Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

El objetivo general de este experimento es estudiar las capacidades funcionales de linfocitos murinos purificados utilizando varios ensayos funcionales in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la Inmunología y la Biología Molecular. Por ejemplo, investigar la función de una proteína de interés en linfocitos deficientes en genes.

La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de purificar rápidamente los linfocitos con una mínima manipulación y estrés ambiental. Para purificar las células B, vuelva a suspender hasta una vez diez hasta el octavo glóbulo rojo, células enteras del bazo en 300 microlitros de solución salina equilibrada o BSS suplementada con FBS. A continuación, añada 50 microlitros de microesferas magnéticas anti-CD43.

Para eliminar las células muertas, agregue 30 microlitros de anexina cinco perlas magnéticas durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Mueva la suspensión de celdas a intervalos de 15 minutos para garantizar un etiquetado uniforme de las celdas. Al final de la incubación se colocaron las células marcadas con B con 14 mililitros de BSS suplementadas con FBS.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, agite el tubo y vuelva a suspender el pellet en uno a tres mililitros de BSS a temperatura ambiente suplementado con FBS. Durante la centrifugación, cargue una columna de separación en un bastidor magnético y fije una aguja estéril de calibre 21 a la punta de la columna para reducir el caudal. Equilibre la columna con dos mililitros de BSS a temperatura ambiente.

Después de volver a suspender el pellet en uno a tres mililitros de BSS a temperatura ambiente, coloque el tubo de recolección debajo de la aguja y luego cargue las celdas marcadas con B en la columna equilibrada. Recoja el flujo en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, enjuague la columna con un mililitro de BSS fresco suplementado con FBS.

Agrupando el lavado con las celdas objetivo recolectadas, vuelva a cargar la columna con la celda objetivo que contiene aluet, recogiendo el flujo en el mismo tubo de 15 milímetros. Y lavar la columna tres veces con un mililitro de BSS suplementado con FBS, continuando con la combinación de los lavados con una suspensión de células objetivo. Después del tercer lavado, retire la columna del imán y cárguela con cinco mililitros de BSS suplementado con FBS.

Uso del émbolo de columna para enjuagar las celdas no objetivo marcadas magnéticamente en un nuevo tubo de 15 mililitros. A continuación, compruebe la pureza de las células separadas mediante citometría de flujo. Para reutilizar una columna de separación, después de lavar las celdas marcadas con perlas magnéticas, lave la columna tres veces desde la parte superior con cinco mililitros de PBS por lavado y tres veces con cinco mililitros de agua destilada por lavado.

A continuación, lave la columna con cinco mililitros de etanol al 70 por ciento de la misma manera y use un grifo de aire para secar completamente la columna antes de almacenarla. Para reutilizar la columna en un nuevo experimento de purificación, vuelva a lavar la columna de abajo hacia arriba con cinco mililitros de etanol al 70 por ciento, seguido de dos lavados de PBS de cinco mililitros. Luego cargue la parte superior de la columna con cinco mililitros de PBS para un lavado final.

Y equilibrar la columna con dos mililitros de BSS a temperatura ambiente. A continuación, la columna se puede cargar con la población de células experimentales. Para etiquetar las células B purificadas con CFSE, lavar las células dos veces con una solución de etiquetado recién preparada en un tubo cónico de 15 mililitros.

Volver a suspender el segundo pellet a una concentración de dos veces 10 a la séptima celdas por mililitro en una solución de etiquetado fresca a 37 grados centígrados. Cada vez, centrifuga las muestras, retira el sobrenadante y mueve los tubos. A continuación, etiquete las células en una proporción de una parte de suspensión celular por una parte de solución CFSE de 10 micromolares recién preparada en la oscuridad durante 10 minutos a 37 grados centígrados.

Invertir el tubo cada dos minutos para asegurar una distribución uniforme del tinte. Se debe tener cuidado para asegurarse de que el pellet de celda esté completamente suspendido en una solución de etiquetado. Los aglomeraciones celulares pueden afectar a la homogeneidad del etiquetado CFSE.

Al final de la incubación, agregue medio RPMI para enfriar CFSE y lave las celdas dos veces en varios volúmenes de medio RPMI completo helado. Si las celdas se han marcado con éxito, la bolita será de color amarillo. A continuación, lave dos veces en PBS una placa de fondo plano de 96 pocillos recubierta con el estímulo adecuado.

En el caso de los linfocitos B marcados con CFSE, vuelva a suspender a tres veces 10 el sexto linfocito B por mililitro y complete el medio RPMI y siembre 100 microlitros de linfocitos B por pocillo en la placa recubierta por triplicado durante 72 horas. Mediante este método de agotamiento, la pureza de las células T OT1-CD8 aisladas en perlas puede aumentarse del 72,8 por ciento al 94,2 por ciento. A continuación, las células pueden marcarse con CFSE como se acaba de demostrar y transferir adoptivamente a los animales receptores para el análisis de su proliferación in vivo.

Además, el marcaje de anticuerpos anti-CD45.1 se puede utilizar para confirmar aún más la identidad de las células que expresan CFSE como las células T OT1-CD8 positivas para CD-45.1 del donante transferidas adoptivamente en los órganos linfoides de los ratones receptores. Alternativamente, las células T purificadas pueden estimularse in vitro y su proliferación puede evaluarse mediante la incorporación de timidina tritiada. Con este método también se logra un aumento significativo en la pureza de las células B esplénicas.

Facilitar oportunidades similares para el análisis funcional posterior de las células B purificadas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas. Al realizar este procedimiento, es importante mantener su suspensión de CI en hielo en todo momento, excepto durante la purificación y el etiquetado CFSE.

Los linfocitos purificados también se pueden utilizar en otros ensayos funcionales, como la inmunotransferencia, para determinar la capacidad de señalización terminal de los linfocitos modificados genéticamente. Después de ver este video, debería tener una mejor idea de cómo purificar las células B y T y cómo usar las células para varios ensayos funcionales in vitro e in vivo.