La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

El objetivo general de este procedimiento es acelerar la detección de sustratos fisiológicos para posibles lipasas y fosofolipasas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la entomología, como cómo las fosfolipasas contribuyen a la remodelación lipídica en las membranas biológicas. La principal ventaja de esta técnica es que la optimización de la actividad enzimática y la búsqueda del sustrato natural para la enzima se pueden realizar de forma independiente.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la especificidad del sustrato de las lipasas y fosfolipasas bacterianas, también puede modificarse para estudiar las hidrolasas de cualquier otro organismo modelo. La idea de este método fue cuando buscamos una actividad enzimática que pudiera degradar la fosfatidilcolina lipídica de membrana intrínseca en el inorhizobium meliloti. Para preparar extractos de proteínas libres de células, descongele las suspensiones de células bacterianas y guárdelas en hielo.

Luego, pase las suspensiones de la celda tres veces a través de una celda de presión fría a 20,000 libras por pulgada cuadrada. Retire las células intactas y los restos de células mediante centrifugación a 5.000 veces g durante 30 minutos, a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, prepare alícuotas de 100 y 500 microlitros del sobrenadante para su posterior análisis.

Configure el ensayo enzimático previamente optimizado utilizando los esquemas de pipeteo tabulados en el protocolo de texto. Para una cobertura inicial de distintas actividades enzimáticas, utilice sustratos artificiales que produzcan un producto coloreado tras la hidrólisis, como para-nitrofenol o derivados de PNP. Siga el curso del tiempo para un aumento de la absorbancia a 405 nanómetros, debido a la formación de PNP en un espectrofotómetro a 30 grados Celsius durante un período de cinco minutos.

Por último, realice los cálculos como se describe en el protocolo de texto. Para el marcado radioeléctrico de lípidos, prepare un precultivo nocturno de un organismo de interés en cinco mililitros del medio de cultivo deseado y crezca a 30 grados centígrados. Desde el precultivo, inocular en 20 milímetros de medio fresco en un matraz de cultivo de 100 milímetros, para obtener una densidad óptica inicial a 620 nanómetros de 0,3 para el cultivo.

A continuación, transfiera una alícuota de un mililitro del cultivo a un tubo de fondo redondo de poliestireno estéril de 14 mililitros en condiciones estériles. Agregue un microcurie de acetato de 114 c al cultivo de un mililitro. Luego, incubar el cultivo líquido bajo agitación a 30 grados centígrados durante un período de 24 horas.

Al final del período de incubación, transfiera el cultivo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 12.000 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de agua. En este punto, almacene la suspensión celular a menos 20 grados centígrados o continúe inmediatamente con la extracción de lípidos polares.

Para realizar la extracción de lípidos polares, agregue 375 microlitros de una solución de metanol a cloroformo de dos a uno a los 100 microlitros de suspensión celular acuosa. Agite la muestra en vórtice durante 30 segundos antes de incubarla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, centrifugar durante cinco minutos a 12.000 veces g a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, agregue 125 microlitros de cloroformo y 125 microlitros de agua al sobrenadante. Después de agitar en vórtice durante 30 segundos, centrifugar la muestra durante un minuto a 12.000 veces g a temperatura ambiente.

Transfiera la fase inferior de cloroformo a un tubo nuevo. Luego, seque la solución con un chorro de gas nitrógeno. Disuelva los lípidos secos en 100 microlitros de solución de cloroformo a metanol.

Para la separación de lípidos polares neutros por cromatografía en capa fina, aplique tres alícuotas de microlitros de las muestras de lípidos, sobre una lámina de aluminio de gel de sílice por cromatografía de capa fina de alto rendimiento, comenzando a dos centímetros de los bordes de la placa. Si se analizan varias muestras en cromatografía unidimensional, mantenga una distancia de al menos 1,5 centímetros entre los diferentes puntos de aplicación de la muestra. Transfiera la fase móvil a una cámara de revelado TLC, recubierta internamente con papel de cromatografía.

Cubra con un plato de vidrio para dejar que la cámara se sature durante 30 minutos. Transfiera la lámina de aluminio de gel de sílice HPTLC con las muestras de lípidos secos a la cámara. Deje que la placa se desarrolle durante 30 minutos en una cámara cerrada antes de retirar la placa.

A continuación, deje que los disolventes se sequen en una campana de flujo durante dos horas. Una vez que la hoja de TLC revelada esté seca, incubarla con una pantalla de luminiscencia fotoestimulable en un casete cerrado durante tres días. A continuación, exponga la pantalla incubada a un escáner PSL y adquiera una imagen virtual de los lípidos radiomarcados separados.

Para determinar la actividad de la lipasa de diacilglicerol, o DAG, primero agregue 5,000 CPM de DAG marcado con 14 C a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros. Además, agregue una solución de Triton X-100 al tubo y mezcle por vórtice. Seque la solución bajo un chorro de nitrógeno.

Para un ensayo final de 100 microlitros, agregue tampón Tris-HCl, una solución de cloruro de sodio y agua bidestilada. Vórtice durante cinco segundos. Inicie la reacción agregando cinco microlitros de enzima a la solución.

Incubar la solución a 30 grados centígrados durante cuatro horas. Detenga la reacción mediante la adición de 250 microlitros de metanol y 125 microlitros de cloroformo, antes de extraer los lípidos como se describe anteriormente en este video. Proceda a analizar los lípidos polares neutros mediante 1DTLC y las imágenes PSL posteriores como antes.

Aunque la phosofolipasa SMc01003 predicha muestra actividad con ésteres artificiales de acil para-nitrofenol, la actividad es solo el doble o el triple de la actividad de fondo presente en los extractos libres de células de Escherichia coli, en los que no se ha expresado ningún gen extraño. Esto indica que los ésteres de para-nitrofenil acilo no parecen ser buenos sustratos para SMc01003. Mientras que los extractos libres de células de E. Coli no pueden degradar el diacilglicerol, los extractos de cepas en las que se había expresado la fosfolipasa predicha, SMc01003, causaron una degradación del diacilglicerol.

Aunque se predijo que SMc01003 era una fosfolipasa, en realidad es una lipasa de diacilglicerol que degrada el diacilglicerol a monoacilglicerol y un ácido graso. A continuación, degrada el monoacilglicerol a glicerol y otro ácido graso. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas pocas semanas si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo optimizar las actividades enzimáticas de las lipasas y fosfolipasas, y cómo continuar con la búsqueda de sus sustratos fisiológicos. Una ventaja crucial de este procedimiento es que la optimización de la actividad enzimática se puede separar de la búsqueda del sustrato enzimático natural. No olvide que trabajar con solventes orgánicos o sustancias radiactivas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones requeridas al realizar este procedimiento.