Name: Aislamiento y activación de los linfocitos murinos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a purificar linfocitos murinos mediante microesferas magnéticas anti-CD43 para estudios de inmunología y biología molecular. Este protocolo permite evaluar funciones celulares in vitro e in vivo con mínimo estrés ambiental.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El estudio es apoyado por el Ministerio de Educación, Singapur (ACRF Tier1-RG40 / 13 y Tier2-MOE2013-T2-2-038). El manuscrito fue editado por Amy Sullivan de Obrizus Comunicaciones.

Todos los ratones son criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos y todos los protocolos de ratón se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucional. 1. Preparación de tampones y reactivos <ol><li> Preparar Memorial Institute completa Roswell Park (RPMI) medio (10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI / ml) / estreptomicina (100 mg / ml), 55 mM 2-mercaptoetanol ). </li><li> Preparar 20x solución salina equilibrada (BSS) Lote 1 y 2, por separado. <ol><li> Preparar 20x BSS stock 1 (111 mM dextrosa, fosfato de potasio 8,8 mM, 26,7 mM de fosfato dibásico de sodio en 1 L de agua estéril) y añadir 40 ml de 0,5% de rojo fenol 20x BSS stock 1 antes del ajuste del volumen final. Filtro estéril utilizando 0,2 micras filtro antes de guardar a 4 ° C. </li><li> Preparar 20x BSS madre 2 (25,8 mM de cloruro de calcio dihidrato, 107 mM de cloruro de potasio, cap 2,73 M de sodioLoride, 19,6 mM de cloruro de magnesio hexahidratado, 16,6 mM de sulfato de magnesio en 1 L de agua estéril). Filtro estéril utilizando 0,2 micras filtro antes de guardar a 4 ° C. </li><li> Para preparar 1x BSS para uso experimental, diluir 50 ml de BSS stock 1 y 50 ml de BSS madre 2, por separado, en 400 ml de agua estéril cada uno. Combinar ambas soluciones diluidas, se ajusta a pH 7, y se añaden 20 ml de FBS (2%). Completar hasta 1 litro con agua esterilizada y el filtro estéril usando 0,2 micras filtro. NOTA: las soluciones madre del SRS se deben preparar por separado porque la mezcla de poblaciones concentradas directamente SRS podría dar lugar a la precipitación. </li></ol></li><li> De glóbulos rojos (RBC) Tampón de lisis <ol><li> Para preparar tampón de lisis RBC, la mezcla 9 partes de cloruro de stock de amonio (cloruro de amonio 155 mM en agua estéril) a 1 parte de la base Tris (Tris mM (hidroximetil) aminometano 130 en agua estéril, pH 7,65) antes de su uso. NOTA: las tiendas de soluciones madre estériles de cloruro de amonio y Tris-base a 4 ° C. Preparar lisis bUffer fresco para asegurar la lisis eficiente de los glóbulos rojos. </li></ol></li></ol> 2. Generación de linfocitos Suspensión de bazo o los ganglios linfáticos NOTA: Es importante preparar todos los reactivos y equipos necesarios para el experimento antes de la eutanasia y del ratón para generar suspensiones de células individuales de linfocitos tan pronto como sea posible para mantener la viabilidad celular por alto. <ol><li> La eutanasia experimental de ratón por dislocación cervical o asfixia con CO2. NOTA: A partir de este paso en adelante, todos los procedimientos experimentales deben llevarse a cabo de forma aséptica. </li><li> Sumergir todo el ratón en etanol al 70% antes de hacer ninguna incisión. Extirpar el bazo y los ganglios linfáticos de manera aséptica 8, y colocarlos en distintos tubos de 15 ml que contienen 5 ml de RPMI / FBS enfriado con hielo (RPMI con FBS al 2%) o BSS / FBS (del paso 1.2.3). NOTA: Como BSS impide eficiente lisis RBC, utilice RPMI para la preparación de la suspensión de células del bazo y cambiar a BSS faetlisis r RBC. </li><li> Para generar una suspensión de células de bazo o los ganglios linfáticos, coloque el órgano (s) entre dos piezas de malla de filtro de micras de células estéril 100 en una placa de Petri que contiene 2 ml enfriado en hielo RPMI / FBS o BSS / FBS. Usando el émbolo de una jeringa de 1 ml, triturar el órgano (s) hasta que se haya rasgado en partes muy finas. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y lavar la malla del filtro de células con helado de RPMI / FBS o BSS / FBS. Recoger la suspensión celular restante, añadirlo al mismo tubo de 15 ml y centrifugar a 453 g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. NOTA: Vuelva a suspender las células sedimentadas colocando el tubo con los dedos antes de la adición de tampón de lisis de glóbulos rojos o medio en los pasos posteriores. </li><li> Preparar temperatura ambiente tampón de lisis (RT) RBC durante la centrifugación de la suspensión celular (véase la etapa 1.3.). Después de la granulación de las células y eliminar el sobrenadante, volver a suspender las células con 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos por cada 10 8 células. Incubate la reacción de lisis a temperatura ambiente durante 3-4 min. </li><li> Deja de lisis de glóbulos rojos con 14 ml de helado de BSS / FBS y centrifugar a 453 g durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 3. Purificación de células B y T <ol><li> La purificación de las células B <ol><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Vuelva a suspender hasta 10 8 células esplénicas en 300 l BSS / FBS y se añaden 50 l anti-CD43 microbolas magnéticas 9,10. Para eliminar las células muertas, añadir 30 l perlas magnéticas Anexina V. Incubar la suspensión de células en un refrigerador 4 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> La purificación de las células T <ol><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Vuelva a suspender hasta 10 8 células en no-T cóctel de anticuerpos agotamiento de las células (anticuerpos biotinilados contra CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 y CD4 o CD8 en función de la población de células diana a ser purificado), diluido 1: 200 en 200 BSS l / FBS 4,5. Incubar la suspensión de células en una4 ° C refrigerador durante 15 min. </li><li> Después de la incubación, añadir 10 ml BSS / FBS para lavar las células y centrifugar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 165 l BSS / FBS con 30 microperlas de estreptavidina l y 15 l perlas magnéticas Anexina V. Incubar la suspensión de células en un refrigerador 4 ° C durante 30 min. NOTA: Para asegurar incluso el etiquetado con las microperlas magnéticas, incubar las células con microperlas de 15 min, a continuación, mezclar la suspensión de células suavemente tocando el tubo de 15 ml y se incuba otros 15 minutos durante la etapa 3.1.1. o 3.2.2. </li></ol></li><li> Preparación de la columna de separación para la purificación de la célula <ol><li> Preparar una columna de separación no utilizado durante el etiquetado de microperlas de las células (paso 3.1.1. O 3.2.2.). Pre-caliente BSS (sin FBS) a TA y utilizar 2 ml de lavar y equilibrar la columna de forma aséptica. Después de equilibrar con BSS, la columna se lava no se debe permitir que se seque. NOTA: Utilizamos el LS cOLUMNA lugar de la columna LD recomendada debido a su aptitud para la reutilización (véase el paso 3.4.). </li><li> Después del marcaje con las perlas magnéticas, añadir 14 ml BSS / FBS para lavar las células y centrifugar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1-3 ml de BSS RT. </li><li> Adjuntar una aguja estéril 21 G a la punta de la columna para reducir la velocidad de flujo durante el proceso de purificación. Cargar la suspensión celular en la columna equilibrada y se recoge el flujo a través que contiene las células diana purificadas. NOTA: Evitar la introducción de burbujas dentro de la columna durante la carga. </li><li> Lavar la columna una vez con 1 ml de BSS / FBS y se recoge el flujo a través que contiene las células diana purificadas. Actualizar la columna con el flujo a través una vez más. Recoger el flujo a través de después de la segunda carga en el mismo tubo de 15 ml. </li><li> Lavar la columna 3 veces con 1 ml de BSS / FBS y se recoge el flujo a través que contiene las células diana purificadas. A partir de entonces, se añaden 5 ml de BSS / FBS a thcolumna de dirección y, con un émbolo, a eliminar las células marcadas magnéticamente fuera de la columna en un nuevo tubo de 15 ml. </li><li> Comprobar la pureza de las células recogidas por citometría de flujo utilizando anticuerpos que se unen a antígenos de B purificada o células T 4,5 superficie. </li></ol></li><li> La reutilización de la columna de separación NOTA: La columna LS se puede reutilizar hasta 4 veces sin afectar a la eficiencia de purificación. <ol><li> Lavar la columna 3 veces con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS) y 3 veces con 5 ml de agua destilada por la parte superior mediante el émbolo. </li><li> Lavar la columna con 5 ml de etanol 70% y se seca la columna extensivamente usando un grifo de aire para evitar la acumulación de óxido en la columna. </li><li> Para preparar una columna LS usado para un experimento de purificación por separado, lavar la columna de abajo hacia arriba con etanol 5 ml de 70% utilizando el adaptador de la jeringa. A continuación, lavar la columna de abajo hacia arriba dos veces con 5 ml de PBS estéril, seguido por 5 ml de PBS una vez desde la parte superior de la columna. Añadir 2RT ml de BSS para equilibrar la columna y luego proceder a la carga de la columna con células marcadas. </li></ol></li></ol> 4. CFSE etiquetado y Estimulación NOTA: Purificado células se pueden someter a una variedad de in vitro y en ensayos funcionales in vivo. Aquí, nosotros usamos las células T purificadas para determinar la capacidad de estimulación de células T de APC 5. <ol><li> solución de pre-calentamiento de etiquetado (0,1% de FBS en PBS) a 37 ° C antes de la CFSE de carga. NOTA: El uso de un bajo porcentaje de FBS en PBS reduce la muerte celular durante la CFSE carga y reduce al mínimo la pérdida de células durante la centrifugación. Sin embargo, demasiado FBS pueden interferir con la carga CFSE. </li><li> Lavar las células purificadas dos veces con solución de etiquetado, a continuación, se resuspendieron a 2 x 10 7 células / ml en solución de etiquetado pre-calentado en un tubo de 15 ml. </li><li> Preparar 10 solución CFSE mu M (1: 500 dilución de CFSE mM solución madre 5) en solución de etiquetado pre-calentado. CFSE solución debedebe prepararse cada vez para conseguir el marcaje óptimo. </li><li> Para cargar las células con CFSE, añadir la suspensión de células de 1 parte a 1 M solución CFSE parte 10 en un tubo de 15 ml y se incuban en la oscuridad durante 10 min a 37 ° C. Una concentración final de 5 mM CFSE se utiliza para etiquetar 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Invertir el tubo cada 2 minutos para asegurar una mezcla homogénea de las células durante la CFSE de carga. </li><li> Para detener la reacción, añade varios volúmenes de medio RPMI completo enfriado con hielo y centrifugar a 453 g durante 5 min a 4 ° C. Al éxito CFSE de carga, el sedimento celular aparecerá amarillento. </li><li> Wash CFSE cargado células una vez más con medio RPMI completo enfriado con hielo y girar hacia abajo a 453 xg durante 5 min a 4 ° C antes de usar para el cultivo in vitro o la estimulación in vivo. </li></ol> 5. estimulación in vitro <ol><li> Preparar una solución 2x ​​social de estímulos (2x estímulos solución madre) inmediatamente antes de su uso para que 100 l de solución de los estímulos de la 2x se puede añadir a 100 l de células a un volumen final de 200 l por pocillo en una placa de 96 pocillos. </li><li> Si se requiere una placa recubierta con estímulos (IgM o CD40 para células B o CD3 y CD28 para las células T), diluir los estímulos en PBS y pre-capa de la placa de cultivo a 4 ° C durante la noche. Alternativamente, la placa de cultivo se puede recubrir a 37 ° C durante 1 hr en el día del experimento. Lavar la placa recubierta dos veces con PBS (No permita que la placa se seque en cualquier momento). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Para las células B </td><td></td></tr><tr><td> Los estímulos </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> F (ab &#39;) 2 de cabra anti-IgM de ratón </td><td> 0,6 a 2,4 g / ml </td></tr><tr><td> Anti-ratón CD40 </td><td> 0,5-2 mg / ml </td></tr><tr><td> recombinanteratón IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> lipopolisacárido </td><td rowspan="2"> 0,1 a 10 mg / ml </td></tr><tr><td> (LPS) de E. coli serotipo 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Para las células T </td><td></td></tr><tr><td> Los estímulos </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (placa recubierta) </td><td> 2-10 g / ml </td></tr><tr><td> (50 l / pocillo para el recubrimiento) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (placa recubierta) </td><td> 2 g / ml </td></tr><tr><td> Recombinante IL-2 </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (éster de forbol) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (ionóforo de calcio) </td><td> 250 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Concentraciones de estímulos que se utilizan para estimular los linfocitos en cultivo in vitro.<ol start="3"><li> Para las células B marcadas con CFSE, vuelva a suspender a 3 x 10 6 células / ml en medio RPMI completo y la cultura, por triplicado, con 3 x 10 5 células / pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano de 72 horas. </li><li> Para las células T marcadas con CFSE, volver a suspender a 0,5-3 x 10 6 células / ml en medio RPMI completo y la cultura por triplicado con 0,5-3 x 10 5 células / pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo de 48 o 72 horas . </li></ol> 6. En Vivo Estimulación <ol><li> Para la estimulación in vivo, la transferencia adoptiva de 4 x 10 6 células T marcadas con CFSE por ratón (por vía intravenosa (iv) en 200 l de PBS) en cada ratón receptor emparejado-MHC. NOTA: En este protocolo, las células T marcadas con CFSE se pueden transferir de manera adoptiva utilizando vena de la cola o inyección retro-orbital que estas células se alberga órganos linfoides como el bazo y los ganglios. </li><li> Desafiar a los ratones receptores un día después con el antígeno. NOTA:En este ejemplo, se utiliza la ovoalbúmina (proteína OVA, 50 g / ratón) como el antígeno porque específica de OVA, receptor de células T (TCR) las células T -transgenic se transfirieron adoptivamente en ratones receptores. Preparar la proteína OVA en PBS estéril e inyectar 100 l de proteína OVA / PBS o PBS control, a través de inyección subcutánea (IS), en cada ratón receptor 5. </li><li> Cosecha y generar suspensiones individuales de células de los órganos linfoides (ganglios linfáticos y el bazo) de los ratones receptores de 3 días después de la inmunización con la proteína OVA o PBS. ganglios linfáticos separadas en los ganglios linfáticos proximales (PLN), que incluye axilar, braquial y de los ganglios linfáticos cervicales superficiales) y los ganglios linfáticos distales (DLN), que incluye mesentérica, poplítea, inguinal, lumbar, y los ganglios linfáticos caudal. células de tinción de FACS utilizando los anticuerpos adecuados para detectar la proliferación de células T. NOTA: En este experimento de seguimiento de células CFSE, CFSE marcado con las células T de ratones de control inyectados con PBS establecer una fluorescencia de línea de base para los no-diViding células. Divisiones celulares de proliferación, las células, marcadas con CFSE estimulados por antígenos se visualizaron mediante la medición de los picos de fluorescencia 12,13. Con el control de PBS, el número de divisiones celulares de la proliferación, las células T marcadas con CFSE se puede determinar 12,13. </li><li> Analizar los datos de proliferación de células CFSE marcado mediante la comparación del número de divisiones celulares o picos entre las muestras (Figuras 1 y 2). NOTA: Por ejemplo, marcado con CFSE, las células T específicos de OVA adoptivamente transferidas en ratones receptores que recibieron el antígeno OVA se someterán a la proliferación activa en comparación con los ratones de control inyectados con PBS 5,12. Además, es digno de mención destacar que hay muchas maneras de analizar los datos de proliferación de células CFSE, como se demuestra por Hawkins y colegas 14. </li></ol>

<ol><li>Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li>
<li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+networks%3A+branched%2C+diversified+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li>
<li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li>
<li>Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%CE%B4+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li>
<li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li>
<li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, se demuestra un procedimiento para la purificación de los linfocitos de los órganos linfoides. la purificación de células utilizando la clasificación perla magnética es un método rápido y simple que produce células diana viables, altamente purificados. Los pasos críticos dentro del Protocolo La viabilidad celular y el rendimiento celular El mantenimiento de la viabilidad de las células del linaje hema...

Los linfocitos maduros generalmente existen en estado de reposo si no hay infección o inflamación preexistente en el individuo. Por lo tanto, es importante mantener el estado previo de los linfocitos durante el proceso de aislamiento antes de realizar ensayos funcionales in vitro o in vivo. La clave para garantizar resultados consistentes y reproducibles es limitar cualquier manipulación innecesaria de las células. 
La clasificación magnética de células utiliza anticuerpos y microperlas para etiquetar las células con el fin de enriquecer la población celular de interés. Con este enfoque, hay dos estrategias de purificación: el enriquecimiento positivo y el agotamiento negativo. El enriquecimiento positivo enriquece la población celular de interés utilizando un anticuerpo que se une a las células diana. El agotamiento negativo, por otro lado, agota las células no objetivo, dejando la población celular de interés. En nuestro laboratorio, preferimos el agotamiento negativo al enriquecimiento positivo porque la unión de los anticuerpos a las células diana podría alterar las características y el comportamiento de la célula. De hecho, muchos marcadores de superficie celular establecidos adecuados para el aislamiento de una población celular particular también son receptores funcionales. 
La clasificación de células magnéticas no solo produce poblaciones altamente puras de células diana viables, sino que también requiere menos tiempo y evita el estrés celular inducido por el flujo de alta presión utilizado en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Al etiquetar las poblaciones celulares no deseadas y agotarlas mediante una columna de separación magnética, podemos realizar un aislamiento celular rápido sin comprometer la viabilidad de la población celular objetivo. En este protocolo, demostramos el uso de estrategias de depleción negativa para purificar células B o células T vírgenes.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (sin L-Glutamina)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td></td><td></td> Fetal Bovino <td>Inactivado por el calor&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas magnéticas anti-CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Mezclar bien antes del uso</td></tr><tr><td>Microesferas de estreptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Mezclar bien antes del uso</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas anti-anexina V</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Mezclar bien antes del uso</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo estéril con fondo en U de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo estéril con fondo F de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m malla</td><td></td><td></td> de filtro de células <td>Para esterilizar usando radiación UV uso previo</td></tr><tr><td>0.2 &mu; m&nbsp; unidades de filtro desechables estériles</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Puede ser sustituido por cualquier dispositivo de filtro estéril</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV para abreviar; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY para abreviar; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR para abreviar; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>Tinte de proliferación celular eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 para abreviar; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternativa a CFSE</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fenol rojo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Se puede utilizar de otras fuentes</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>(5-(y 6-) diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidilo (CFSE)</td><td>Sondas moleculares</td><td>C-1157</td><td>Reconstituir en DMSO</td></tr><tr><td>Forbol 12,13-dibutirato (PBDU, éster de Forbol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Ionóforo de calcio)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte> </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticuerpos y proteína recombinante</td>CD11b biotina (clon m1/70)Biolegend 101204 Cóctel de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>depleción de células T</td></tr><tr><td>CD11c biotina (clon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>Cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>Biotina Gr-1 (clon RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>Ter119 biotina (clon Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>TCR-&gamma; &delta; biotina (clon GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>Cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>CD19 biotina (clon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>Cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>B220 biotina (clon RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>Cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>CD49b biotina (clon DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>Cóctel de depleción de células T</td></tr><tr><td>CD4 biotina (clon GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Cóctel de depleción de linfocitos T</td></tr><tr><td>100404 CD8 biotina (clon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>Cóctel de depleción de linfocitos T</td></tr><tr><td>F(ab')2 IgM anti-ratón de cabra (recubierto de placa)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD40 mAb (recubierto de placa)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos)</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>ProSpec recombinante;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS de E. coli Serotipo 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clon clon OKT3) (placa recubierta)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clon clon 37.51) (recubierto de placa)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 y micro; l/pocillo para recubrimiento (96 pocillos)</td></tr><tr><td>Albúmina recombinante IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>de clara de huevo de gallina, ovoalbúmina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

células B y T, con sus repertorios de antígenos-receptores extremadamente diversos, tienen la capacidad de montar respuestas inmunitarias específicas contra casi cualquier patógeno invasor1,2. Es comprensible que estas intrincadas capacidades estén controladas por un gran número de moléculas implicadas en diversos procesos celulares paragarantizar respuestas inmunitarias oportunas y espacialmente reguladas. Aquí, describimos procedimientos experimentales que permiten el aislamiento rápido de linfocitos murinos altamente purificados utilizando tecnología de clasificación de células magnéticas. Los linfocitos purificados resultantes pueden ser sometidos a diversos ensayos funcionales in vitro o in vivo, como la determinación de la capacidad de señalización de los linfocitos tras la estimulación por inmunotransferencia4 y la investigación de las capacidades proliferativas mediante la incorporación de 3H-timidina o el marcaje de éster succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)5-7. Además de comparar las capacidades funcionales de los linfocitos control y los linfocitos modificados genéticamente, también podemos determinar la capacidad estimuladora de las células presentadoras de antígenos (APC) in vivo, como se muestra en nuestros resultados representativos utilizando células T OT-I trasplantadas marcadas con CFSE.

purificación celular magnética de linfocitos permite a los usuarios para purificar una población de células diana en un período relativamente corto de tiempo. Utilizando el protocolo de agotamiento, hemos sido capaces de aumentar el porcentaje de células T CD8 (OT-I en la recombinación de activación de gen-1 (RAG-1) ratones deficientes) de 72,8% (antes de la purificación) a 94,2% (después de la purificación; Figura 1 A) 4,5. Estos linfocitos purificados se pue...

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

El objetivo general de este experimento es estudiar las capacidades funcionales de linfocitos murinos purificados mediante diversos ensayos funcionales in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la Inmunología y la Biología Molecular, como investigar la función de una proteína de interés en linfocitos deficientes en un gen determinado.La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de purificar rápidamente linfocitos con manipulación mínima y bajo estrés ambiental. Para purificar células B, re-suspenda hasta un multiplicado por diez a la octava células esplénicas lisadas de glóbulos rojos en 300 microlitros de solución salina equilibrada o BSS suplementada con FBS. Luego agregue 50 microlitros de microesferas magnéticas anti-CD43.Para eliminar las células muertas, agregue 30 microlitros de microesferas magnéticas de anexina V durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Agite suavemente la suspensión celular cada 15 minutos para asegurar una marcación uniforme de las células. Al final de la incubación, lave las células marcadas con 14 mililitros de BSS suplementado con FBS.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, golpee suavemente el tubo y re-suspenda el botón en uno a tres mililitros de BSS a temperatura ambiente suplementado con FBS. Durante la centrifugación, coloque una columna de separación en un soporte magnético y conecte una aguja estéril de calibre 21 a la punta de la columna para reducir la velocidad de flujo. Equilibre la columna con dos mililitros de BSS a temperatura ambiente.Después de resuspender el pellet en uno a tres mililitros de BSS a temperatura ambiente, coloque el tubo de recolección debajo de la aguja y luego cargue las células marcadas con B en la columna equilibrada. Recoja el flujo que atraviesa en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, enjuague la columna con un mililitro de BSS fresco suplementado con suero bovino fetal.Al combinar el lavado con las células diana recolectadas, recargue la columna con el eluyente que contiene las células diana, recolectando el flujo directo en el mismo tubo de 15 mililitros. Lave la columna tres veces con un mililitro de BSS suplementado con FBS, continuando con la combinación de los lavados con la suspensión de células diana. Después del tercer lavado, retire la columna del imán y cárguela con cinco mililitros de BSS suplementado con FBS.Utilice el émbolo de la columna para expulsar las células no diana marcadas magnéticamente hacia un nuevo tubo de 15 mililitros. Luego, verifique la pureza de las células separadas mediante citometría de flujo. Para reutilizar una columna de separación, después de expulsar las células marcadas con perlas magnéticas, lave la columna tres veces desde la parte superior con cinco mililitros de PBS por lavado y tres veces con cinco mililitros de agua destilada por lavado.A continuación, lave la columna con cinco mililitros de etanol al 70 por ciento de la misma manera y use una pera de aire para secar completamente la columna antes de almacenarla. Para reutilizar la columna en un nuevo experimento de purificación, lávenla nuevamente desde la parte inferior hacia arriba con cinco mililitros de etanol al 70 por ciento, seguido de dos lavados con PBS de cinco mililitros cada uno. Luego, cargue la parte superior de la columna con cinco mililitros de PBS para un lavado final.Y equilibre la columna con dos mililitros de BSS a temperatura ambiente. Luego, la columna puede cargarse con la población celular experimental. Para etiquetar las células B purificadas con CFSE, lave las células dos veces con solución de etiquetado recién preparada en un tubo cónico de 15 mililitros.Re-suspender el segundo pellet a una concentración de dos veces 10 a la séptima células por mililitro en solución de marcado fresca a 37 grados celsius. En cada ocasión, centrifugar las muestras, eliminar el sobrenadante y agitar ligeramente los tubos. Luego, marcar las células en una proporción de una parte de suspensión celular a una parte de solución fresca de CFSE 10 micromolar, en la oscuridad, durante 10 minutos a 37 grados celsius.Invierta el tubo cada dos minutos para asegurar una distribución uniforme del colorante. Debe tenerse cuidado para asegurar que el pellet celular se suspenda completamente en la solución de marcado. Los agregados celulares pueden afectar la homogeneidad del marcado con CFSE.Al final de la incubación, agregue medio RPMI para detener la reacción del CFSE y lave las células dos veces con varios volúmenes de medio RPMI completo frío con hielo. Si las células han sido marcadas con éxito, el precipitado tendrá un color amarillo. A continuación, lave dos veces una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta con el estímulo adecuado con PBS.Para las células B marcadas con CFSE, re-suspenda hasta tres veces 10 a la sexta células B por mililitro en medio RPMI completo y siembre 100 microlitros de células B por pocillo en la placa recubierta, en réplicas triples, durante 72 horas. Mediante este método de agotamiento, la pureza de las células T OT1-CD8 aisladas con perlas puede aumentarse del 72,8 % al 94,2 %. Luego, las células pueden marcarse con CFSE como se acaba de demostrar y transferirse adoptivamente a animales receptores para analizar su proliferación in vivo.Además, la marcación con anticuerpos anti-CD45.1 se puede utilizar para confirmar aún más la identidad de las células que expresan CFSE como linfocitos T CD8 OT1 donantes CD45.1 positivos transferidos adoptivamente en los órganos linfoides de los ratones receptores. Alternativamente, los linfocitos T purificados se pueden estimular in vitro y su proliferación se puede evaluar mediante la incorporación de timidina tritiada. Este método también logra un aumento significativo en la pureza de las células B esplénicas.Facilitar oportunidades similares para el análisis funcional posterior de las células B purificadas. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos horas. Al realizar este procedimiento, es importante mantener la suspensión de CI siempre en hielo, excepto durante la purificación y la etiquetación con CFSE.Los linfocitos purificados también pueden utilizarse en otros ensayos funcionales, como el inmunotransferencia, para evaluar la capacidad de señalización del extremo terminal de linfocitos modificados genéticamente. Después de ver este video, debería tener una idea más clara de cómo purificar células B y T y de cómo utilizar estas células en diversos ensayos funcionales in vitro e in vivo.

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Se presenta un protocolo para producir antígenos específicos de células T de ratón usando la transducción...

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

Un modo eficaz de aislar los linfocitos de ratón tracto genital se describe. Este método tiene la ventaja de digestión enzimática y separación por gradiente de Percoll para permitir el aislamiento eficiente. Esta técnica es también adaptable a para su uso en otras...

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

El aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y la disgregación mecánica para obtener células reticulares fibroblásticas, células linfáticas y endoteliales sanguíneas. En el procedimiento descrito, se combina una digestión corta con una desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación de los marcadores de superficie de las células estromales de los ganglios linfáticos viables.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Aprende a purificar linfocitos murinos mediante microesferas magnéticas anti-CD43 para estudios de inmunología y biología molecular. Este protocolo permite evaluar funciones celulares in vitro e in vivo con mínimo estrés ambiental.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Explorar más videos