Name: La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a optimizar la actividad de lipasas y fosfolipasas para identificar sus sustratos naturales en sistemas biológicos. Este método versátil permite estudiar la especificidad de sustratos de enzimas bacterianas.

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Este trabajo fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-México) (82614, 153998, 253549 y 178359 de Investigación Científica Básica, así como 118 en Investigación en Fronteras de la Ciencia) y de la Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-DGAPA; PAPIIT IN202616, IN203612).

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger%2C+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger, Principles of Biochemistry</a>. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).</li>
<li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipases+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li>
<li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowhan%2C+W+%22Biochemistry+of+Lipids%2C+Lipoproteins+and+Membranes%22">Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes</a>. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).</li>
<li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity%3A+why+are+there+so+many+lipids%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li>
<li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li>
<li>Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N%2CN%2CN-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+%28Sinorhizobium%29+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li>
<li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4%27-%28N%2CN%2CN%2C-trimethyl%29homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li>
<li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li>
<li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li>
<li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patatin-like+proteins%3A+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li>
<li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li>
<li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipase+Engineering+Database%3A+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li>
<li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+continuing+developments+at+PROSITE%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22Experiments+in+Molecular+Genetics%22">Experiments in Molecular Genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphorimager+SI+User%C2%B4s+Guide%22">Phosphorimager SI User´s Guide</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf">http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf</a> (1994).</li>
<li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+M+%22Enzymes%3A+Third+Edition%22">Enzymes: Third Edition</a>. , Longman, USA. (1979).</li>
<li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+characterization%2C+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin%2C+a+phospholipase+D+superfamily+member%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li>
<li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li>
<li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).</li>
<li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li>
<li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+genomics%3A+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li>
<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScopes%2C+RK+%22Protein+Purification%2C+Principles+and+Practice%22">Protein Purification, Principles and Practice</a>. , Springer. New York. (2010).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante los últimos 20 años, los genomas de muchos organismos se han secuenciado y aunque una gran cantidad de datos de secuencia del genoma se ha generado, la interpretación funcional es la zaga, y por consiguiente, dificulta nuestra comprensión de la función del genoma. las funciones de genes en los genomas son a menudo asignados basándose en la similitud de los genes de función o la aparición de motivos conservados conocido. Sin embargo, la función exacta de un gen dado es a menudo no se conoce. Especialmente, predij...

Lípidos basados en glicerol tales como triglicéridos y fosfolípidos (glicero) constituyen importantes y probablemente las clases de lípidos más conocidos 1. Triglicéridos (TG) son grasas o aceites, que por lo general funcionan como lípidos de almacenamiento, y por lo tanto, como posibles fuentes de energía y de carbono. Las etiquetas pueden ser degradadas por las lipasas, que con frecuencia son secretadas por el organismo productor de digerir variables externas y ponerlos a disposición como fuentes de carbono. Además, las lipasas se han estudiado ampliamente en los últimos años debido a sus importantes aplicaciones biotecnológicas 2. Debido a su naturaleza anfifílica y su forma casi cilíndrica, (glicero fosfolípidos) exhiben propiedades de formación de membrana y por lo general constituyen los principales componentes lipídicos de la membrana de dos capas 3. En los microorganismos simples, tales como la bacteria Escherichia coli, sólo tres variantes principales del grupo de cabeza, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), y phosphatidylethanolamine (PE) se encontró, aunque se debe tener en cuenta que cada uno de ellos puede estar sustituido con un número considerable de diferentes cadenas de acilo graso en la posición sn -1 o sn -2 posición que da lugar a un gran número de diferentes especies moleculares de 4 . Otras bacterias podrían tener otros fosfolípidos, además o en lugar. Por ejemplo, Sinorhizobium meliloti, una bacteria del suelo, que es capaz de formar una raíz simbiosis nódulo de fijación de nitrógeno con la alfalfa leguminosas (Medicago sativa), contiene, además de PE un segundo fosfolípido zwitteriónico, la fosfatidilcolina (PC) 5. Además, los lípidos no contiene fósforo o glicerol pueden ser anfífilo y forma parte de la membrana celular. Por ejemplo, de las condiciones de crecimiento de fósforo limitativo, en S. meliloti, (glicero fosfolípidos) se sustituyen en gran medida por los lípidos de membrana que no contienen fósforo, es decir, sulfolípidos, lípidos ornitina, y diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. En las bacterias, DGTS se forma a partir de diacilglicerol (DAG) en una vía de dos pasos 7, pero la fuente para la generación de DAG no estaba claro. Experimentos de pulso-caza sugirieron que PC puede ser un precursor para DGTS 8 y usando la metodología descrita en este manuscrito podríamos identificar una fosfolipasa C (PLCP, SMc00171) que se forma en condiciones de fósforo limitativo y que puede convertir PC en DAG y fosfocolina 8. En un estudio separado, descubrimos que un acil-CoA sintetasa (FADD) mutante deficiente en S. meliloti o de Escherichia coli acumula ácidos grasos libres al entrar en la fase estacionaria de crecimiento 9. Aunque estos ácidos grasos parecían ser derivados de lípidos de la membrana, no se sabe que la fuente precisa de los ácidos grasos libres o la enzima (s) liberándolos. Una vez más, empleando la estrategia descrita en este manuscrito, dos 10 (fosfo) lipasas patatina-como (SMc00930 y SMc01003) que contribuyó a la formación de ácidos grasos libres en S. meliloti 11 estaba previsto. Sorprendentemente, SMc01003 utiliza DAG como sustrato la conversión a monoacilglicerol y, finalmente, glicerol y ácidos grasos libres 11. Por lo tanto, es una lipasa SMc01003 DAG (DGLA). A pesar de que existe una serie de algoritmos de predicción del potencial (fosfo) 12,13 lipasas, su función precisa y papel fisiológico por lo general no se conoce. Aquí describimos un protocolo, para clonar y sobreexpresan lipasas (fosfo) predichos o potenciales. Este manuscrito se explica cómo los ensayos enzimáticos pueden ser desarrollados y optimizados para la lipasa sobreexpresa (fosfo) mediante el uso de sustratos cromogénicos artificiales. Proporcionamos ejemplos de cómo en un ensayo enzimático optimizado el (fosfo) sustrato de la lipasa real puede ser encontrado y cómo estos hallazgos podrían enriquecer nuestra comprensión de la fisiología microbiana.

<table><tbody><tr><td>Cloroformo</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>TLC análisis & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>Análisis TLC & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Análisis TLC & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Análisis TLC & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>agua bidestilada</td><td>&nbsp; CUALQUIER&</td><td>nbsp; NA</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crecimiento bacteriano, 10 g de triptona + 5 g de extracto de levadura + 10 g de NaCl por litro de agua bidestilada</td></tr><tr><td>triptona</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td> Extracto de levadura <td>de crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>Caldo TY</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crecimiento bacteriano, 8 g de triptona + 3 g de extracto de levadura + 66 mg de CaCl2&#183; 2H2O por litro de agua bidestilada</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>isopropil-&beta;-D-tiogalactósido (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Fosfolipasa A2 serpiente veneno</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Fosfolipasa C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenilo fosfato</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo estearato</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo dodecanoato</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo decanoato</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo palmitato</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo butirato</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenil octanoato</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Ácido acético, sal sódica [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Gel de sílice HPTLC de aluminio 60 placas. Placas de gel de sílice HPTLC tamaño 20 x 20 cm, 25 hojas.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>TLC análisis & </td></tr><tr><td>Espectrómetro de extracción de lípidos UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Escáner de luminiscencia fotoestimulable&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de centelleo multipropósito</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Cuantificación de radiactividad</td></tr><tr><td>Célula de presión francesa</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Rotura de células</td></tr><tr><td>papel de cromatografía 3MM Chr</td><td>Whatman 3030917</td><td></td><td>TLC analysis</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021nuestra</td><td>referencia 11</td><td></td><td>cepa estudiada</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Células competentes</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>cepa de expresión de proteínas</td></tr><tr><td>vector pET9a</td><td>Novagen</td><td>69431</td><td>vector de expresión de proteínas</td></tr><tr><td>vector pET17b</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>vector de expresión de proteínas</td></tr><tr><td>poliestireno estéril tubo de fondo redondo (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiomarcaje de cultivos bacterianos tubos de</td></tr><tr><td>microcentrífuga de polipropileno (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicerol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>patrón lipídico</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoil</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>patrón lipídico</td></tr><tr><td>DL-&alpha;-monopalmitina</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>patrón</td></tr><tr><td>lipídico ácido palmítico</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>patrón lipídico</td></tr></tbody></table>

la definición de sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Los microorganismos producen un amplio espectro de lipasas (fosfo) que son secretadas en el fin de hacer los sustratos externos disponibles para el organismo. Alternativamente, otros (fosfo) lipasas pueden estar asociadas físicamente con el organismo productor causando una facturación de lípidos intrínsecos y con frecuencia dando lugar a una remodelación de las membranas celulares. Aunque potenciales (fosfo) lipasas se pueden predecir con un número de algoritmos cuando la secuencia de gen / proteína está disponible, no ha sido obtenido con frecuencia prueba experimental de las actividades enzimáticas, especificidades de sustrato, y posibles funciones fisiológicas. Este manuscrito describe la optimización de las condiciones de ensayo de (fosfo) lipasas prospectivos con especificidades de sustrato desconocidos y cómo emplear estas condiciones optimizadas en la búsqueda para el sustrato natural de un respectivo lipasa (fosfo). El uso de sustratos cromogénicos artificiales, tales como derivados de p-nitrofenil, puede ayudar a detectar un menorla actividad enzimática de una lipasa predicho (fosfo) en condiciones estándar. Después de haber encontrado una actividad enzimática tal menor, los parámetros distintos de un ensayo enzimático se pueden variar con el fin de obtener una hidrólisis más eficiente del sustrato artificial. Después de haber determinado las condiciones en las que una enzima funciona bien, una variedad de posibles sustratos naturales deben ser analizadas para su degradación, un proceso que puede ser seguido empleando métodos cromatográficos diferentes. La definición de especificidades de sustrato de nuevas enzimas, a menudo proporciona hipótesis para un posible papel fisiológico de estos enzimas, que a continuación pueden ser probados experimentalmente. Siguiendo estas directrices, hemos sido capaces de identificar una fosfolipasa C (SMc00171) que degrada la fosfatidilcolina a fosfocolina y diacilglicerol, en un paso crucial para la remodelación de las membranas en la bacteria Sinorhizobium meliloti de las condiciones de fósforo limitante del crecimiento. Para dos predijo patatin-como fosfolipasas (SMc00930 y SMc01003) del mismo organismo, podríamos redefinir sus especificidades de sustrato y aclarar que SMc01003 es una lipasa diacilglicerol.

Actividad de la fosfolipasa-PC específico C SMc00171 con Bis- fosfato de p-nitrofenil Extractos libres de células obtenidas a partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, que tenían smc00171 expresaron, fueron estudiados por su capacidad para hidrolizar ésteres de fosfato-nitrofenil bis- p, utilizando un ensayo enzimático espectrofotométri...

Muchas de las (fosfo)lipasas predichas están mal caracterizadas con respecto a sus especificidades de sustrato y funciones fisiológicas. Aquí proporcionamos un protocolo para optimizar las actividades enzimáticas, buscar sustratos naturales y proponer funciones fisiológicas para estas enzimas.

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

El objetivo general de este procedimiento es acelerar la detección de sustratos fisiológicos para posibles lipasas y fosfolipasas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Entomología, como la forma en que las fosfolipasas contribuyen al remodelado de lípidos en membranas biológicas. La principal ventaja de esta técnica es que la optimización de la actividad enzimática y la búsqueda del sustrato natural para la enzima pueden realizarse de manera independiente.Aunque este método puede proporcionar información sobre la especificidad de sustrato de lipasas y fosfolipasas bacterianas, también puede modificarse para estudiar hidrolasas de cualquier otro organismo modelo. Tuvimos la idea inicial de este método cuando buscábamos una actividad enzimática que pudiera degradar el lípido intrínseco de membrana fosfatidilcolina en *Sinorhizobium meliloti*. Para preparar extractos proteicos libres de células, descongele las suspensiones de células bacterianas y almacénelas en hielo.Luego, pase las suspensiones celulares tres veces a través de una celda de presión fría a 20.000 libras por pulgada cuadrada. Elimine las células íntegras y los restos celulares mediante

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

La fosforilación de proteínas es una característica central de cómo las células interpretan y responden a la información en su entorno extracelular. Aquí, presentamos un protocolo de cribado de alto rendimiento que utiliza quinasas purificadas a partir de células de mamíferos para identificar rápidamente las quinasas que fosforilan un sustrato o sustratos de interés.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Aquí presentamos una bicapa lipídica soportada en el contexto de una plataforma microfluídica para estudiar las interacciones proteína-fosfoinositido utilizando un método libre de etiquetas basado en la modulación del pH.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Este protocolo utiliza la hinchazón de agarosa como una técnica poderosa y generalizable para incorporar proteínas de membrana integral (IMP) en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV), como se describe aquí para la reconstitución de la proteína receptora de serotonina 1A humana (5-HT1AR), una de las clases de receptores acoplados a proteínas G farmacológicamente importantes.

Construcción de membranas lipídicas modelo que incorporan receptores acoplados a proteínas G (GPCR)

Un balance colgante de película de superficie de gota implementado con un intercambio multisubfase, apodado OCTOPUS, permite imitar las condiciones digestivas mediante el intercambio secuencial de subfases de la solución a granel original con fluidos gastrointestinales simulados. La digestión in vitro simulada se monitoriza registrando in situ la tensión interfacial de la capa interfacial digerida.

In vitro Digestión de emulsiones en una sola gota a través del intercambio multifásico de fluidos gastrointestinales simulados

Este método describe un ensayo de sedimentación in vitro basado en lectinas para cuantificar la afinidad de unión de la glucano fosfatasa y la amilopectina. Este ensayo de cosedimentación es confiable para medir la unión del sustrato de glucano fosfatasa y se puede aplicar a varios sustratos de glucano solubilizados.

Ensayo de sedimentación basado en concanavalina A para medir la unión al sustrato de las fosfatasas de glucano

Presentamos un método rentable para evaluar la permeabilidad de la membrana liposomal con una sensibilidad y resolución superiores a las técnicas convencionales. Utilizando una novedosa reacción de sustitución de ligandos encapsulados, esta técnica detecta cambios inducidos por fosfolipasa A2 en las membranas del modelo. Este enfoque accesible, que se integra fácilmente con los análisis estándar, mejora la resolución para estudiar la biofísica de las membranas y las interacciones de toxinas.

Un ensayo de permeabilidad de la membrana liposomal para investigar los efectos de los grupos fosfato de fosfatidilinositol sobre la acción membranotrópica del veneno PLA2

Aprende a optimizar la actividad de lipasas y fosfolipasas para identificar sus sustratos naturales en sistemas biológicos. Este método versátil permite estudiar la especificidad de sustratos de enzimas bacterianas.

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

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