Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como cómo los canales iónicos individuales dependientes de voltaje contribuyen a las funciones de una neurona específica. La principal ventaja de esta técnica, es que permite mapear la función de los canales iónicos a nivel subcelular en las neuronas. Comience este procedimiento colocando el cerebro en una placa de Petri de 9 centímetros con la parte inferior cubierta con una capa de SiliGuard.

A continuación, rodee el cerebro con sacarosa helada-ACSF. Para preparar cortes coronales, haga dos cortes para eliminar el cerebelo y la parte rostral del cerebro. A continuación, aplique pegamento de cianoacrilato en la bandeja de muestras y pegue el bloque de cerebro a la bandeja de modo que la parte rostral quede frente a la etapa de corte.

Posteriormente, aplique unas gotas de sacarosa-ACSF en el cerebro y sumerja lentamente la bandeja en la cámara de corte. Luego, ajuste la hoja de afeitar en un ángulo de 15 grados con respecto al plano horizontal. Corte cortes coronales de cerebro de unos 500 micrómetros en la dirección nasal antes de alcanzar la sustancia negra.

A continuación, ajuste el grosor para cortar rodajas de 300 micrómetros que contengan la región de interés. Separe las rodajas del bloque de tejido con una aguja de profusión muy fina unida a una jeringa paralela al borde de la hoja de afeitar. Después de eso, transfiera las rodajas a la cámara de reserva a 34 grados centígrados durante una hora.

En este procedimiento, transfiera un trozo de cerebro a la cámara de grabación. Ancle el corte en el fondo de la cámara de grabación con un anillo de platino y asegúrese de que el corte sea de buena calidad con una superficie lisa y uniforme. A continuación, seleccione una neurona con una dendrita que se extienda a lo largo de una larga distancia en el mismo plano, y asegúrese de que la dendrita de interés pueda seguirse hasta un soma bien definido.

A continuación, llene la pipeta de parche con solución de electrodos. Para parchear la dendrita en el modo de conexión a celdas, identifique y concéntrese en una parte de la dendrita. Aplique presión positiva a la pipeta y bájela con el micromanipulador.

A continuación, coloque la pipeta cerca de la membrana y ajuste la presión para crear un pequeño hoyuelo. A continuación, libere la presión sobre la punta de la pipeta y parchee la dendrita, mientras controla la resistencia de la pipeta. Intente obtener una resistencia de sellado superior a un gigaohmio, en el mejor de los casos entre tres y diez gigaohmios, para las grabaciones conectadas a la celda.

A continuación, retraiga la pipeta de la membrana, un par de micrómetros, para evitar la deformación de la dendrita. Las corrientes de acción observadas aquí representan los potenciales de acción espontánea de las neuronas nigrales. Para suprimir las corrientes de acción, aplique bloqueadores de los canales de calcio y sodio a la ACSF.

A continuación, aplique un paso de voltaje de 90 milivoltios, a partir de un potencial de retención de cero milivoltios, para evocar la corriente catiónica activada por hiperpolarización. Al final de la grabación, rompa el parche para lograr el modo de celda completa. Después de eso, retire lenta y suavemente la pipeta dendrítica de la membrana neuronal para obtener un parche de afuera hacia afuera.

Para grabar desde el soma correspondiente en el modo de célula completa, localice el soma correspondiente de la dendrita. Baje una pipeta con resistencia entre cinco y diez megaohmios con una solución intracelular a base de potasio al cuerpo celular. A continuación, aplique una breve presión negativa a la punta de la pipeta para romper la membrana y lograr el modo de célula completa.

Verifique la identidad de la neurona en el modo de pinza de corriente aplicando largos pasos de corriente hiper y despolarizante, y permita que la biocitina de la pipeta se difunda a lo largo de las dendritas. Después de 10 minutos, retire la pipeta para obtener un parche de exterior. Utilice una secuencia de movimientos laterales cortos hacia arriba para favorecer el correcto cierre de la membrana celular, una vez que la pipeta está por encima del corte, para salir completamente de la cámara de registro.

Mantenga el corte en la cámara de registro durante 15 minutos adicionales en ACSF estándar para permitir el equilibrio de la biocitina y la neurona registrada. A continuación, transfiera suavemente la rodaja a un frasco de vidrio ámbar de 25 mililitros que contenga ACSF estándar para histología. En este procedimiento, ubique aproximadamente la neurona marcada fluorescentemente en la rebanada con epifluorescencia.

Examine brevemente el árbol dendrítico de las neuronas y localice el axón y la ampolla axonal utilizando un objetivo 10X. A continuación, cambie al microscopio confocal y seleccione el diodo láser de 488 nanómetros para excitar la neurona marcada. Siga la extensión del axón y las dendritas en el eje Z y grabe imágenes sucesivas para obtener una pila Z para toda la célula.

Ajuste la resolución del eje Z y recopile las imágenes confocales de la celda con un aumento bajo y alto. Al final, abra el archivo de imagen de la neurona con un software de imágenes. Compare la imagen de proyección Z con una imagen IR-DGC a ojo para localizar la posición precisa de la pipeta de parche durante el registro electrofisiológico.

Aquí se muestra la imagen IR-DGC de una neurona dopaminérgica y una pipeta en la dendrita proximal. La traza de corriente muestra la capacidad de las corrientes de fuga EN en respuesta a un comando de voltaje de cinco milivoltios, en configuración conectada a la celda, con una resistencia de sellado de cinco gigaohmios. El paso de voltaje hiperpolarizante, a partir de un potencial de membrana de cero milivoltios, indujo una corriente catiónica activada por hiperpolarización que se activaba lentamente.

La traza de corriente se invirtió y se ajustó con una sola función exponencial, lo que da una constante de tiempo de 632 milisegundos. Aquí están las respuestas de voltaje de toda la celda registradas soma a pulsos de corriente hiper y despolarizantes de un segundo en presencia de bloqueadores de corriente de sodio y calcio dependientes de voltaje para eliminar los potenciales de acción durante la grabación conectada a la celda. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar obtener tejido sano y condiciones de registro estables. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales como la identidad de la neurona registrada. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurofisiología exploraran la función de las propiedades y el papel de los canales iónicos dependientes de voltaje en células excitables.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar y examinar la distribución de las corrientes que fluyen a través de los canales iónicos dependientes de voltaje en las dendritas.