El método es sencillo y adecuado para muestras de pacientes.
- Se identificó el potencial para nuevas aplicaciones diagnósticas.
Conclusiones
- La detección sin marcado utilizando polianilina es eficaz y confiable.
- Esta técnica reduce la necesidad de manipulación de la muestra.
- Abre posibilidades para avances en tecnologías diagnósticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección sin etiqueta de ácidos nucleicos aborda un cuello de botella clave en el desarrollo de diagnósticos al eliminar pasos enzimáticos que introducen variabilidad y costo. El sensor basado en polianilina permite la detección directa y sensible de diferencias de un solo nucleótido, lo que apoya la validación temprana de dianas y la evaluación de la especificidad del ensayo. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al proporcionar una plataforma robusta y de bajo costo para la desactivación mecanicista de terapéuticos dirigidos a ácidos nucleicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección directa de objetivos de ácidos nucleicos sin etiquetado ni sesgo de amplificación.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional del objetivo al distinguir diferencias de un solo nucleótido, aclarando la especificidad del acoplamiento al objetivo.
- Valor predictivo: Mejora la selección de carteras al proporcionar lecturas cuantitativas sin etiquetado que reducen la ambigüedad mecanicista en las fases iniciales de cribado.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce sondas de polianilina estandarizadas y dispersables en agua, compatibles con lecturas de fluorescencia en placas de microtitulación para cribado escalable.
- Resultado cuantitativo: Genera cambios medibles de fluorescencia con excitación/emisión a 500 nm, lo que permite mediciones de respuesta a la dosis y de eficiencia de hibridación.
- Reproducibilidad: Los protocolos de reticulación con UV y lavado aseguran una inmovilización consistente de las sondas y señales uniformes de disociación del blanco entre réplicas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Detecta objetivos de ARN y ADN, lo que apoya aplicaciones en el análisis de expresión génica y cribado de mutaciones para modelos preclínicos.
- Continuidad traslacional: Permite avanzar desde objetivos de oligonucleótidos purificados hasta muestras biológicas complejas con mínimo procesamiento, apoyando flujos de trabajo alineados con biomarcadores.
- Avance ajustado al riesgo: Proporciona una visión temprana sobre la selectividad del objetivo, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas debido a interacciones fuera del objetivo con ácidos nucleicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del ensayo y el perfilado preclínico, ofreciendo una plataforma reutilizable para la detección de ácidos nucleicos en diversas modalidades.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir mediciones directas, sin marcadores, de la unión al blanco y la discriminación de variantes de un solo nucleótido.
- Selección: Aporta soporte al desarrollo de ensayos mediante lecturas de fluorescencia estandarizadas en formatos de 96 pocillos, lo que permite comparar compuestos o condiciones.
- Análisis: Proporciona datos cuantitativos de emisión de fluorescencia que permiten a los equipos evaluar la eficiencia de hibridación y la especificidad del blanco en condiciones controladas.
- Investigación Traducional: Conecta la detección in vitro con la compatibilidad con muestras de pacientes mediante requisitos mínimos de procesamiento, apoyando los esfuerzos de validación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una tecnología de plataforma aplicable a múltiples blancos de ácidos nucleicos, reduciendo los costos de redesarrollo en proyectos sucesivos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los falsos positivos derivados de artefactos de marcado y permitir una resolución a nivel de un solo nucleótido.
- Valor operativo: Proporciona estandarización y reproducibilidad mediante protocolos definidos de síntesis, reticulación con UV y lavado.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir los costos de reactivos e instrumentación en comparación con los métodos basados en marcado con PCR o fluorescencia.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo al ofrecer conocimientos mecanicistas tempranos sobre las interacciones entre ácidos nucleicos y sus objetivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la síntesis de polímeros y el manejo de ácidos nucleicos para garantizar una correcta inmovilización de las sondas y condiciones de hibridación.
- Depende de un cruzador de UV, centrífugas y lectores de placas con fluorescencia o microscopios para la detección de la señal.
- Necesita la estandarización del tiempo e intensidad de exposición al UV para prevenir el entrecruzamiento entre el polímero y el ADN, lo cual compromete la señal.
- Incluye consideraciones de adaptación al pasar de controles con oligonucleótidos a muestras biológicas complejas que contienen nucleasas o interferentes.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de manipular en la oscuridad los complejos sensibles al UV y la optimización de la densidad de las sondas para evitar impedimentos estéricos.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Processable PANI Synthesis
2:40
PANI-probe Mixing and UV Irradiation and Hybridization of PANI-probe
4:21
Emission Steady State Fluorescence Measurement and Fluorescence Microscopy Measurement of Hybridized Duplex
5:45
Results: Use of PANI Fluorescence to Detect Nucleic Acid Hybridization
6:53
Conclusion
