Name: Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a realizar grabaciones de patch-clamp subcelulares en dendritas de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. Este método permite mapear la función de canales iónicos a nivel subcelular con alta estabilidad.

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Doy las gracias a Dr. Vincent Seutin por su constante apoyo, Christelle Gillissen y Laurent Massotte por su excelente asistencia técnica, doctores Jean Defourny y Sandra Ormenese por los consejos con el microscopio confocal, Dr. Jacques Destiné por el don del segundo amplificador Axopatch 200B, el GIGA-Imaging plataforma para compartir el microscopio confocal y el software Imaris y el Dr. Stephen Freeman para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de los FRS belgas - FNRS (U.N002.13 y T.N0015.13) y publicado con el apoyo de la Fundación Universidad belga (Publié avec le concours de la Fundación Universitaria de Belgique).

El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

Este informe describe un protocolo paso a paso para implementar registros de célula entera somatodendríticos duales y grabaciones dendríticas locales. Es útil para la determinación de la influencia de los canales iónicos (es decir, I H) en el curso temporal de los potenciales postsinápticos y mapeo de la distribución del canal iónico (I h) a lo largo del dominio somatodendrítica de neuronas DA nigrales, respectivamente. Resultantes mediciones electrofisiológicas se combinan para publicar histoquímica hoc para recuperar la morfología celular. Se empleó el procedimiento para investigar las neuronas DA situados en la sustancia negra, pero puede ser generalizada para las neuronas de la sustancia negra vecinos de GABA, las neuronas DA área tegmental ventral o otras neuronas del cerebro medio. Todos los pasos también pueden ser seguidos para examinar otros canales iónicos expresados en dendritas de las neuronas de la sustancia negra sin modificaciones importantes. Visualización post hoc es particularmente pertinente para las neuronas con axones de soportedendritas, como las neuronas de la sustancia negra, 25,26 interneuronas del hipocampo Oriens-alveus 21 o algunas neuronas piramidales CA1 67. Curiosamente, las neuronas que comparten esta característica parece ser más común de lo que generalmente se piensa 67. El análisis morfológico revela también la posición exacta de los electrodos y del axón. La detección de este último puede ser optimizado por el etiquetado de las proteínas expresadas en el segmento axonal inicial (canales de Na + dependientes de voltaje o Ankyrin G) mediante inmunohistoquímica 68,69. La fiabilidad de los datos recogidos con grabaciones dendríticas y etiquetado neuronal posterior siempre depende de la calidad de la rebanada. esfuerzo máximo necesita, por tanto, que debe aplicarse para preservar la viabilidad de las células dentro del tejido. Esto se consigue con un manejo suave de los animales sanos, herramientas de alta calidad y reactivos, la oxigenación suficiente de las temperaturas del tejido y heladas durante la preparación de las rebanadas. condiciones de grabación estables dependen de la selección de las neuronas sanas. En el modo de células enteras, la resistencia serie debe inicialmente ser tan bajo como sea posible y mantenido constante durante todo el experimento. La estabilidad de las grabaciones depende más de manipuladores de alta calidad carentes de deriva y las vibraciones. Estas perturbaciones pueden ser reducidos mediante la optimización de la estabilidad de la pipeta: comprobar la conexión a soporte de pipeta y para cabezal de la platina, el control de cables que son micromanipulador holgura, evitar cambios bruscos de temperatura o movimiento de la platina y de comprobar el mecanismo del manipulador. Para grabaciones duales, metilsulfato 13,15,21 se ha incluido en la solución intracelular, pero gluconato 9,14,25 alternativamente se pueden emplear. Sin embargo, el anión principal puede alterar el potencial de membrana 70,71 y algunas corrientes dependientes de voltaje 72. solución intracelular puede ser complementado con ATP, GTP y fosfocreatina para preservar la physiologicas funciones de las neuronas. Además, la adición de un colorante fluorescente en la solución de la pipeta (por ejemplo, Alexa 594 o sulforodamina 101 41) para visualizar las dendritas durante una grabación somática puede ser útil por ejemplo para colocar una aplicación de presión (Figura 7 en la Ref. 41) o un estimulante eléctrico pipeta. La solución de la pipeta para las grabaciones adjunta células contiene una alta concentración de K + y Na + sin registrar grandes I h. Cabe destacar la relación de la concentración de Na + / K + influye en la amplitud de la corriente 10, el potencial de inversión de la corriente 11 y la compuerta de I h 73. Alternativamente, I h también se pueden grabar utilizando fuera de espera 10. En esta configuración de grabación sin embargo, el medio intracelular en la proximidad de los canales puede ser perturbado. En consecuencia, las diferencias en la activación dependiente de la tensión de I &lt;sub&gt; h se observa cuando se comparan las corrientes obtenidas usando parches adjunta células y fuera de espera 10. Hinchazón de las neuronas se encuentra ocasionalmente durante la grabación de patch-clamp, y, a menudo surge de causas distintas, tales como la baja calidad del agua, fuerte desequilibrio de la osmolaridad o pH entre el 39 soluciones o errores intra y extracelular en la composición de las soluciones. La calidad de los registros electrofisiológicos tiene una incidencia directa sobre la calidad de la morfología de las neuronas recuperados. Alta resistencia pipetas somáticas se utilizan para grabaciones duales (6 - 10 mO, como en Refs 6,11.) Y para las grabaciones somáticos individuales después de grabaciones adjunta células para reducir al mínimo la dilución del medio intracelular 14. Por lo tanto, la grabación somática de células enteras después de la grabación adjunta celular se mantiene corto (&lt;10 min). parches exterior hacia fuera tanto de la somáticas y pipetas dendríticas son esenciales para el cierre correcto de la cmembrana ell y la posterior recuperación de la morfología celular. Además de la estructura de la célula, el contenido neuroquímico se puede determinar para las neuronas registradas 59,74. Por ejemplo, el intracelular tirosina hidroxilasa proteína se puede immunolabeled para la identificación inequívoca de las neuronas DA 13. Neuronas DA se concentran principalmente en la SN pars compacta, con una densidad mucho más baja presente en el SN pars reticulata, donde se entremezclan con un mayor número de neuronas GABA 75. Mientras que el cuerpo celular de las neuronas DA es a menudo mayor que el de neuronas GABA, la identificación visual de estas células con IR-videomicroscopy es incierto y parcialmente impedido por la opacidad de los pars compacta. Para evitar estas limitaciones, la pre-selección de las neuronas DA puede ser facilitada por el uso de ratones transgénicos que expresan un marcador fluorescente en una población específica de neuronas (TH 65 o DAT para neuronas DA, GADpara las neuronas GABA) y la iluminación de epifluorescencia. Alternativamente, un colorante fluorescente puede ser incluido en la solución del electrodo somática para facilitar la visualización de las dendritas. El aumento de la resolución de la célula fluorescente es traído por hilatura Nipkow confocal de disco 14,22,30 o microscopía de dos fotones 7 combinado con IR-DGC 6. Varias ventajas están relacionadas con DGC en comparación con DIC. En primer lugar, ya que no se requieren prismas DIC, la imagen IR-DGC puede ser superpuesta con una imagen de fluorescencia 49,52,53,76. En segundo lugar, DGC se puede combinar con la fotoestimulación y optogenética 77. Una desventaja de rebanada preparación es la preservación de la integridad de las neuronas. Neuronas DA extienden sus dendritas en los tres planos del espacio 78,79 y por lo tanto el truncamiento del compartimiento dendríticas no pueden evitarse por completo en rodajas 80. La elección de la orientación de las rebanadas (coronal, horizontal o parasagital) es un trade-off. El origen de la inervación y el diseño experimental se debe considerar para seleccionar la orientación correcta de las rebanadas. parches dendríticas directa es la técnica utilizada para mapear la distribución de los canales iónicos funcionales en los diferentes compartimientos de las células. Además, esta técnica ofrece para determinar la variabilidad en las propiedades funcionales de los canales 20. Como complemento de la ubicación y densidad de los canales iónicos se pueden determinar mediante inmunohistoquímica en los niveles de luz y microscopía electrónica 17,23. Este enfoque también ofrece la posibilidad de determinar la densidad de canales en las estructuras de pequeño calibre que son inaccesibles para las pipetas de parche. Sin embargo, estos canales pueden estar en un estado funcional distinta 24 o incluso inactivos en comparación con los registrados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas técnicas son, por tanto, necesaria para obtener una imagen completa de la ubicación y las propiedades decanales iónicos en una región celular específica 17. Con el desarrollo de colorantes sensibles al voltaje, de formación de imágenes de tensión se ha utilizado para examinar la propagación de puntos de acceso y los EPSP en las neuronas en múltiples lugares 81. Como alternativa a las grabaciones de doble patch-clamp, este enfoque aún se puede implementar para dendritas finas que no son accesibles a las pipetas de parche, pero requieren una calibración precisa de la señal y el promedio. Si bien las neuronas DA en el SN y el área tegmental ventral son ampliamente investigados a través de grabaciones somáticas en el contexto fisiológicos y fisiopatológicos, las propiedades funcionales de sus dendritas sigue siendo en gran parte desconocidos en ambas condiciones. Parches de dendritas se ha implementado para las neuronas dopaminérgicas nigrales por varios grupos con éxito 13,25,26 y sigue siendo el método de elección para diseccionar propiedades excitables de estas estructuras subcelulares finas 8. grabaciones dendríticas proporcionan una mayor opportunidad de controlar la eficiencia y la plasticidad de la transmisión sináptica y la plasticidad de la excitabilidad dendríticas 82,83.

Las neuronas reciben información sináptica predominantemente en sus dendritas. Excitatorios e inhibitorios señales sinápticas extendido de su sitio de generación en el sitio de integración, donde los potenciales de acción (AP) son evocados como la señal de salida. En su camino, los potenciales sinápticos están influenciados tanto por la estructura de las dendritas y la interacción entre propiedades de la membrana pasivos y activos. La combinación de estos parámetros muy variables ensancha la potencia de cálculo de las neuronas 1,2. Sin embargo, el pequeño diámetro de las dendritas impide sin embargo el estudio de sus propiedades eléctricas. El continuo desarrollo de la técnica de patch-clamp 3, la óptica 4 y el perfeccionamiento de los métodos para la preparación rebanada 5 durante las últimas décadas han permitido a las grabaciones de muy delgada (0,7 - 3 m Ø) 6,7 dendritas. Estos métodos eran, y son, en gran medida todavía utilizan para examinar la excitabilidad de las dendritas en una variedad of 8 neuronas. Grabaciones directas dendríticas son esenciales para determinar la distribución 9-19 y las diferencias en las propiedades funcionales de los canales iónicos 20-22 en compartimentos neuronales distintas. Estos datos son el complemento necesario de la distribución de los canales iónicos detectada por inmunohistoquímica, combinado a la luz y microscopía electrónica 23,24. Grabaciones somatodendríticos duales se han implementado para explorar la propagación de los potenciales de acción 9,13-15,21,22,25-27 y propagación de los potenciales sinápticos 13,16,18 a lo largo del dominio somatodentrítica de las neuronas, la obtención de modelos detallados de cable pasivas 28- 30 e investigar la resolución temporal de la integración neuronal 31. La sustancia negra (SN) es una región situada en el cerebro medio implicado en diversas funciones tales como el control de movimiento, la codificación de la recompensa y comportamientos habituales. La disminución de la dopamina debido a la específicala pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en el SN está asociado con los trastornos motores observados en los pacientes que sufren de la enfermedad 32 de Parkinson. El circuito nigral se compone de dos tipos de células principales: dopaminérgicas y GABAérgicas neuronas. Curiosamente, estas neuronas tienen varias características que las distinguen de otras neuronas. El axón de una gran proporción de las neuronas DA y algunas neuronas GABA origina a partir de un sitio dendríticas que indica que el árbol dendrítico es heterogénea (axón-cojinete y dendritas axón-carente) 25,26,33. La morfología de estas neuronas, por lo tanto contrasta con la organización típica de las neuronas en el que la transferencia de información sigue la ley de la polarización dinámica emitida por Cajal: a partir de las dendritas, al soma y finalmente a 34 axón. También se conocen las neuronas DA a la liberación de dopamina a partir de sus dendritas 35, generar actividad de ruptura 36 y la plasticidad 37 NMDA-receptor. la disecciónción de estos fenómenos es difícil de alcanzar sin grabaciones directas desde el lugar en que se iniciaron. Para hacerse una idea de la relación entre la ubicación exacta y las propiedades funcionales de los canales iónicos y su papel en la excitabilidad y la información de la transferencia dendríticas en las neuronas de la sustancia negra, grabaciones dendríticas directos son el método de elección. Este informe describe un procedimiento detallado que se puede utilizar para obtener grabaciones de uno y dos patch-clamp de dendritas de las neuronas de la sustancia negra y el etiquetado de post hoc biocitina correspondiente. Los principios básicos para parchear el somática y la membrana dendríticas son muy similares. sin embargo la práctica, las grabaciones de sitios dendríticas requieren optimización específica en comparación con las grabaciones somáticas. grabaciones dendríticas exitosas dependen de la calidad de las rodajas, de ajuste óptimo de la óptica, de aproximación suave de la pipeta de parche y la estabilidad de las grabaciones.

<table><tbody><tr><td>Agua bidestilada</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistividad >14 M&Omega; cm, ideal 18,2 M&Omega; cm a 25&nbsp; &deg; C, filtrado (0,22 y micro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Velas de microfiltro</td><td>Robu</td><td>Porosidad 3, 6 mm o 13 mm de diámetro</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora de pañuelos con vibrosonda</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Parámetros de corte: velocidad 0,07, amplitud 1,40</td></tr><tr><td>Cortadora de pañuelos</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000 Parámetros de</td><td>corte: velocidad 4, frecuencia 7</td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de disección</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de reserva</td><td></td><td></td><td>PP a medida</td></tr><tr><td>beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato&nbsp;</td><td>UHU</td><td>"Sekunden Kleber"</td><td>pegamento líquido</td></tr><tr><td>Cámara de grabación&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini cámara</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas horizontal</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm de diámetro exterior/1 mm de diámetro interno capilares de vidrio, extremos pulidos al fuego, lavados</td></tr><tr><td>Cera dental</td><td>Colt&egrave; Tiras</td><td>de cera para bandeja ortodóntica</td>ne/Whaledent <td></td></tr><tr><td>Rejilla</td><td></td><td></td> de platino <td>para anclar lonchas en la cámara de grabación, hecha a medida con un disco de platino</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>para puntas de pipeta pulidas al fuego</td></tr><tr><td>Sulfato de metilo de potasio</td><td>MP Biomedicals 215481</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sondas moleculares</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manómetro</td><td>GREISINGER electrónico</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs & Manipuladores Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Capturador de fotogramas</td><td>La fuente de imagen</td><td>Cámara DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Condensador DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condensador</td><td>Zeiss</td><td></td> de <td>alta apertura numérica que funciona con aceite</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X ampliación, larga distancia, alta apertura numérica 1.0 inmersión en agua objetivo</td></tr><tr><td>Cambiador cuádruple</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td>entre la cámara y el microscopio</td></tr><tr><td>Monitor de vídeo en blanco y negro</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16 pulgadas, 850 líneas de TV, analógico</td></tr><tr><td>Frascos de muestra, vidrio ámbar, con tapón</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>para transferir cortes de la instalación a la sala de histología</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Análisis de datos electrofisiológicos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>ver FICHA DE DATOS DE SEGURIDAD y Directiva de Sustancias Peligrosas (UE) antes de usar</td></tr><tr>Placa de cultivo celular de<td>pocillos</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>para la tinción de lonchas fijas</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>ver FICHA DE DATOS DE SEGURIDAD y Directiva de Sustancias Peligrosas (UE) antes de su uso</td></tr><tr><td>Concentración de trabajo monoclonal primaria anti-TH de ratón</td><td>Immunostar</td><td>22941</td>: <td>1/1.000</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-ratón anti-ratón de cabra - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>concentración de trabajo: 1/500</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Sondas moleculares Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>- Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína Avidina DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin para ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstrucción de neuronas llenas de biocitina</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Reconstrucción de neuronas llenas de biocitona</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Análisis de datos electrofisiológicos</td></tr></tbody></table>

subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina neuronas

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendritas de las neuronas dopaminérgicas reciben y transmiten la entrada sináptica, el apoyo potencial de acción de propagación hacia atrás y la liberación de neurotransmisores. La comprensión de estas funciones fundamentales arrojará luz sobre la transferencia de información en estas neuronas. patch-clamp grabaciones dendríticas ofrecen la posibilidad de examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos dependientes de voltaje subyacentes. Sin embargo, estas estructuras finas no son de fácil acceso para las pipetas de parche debido a su pequeño diámetro. Este informe describe un procedimiento paso a paso para recoger grabaciones estables y fiables a partir de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en rodajas agudas. Las medidas electrofisiológicas se combinan con la recuperación post hoc de la morfología celular. experimentos exitosos se basan en la mejora de la preparación de las rebanadas, soluciones y pipetas, el ajuste adecuado de la óptica y la estabilidad de la pipeta en contacto con la estructura grabada. principios estándar de somgrabación de patch-clamp ATIC se aplican a las dendritas pero con un enfoque más suave de la pipeta. Estas técnicas versátiles pueden ser implementadas para abordar diversas cuestiones relativas a las propiedades de las dendritas excitables.

El protocolo descrito anteriormente tiene la intención de facilitar la recogida de datos utilizando patch-clamp grabaciones dendríticas. Esta técnica, combinada con post hoc histoquímica, ayuda a hacerse una idea de los mecanismos de muchas señales eléctricas se originan o se extienden en las dendritas. Acceso directo a las dendritas con pipetas de parche es difícil, pero especial atención a varios aspectos metodológicos mejorará la tasa de éxito de las grabaciones. Un experimentador suficiente experiencia en la grabación somática estable puede esperar obtener una alta resistencia sellos (GΩ) y experimentos completos en la mayoría de los intentos. Una o dos grabaciones dendríticas de alta calidad pueden ser recogidos por la disección. La disponibilidad de cortes de cerebro de alta calidad que contienen los cuerpos celulares y dendritas saludable es un requisito previo para acceder a estas estructuras finas (Figura 1). el Criteriuna para la selección de estas neuronas son una superficie lisa y homogénea por toda la célula y un soma y dendritas con bajo contraste cuando se observa con ajustado óptimas óptica (Figura 1A y 1B). Selección de las neuronas contrastan con demasiada fuerza generalmente conduce a grabaciones inestables (Figura 1C y 1C). Por lo tanto este tipo de neuronas deben ser evitados. En comparación con otras neuronas, las neuronas DA nigrales exhiben características morfológicas y electrofisiológicas específicos. Estas características normalmente evaluados con una sola pipeta somática también se pueden observar en dual somática (Figura 2) y grabaciones somatodendríticos (Figura 3). Largas inyecciones actuales inducen una hiperpolarización potencial rectificación membrana llamada &#39;hundimiento&#39; (Figuras 2B y 5D). El axón se origina, en la mayoría de los casos, en un sitio dendríticas como se identificautilizando criterios complementarios 13,25,26, lo que indica que el compartimiento dendríticas en estas neuronas es heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consecuencia de ello, el compartimento donde se observa la AP primero corresponde al compartimento en el que el axón surge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. El axón está generalmente terminada por una ampolla axonal causada por un corte de la axón durante el rebanado 64, pero esta estructura no se detecta sistemáticamente. El pandeo pronunciado observado en las neuronas DA nigrales consecutiva a la activación de I h sugiere una alta expresión de las subunidades HCN. Para determinar la influencia de I h en la integración de señales sinápticas, la corriente (EPSC) formas de onda sinápticas-como se generaron y se inyectaron a través del electrodo de registro dendríticas durante las grabaciones de doble somatodendríticos 55 (&lt;strong&gt; Figura 4). La cinética de estos EPSCs simulados se basaron en las constantes de la subida y el tiempo de desintegración de EPSCs espontáneas reales. El aEPSP resultante se registró con el electrodo somática. Bath aplicación de la I h bloqueador de ZD 7288 aumentó la duración de la aEPSP, indicando la contribución de I h a la evolución temporal de señales sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 abolió también el potencial de membrana de rectificación que confirma que los resultados de colgar en la activación de I h (Figura 4C). Los resultados obtenidos con los EPSP simuladas pueden ser correlacionados a los experimentos utilizando los EPSP evocados eléctricamente 65. Para asignar la distribución precisa de la canal en el dominio somatodendrítica de neuronas DA, grabaciones adjunta células se llevaron a cabo (Figura 5). Un sello de alta resistencia (&gt;&gt; 1 GΩ) es una necesidad absoluta para las grabaciones adjunta células (Figura 5B </strong&gt;). En las dendritas de las neuronas DA, I h activa lentamente con pasos de voltaje de hiperpolarización de largo y se alcanza el estado estacionario actual después de cientos de ms (Figura 5C), como se indica anteriormente 66. Esta observación indica que los canales HCN expresadas en las dendritas de las neuronas DA tienen diferentes subunidades en comparación con los de las neuronas piramidales u otros tipos de células 10,16,66. Como la distribución del canal podría ser no homogénea en el compartimiento dendríticas y como el compartimiento dendríticas es en sí misma heterogénea, la identidad de la dendrita (axón-cojinete o dendrita nonaxon-cojinete) se revela mediante la comparación de la imagen de IR-DGC con la imagen confocal después de la tinción biocitina (Figura 3A y B). La recuperación de la morfología celular es por lo tanto necesario que ambas grabaciones somatodendríticos duales y para las grabaciones adjunta células a través de grabaciones de células enteras somáticas posteriores. Figura 1. La visualización de las dendritas Soma y proximal de la sustancia negra neuronas dopaminérgicas Uso de infrarrojos videomicroscopia. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA nigral que muestra el soma y dendritas proximal y ambos pipetas somáticas y dendríticas. Una grabación somatodendrítica dual se realizó con éxito en esta neurona saludable. Observar el bajo contraste y la superficie lisa en todo el dominio somatodendrítica de la célula. (B) Otro ejemplo de una neurona DA saludable. (C) DA neurona con una superficie más rugosa y desigual y un contraste más fuerte. Si bien se ha obtenido una grabación dual, la estabilidad fue subóptima, y la duración de la grabación fue corto (~ 15 min) debido a un aumento gradual de la resistencia de acceso en ambos pipetas. (D) Segundo ejemplo de una neurona DA que muestra una fuerte contrastado soma y dendritas proximales. En este caso, se observó un fuerte aumento de la resistencia de acceso poco después de la ruptura en el modo de células enteras. Un intento de disminuir la resistencia acceso de presión negativa no tuvo éxito. Las neuronas en el panel C y D podrían haber sufrido daños durante el procedimiento de corte en lonchas y se deben evitar para los experimentos. (E) de grabación somática doble simultánea en una neurona DA saludable, al principio de la grabación. (F) La misma neurona como en el panel E con un cuerpo celular hinchada después de ~ 17 min. Tenga en cuenta la completa ausencia de contraste, la apariencia similar a una bola del soma y la presencia del gran núcleo que no es evidente en las neuronas sanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; simultánea doble somática Grabación desde una neurona DA. (A) Imagen IR-DGC durante la grabación de doble somática a partir de una neurona DA. (B) hiperpolarizante y despolarizar largos inyecciones actuales 1 s (-160 a 80 pA, incremente 80 pA) y cambios de voltaje correspondientes grabar simultáneamente con las dos pipetas de parche. Cabe destacar la presencia del hueco en la traza de tensión con la larga etapa hyperpolarizing actual y el gran servicio post-hiperpolarización después de la AP durante el impulso de corriente de despolarización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. Dual S grabación omatodendritic en una neurona DA. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA. La distancia entre el dendríticas y somapipeta tic es 29 micras imagen. (B) confocal z-proyección de la neurona en el panel A marcada con avidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). La neurona se llenó con biocitina durante la grabación. El axón originó a partir de una dendrita proximal cerca de la soma como se indica por la flecha. (C) de grabación de voltaje de células enteras somatodendrítica dual simultánea de la neurona en el panel A. AP registrada en el soma (trazas de tensión negro) y dendrita (tensión rojo trazas) en respuesta a la larga etapa de inyección de corriente de un 1 s a través de la somática (de izquierda; negro traza actual) y la pipeta, alternativamente, dendrítica (derecha; rojo traza actual) (D) somático y AP dendríticas que se muestran en la escala de tiempo ampliado.. Con cualquiera somática o de inyección de corriente dendrítica, el AP somática (negro) precedió a la AP dendríticas (rojo). El retraso entre los puntos de acceso en esta neurona fue de 120 mu s y 210 mu s con somática y la inyección de corriente dendríticas, respectivamente. Los retrasosse midieron a AP amplitud máxima media durante la fase ascendente de la AP. El AP se observó por primera vez en el compartimiento cerca de la cual emerge el axón, lo que confirma observaciones anteriores 25,26. En este caso, la grabación dendríticas se hace de una dendrita axón-deficiente. Un ejemplo de una grabación de una de las dendritas axón-cojinete está en la Ref. 13 (en su Fig. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagación de EPSP artificiales A lo largo del eje del somatodendrítica DA neuronas. Imagen IR-DGC de una neurona DA (A). La distancia entre el dendríticas y la pipeta somática es 45 micras. Ambos pipetas de parche están en el modo de células enteras de grabación actual-clamp. (B) actualgrabado con la pipeta dendríticas en corriente-clamp y utilizado para generar la EPSP artificial (parte superior). La corriente se obtiene por la inyección de una forma de onda EPSC-como (t altura = 0,6 ms; tau decaimiento = 3 ms; amplitud = 100 pA) a través de la pipeta de grabación dendríticas 55. En la parte inferior, aEPSPs registrados en el soma en el control de las condiciones (negro) propagada y después de la aplicación del baño de la ZD7288 I h bloqueador (30 M; trazo rojo). Cada traza de tensión es el promedio de 40 barridos individuales. Observe el gran aumento en la duración del EPSP en presencia de ZD7288 que indica la contribución de I h a la evolución temporal de los EPSP. (C) Tensión trazas grabadas desde el soma en condiciones de control (negro) y después de la aplicación de ZD 30 M 7288 ( rojo) en respuesta a una larga (30 pA; 1 s) paso actual de hiperpolarización. Nótese la ausencia de potencial de membrana de rectificación (sag) después de que el bloqueo de I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presencia de I h en las dendritas de las neuronas DA. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA pipeta sobre las dendritas proximales. (B) y las corrientes capacitivas de fuga durante un comando de tensión 5 mV en configuración de conexión celular. La resistencia del sello fue 5 GΩ en este ejemplo la etapa (C) de voltaje hiperpolarizante. (90 mV; parte superior) a partir de un potencial de membrana de 0 mV indujo una activación lentamente I h. La traza actual se invirtió y equipado con una sola función exponencial dando una constante de tiempo de tau = 632 ms. (D) Tensiónrespuestas del soma registrada de células enteras (panel A) a 1 s hiper e impulsos de corriente de despolarización (-160 a 120 pA, 40 de incremento PA). La grabación de células enteras somática se realizó después de la grabación adjunta por células. Nótese la ausencia de puntos de acceso debido a la aplicación extracelular de TTX y Cd 2+ para suprimir la activación espontánea durante la grabación adjunta por células. Estos voltaje Na + y Ca 2+ se añadieron bloqueadores actuales para suprimir las corrientes de acción. Los paneles A - D son de la misma neurona (E) la imagen IR-DIC de otra neurona DA y una pipeta dendríticas corrientes (F) dependiente de la tensión activa mediante un impulso de prueba a 0 mV a partir de un prepulso de 50 ms a -120 mV.. en un parche en el exterior hacia fuera extirpado de la dendrita proximal de la neurona en el panel E. Holding potencial de -80 mV. Tenga en cuenta la inactivación dependiente del tiempo de la corriente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una más grande</a>versión de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.443 </td><td> 125 mM </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glucosa </td><td> 198.17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 1 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 2 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 310 mOsmol / L (rango óptimo: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.443 </td><td> 87 mM </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7.551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> glucosa </td><td> 198.17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sacarosa </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: sacarosa-ACSF para preparar rodajas. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 2 mM </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255.1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0.1 mM </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 ajustado con KOH </td></tr></tbody></table> Tabla 3: solución intracelular para las grabaciones duales. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 100ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 2 mM </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 1 mM </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0.23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl2 </td><td> 244.26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl2 </td><td> 183.32 </td><td> 0.02 mM </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 290 mOsmol / l, ajustado con D-glucosa (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: solución de electrodos para grabaciones unido por células.

Los registros subcelulares de patch-clamp ofrecen la posibilidad de investigar las propiedades funcionales de las dendritas. Sin embargo, estas finas estructuras no son fácilmente accesibles debido a su pequeño diámetro. El protocolo aquí descrito tiene como objetivo facilitar la recopilación de registros estables y fiables de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en cortes in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la forma en que los canales iónicos individuales regulados por voltaje contribuyen a las funciones de una neurona específica. La principal ventaja de esta técnica es que permite mapear la función de los canales iónicos a nivel subcelular en las neuronas. Comience este procedimiento colocando el cerebro sobre una placa de Petri de 9 centímetros con el fondo cubierto con una capa de SiliGuard.A continuación, rodee el cerebro con ACSF con sacarosa frío con hielo. Para preparar cortes coronales, realice dos cortes para eliminar el cerebelo y la parte rostral del cerebro. Luego aplique pegamento de cianocrilato en la bandeja del espécimen y pegue el bloque cerebral a la bandeja de manera que la parte rostral quede orientada hacia la etapa de corte.Posteriormente, aplique unas gotas de ACSF con sacarosa sobre el cerebro y sumerja lentamente la bandeja en la cámara de corte. Después, ajuste la cuchilla de afeitar a un ángulo de 15 grados con respecto al plano horizontal. Corte secciones coronales del cerebro de aproximadamente 500 micrómetros en dirección nasal hacia el núcleo del tubérculo antes de llegar a la sustancia negra.Luego, ajuste el grosor para cortar rebanadas de 300 micrómetros que contengan la región de interés. Separe las rebanadas del bloque de tejido con una aguja muy fina unida a una jeringa, colocada paralelamente al borde de la cuchilla de afeitar. A continuación, transfiera las rebanadas a la cámara de reserva a 34 grados Celsius durante una hora.En este procedimiento, transfiera una sección de cerebro a la cámara de registro. Ancle la sección en la parte inferior de la cámara de registro con un anillo de platino y asegúrese de que la sección sea de buena calidad, con una superficie lisa y uniforme. Luego, seleccione una neurona con una dendrita que se extienda a lo largo de una gran distancia en el mismo plano y asegúrese de que la dendrita de interés pueda seguirse hasta un soma bien definido.A continuación, llene la pipeta de registro con la solución para el electrodo. Para realizar el registro en la dendrita en modo acoplado a la célula, identifique y enfoque una porción de la dendrita. Aplique presión positiva a la pipeta y bájela utilizando el micromanipulador.Luego, coloque la pipeta cerca de la membrana y ajuste la presión para crear un pequeño abombamiento. Posteriormente, libere la presión en la punta de la pipeta y realice el parche en la dendrita, controlando al mismo tiempo la resistencia de la pipeta. Intente obtener una resistencia de sello mayor a un gigaohmio, preferiblemente entre tres y diez gigaohmios, para grabaciones en configuración de célula adherida.A continuación, retire la pipeta de la membrana unos pocos micrómetros para evitar la deformación de la dendrita. Las corrientes de acción observadas aquí representan los potenciales de acción espontáneos de las neuronas nigrales. Para suprimir las corrientes de acción, aplique bloqueadores de los canales de calcio y sodio al ACSF.Luego, aplique un escalón de voltaje de 90 milivoltios, desde un potencial de mantenimiento de cero milivoltios, para evocar la corriente catiónica activada por hiperpolarización. Al final del registro, rompa el parche para lograr el modo de célula íntegra. Después, retire lentamente y con cuidado la pipeta dendrítica de la membrana neuronal para obtener un parche fuera-adentro.Para realizar la grabación desde el soma correspondiente en modo de célula íntegra, localice el soma correspondiente a la dendrita. Baje una pipeta con una resistencia entre cinco y diez megaohmios que contenga una solución intracelular a base de potasio hasta el cuerpo celular. Luego, aplique una presión negativa breve en la punta de la pipeta para romper la membrana y así lograr el modo de célula íntegra.Verifique la identidad de la neurona en modo de fijación de corriente aplicando largos pasos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes, y permita que la biocitina de la pipeta se difunda a lo largo de las dendritas. Después de 10 minutos, retire la pipeta para obtener un parche fuera de la célula. Utilice una secuencia de movimientos cortos, laterales y ascendentes para favorecer el cierre adecuado de la membrana celular, una vez que la pipeta esté por encima del corte, con el fin de salir completamente de la cámara de registro.Mantenga la sección en la cámara de registro durante 15 minutos adicionales en ACSF estándar para permitir la equilibración de la biocitina y la neurona registrada. Luego, transfiera suavemente la sección a un frasco de vidrio ámbar de 25 mililitros que contenga ACSF estándar para histología. En este procedimiento, localice aproximadamente la neurona marcada con fluorescencia en la sección mediante epifluorescencia.Examine brevemente el arbor dendrítico de las neuronas y localice el axón y el bleb axonal utilizando un objetivo de 10X. A continuación, cambie al microscopio confocal y seleccione el láser de diodo de 488 nanómetros para excitar la neurona marcada. Siga la extensión del axón y las dendritas en el eje Z y registre imágenes sucesivas con el fin de obtener una serie Z para toda la célula.Ajuste la resolución del eje Z y adquiera las imágenes confocales de la célula con aumento bajo y alto. Al final, abra el archivo de imagen de la neurona con un software de imágenes. Compare visualmente la imagen de proyección Z con una imagen IR-DGC para localizar la posición precisa de la pipeta de registro durante el registro electrofisiológico.Se muestra aquí la imagen de IR-DGC de una neurona dopaminérgica y una pipeta en la dendrita proximal. El trazado de corriente muestra la capacidad de las corrientes de fuga del EN en respuesta a un comando de voltaje de cinco milivoltios, en configuración de celda unida, con una resistencia de sello de cinco gigaohmios. Un paso de voltaje hiperpolarizante, desde un potencial de membrana de cero milivoltios, indujo una corriente catiónica activada por hiperpolarización que se activa lentamente.El trazo de corriente se invirtió y se ajustó con una función exponencial simple, obteniendo una constante de tiempo de 632 milisegundos. A continuación se muestran las respuestas de voltaje del soma registradas en toda la célula ante pulsos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes de un segundo de duración, en presencia de bloqueadores de las corrientes de sodio y calcio reguladas por voltaje, con el fin de eliminar los potenciales de acción durante el registro en modo de celda unida. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día, siempre que se lleve a cabo adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar obtener tejido sano y condiciones de registro estables. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales, como la identidad de la neurona registrada. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurofisiología exploraran la función, propiedades y el papel de los canales iónicos activados por voltaje en células excitables.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar y examinar la distribución de corrientes que fluyen a través de canales iónicos activados por voltaje en las dendritas.

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Investigación

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Neurociencia

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Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

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Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría

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Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

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