Name: La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a optimizar la actividad de lipasas y fosfolipasas para identificar sus sustratos naturales en sistemas biológicos. Este método versátil permite estudiar la especificidad de sustratos de enzimas bacterianas.

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Este trabajo fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-México) (82614, 153998, 253549 y 178359 de Investigación Científica Básica, así como 118 en Investigación en Fronteras de la Ciencia) y de la Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-DGAPA; PAPIIT IN202616, IN203612).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante los últimos 20 años, los genomas de muchos organismos se han secuenciado y aunque una gran cantidad de datos de secuencia del genoma se ha generado, la interpretación funcional es la zaga, y por consiguiente, dificulta nuestra comprensión de la función del genoma. las funciones de genes en los genomas son a menudo asignados basándose en la similitud de los genes de función o la aparición de motivos conservados conocido. Sin embargo, la función exacta de un gen dado es a menudo no se conoce. Especialmente, predij...

Lípidos basados en glicerol tales como triglicéridos y fosfolípidos (glicero) constituyen importantes y probablemente las clases de lípidos más conocidos 1. Triglicéridos (TG) son grasas o aceites, que por lo general funcionan como lípidos de almacenamiento, y por lo tanto, como posibles fuentes de energía y de carbono. Las etiquetas pueden ser degradadas por las lipasas, que con frecuencia son secretadas por el organismo productor de digerir variables externas y ponerlos a disposición como fuentes de carbono. Además, las lipasas se han estudiado ampliamente en los últimos años debido a sus importantes aplicaciones biotecnológicas 2. Debido a su naturaleza anfifílica y su forma casi cilíndrica, (glicero fosfolípidos) exhiben propiedades de formación de membrana y por lo general constituyen los principales componentes lipídicos de la membrana de dos capas 3. En los microorganismos simples, tales como la bacteria Escherichia coli, sólo tres variantes principales del grupo de cabeza, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), y phosphatidylethanolamine (PE) se encontró, aunque se debe tener en cuenta que cada uno de ellos puede estar sustituido con un número considerable de diferentes cadenas de acilo graso en la posición sn -1 o sn -2 posición que da lugar a un gran número de diferentes especies moleculares de 4 . Otras bacterias podrían tener otros fosfolípidos, además o en lugar. Por ejemplo, Sinorhizobium meliloti, una bacteria del suelo, que es capaz de formar una raíz simbiosis nódulo de fijación de nitrógeno con la alfalfa leguminosas (Medicago sativa), contiene, además de PE un segundo fosfolípido zwitteriónico, la fosfatidilcolina (PC) 5. Además, los lípidos no contiene fósforo o glicerol pueden ser anfífilo y forma parte de la membrana celular. Por ejemplo, de las condiciones de crecimiento de fósforo limitativo, en S. meliloti, (glicero fosfolípidos) se sustituyen en gran medida por los lípidos de membrana que no contienen fósforo, es decir, sulfolípidos, lípidos ornitina, y diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. En las bacterias, DGTS se forma a partir de diacilglicerol (DAG) en una vía de dos pasos 7, pero la fuente para la generación de DAG no estaba claro. Experimentos de pulso-caza sugirieron que PC puede ser un precursor para DGTS 8 y usando la metodología descrita en este manuscrito podríamos identificar una fosfolipasa C (PLCP, SMc00171) que se forma en condiciones de fósforo limitativo y que puede convertir PC en DAG y fosfocolina 8. En un estudio separado, descubrimos que un acil-CoA sintetasa (FADD) mutante deficiente en S. meliloti o de Escherichia coli acumula ácidos grasos libres al entrar en la fase estacionaria de crecimiento 9. Aunque estos ácidos grasos parecían ser derivados de lípidos de la membrana, no se sabe que la fuente precisa de los ácidos grasos libres o la enzima (s) liberándolos. Una vez más, empleando la estrategia descrita en este manuscrito, dos 10 (fosfo) lipasas patatina-como (SMc00930 y SMc01003) que contribuyó a la formación de ácidos grasos libres en S. meliloti 11 estaba previsto. Sorprendentemente, SMc01003 utiliza DAG como sustrato la conversión a monoacilglicerol y, finalmente, glicerol y ácidos grasos libres 11. Por lo tanto, es una lipasa SMc01003 DAG (DGLA). A pesar de que existe una serie de algoritmos de predicción del potencial (fosfo) 12,13 lipasas, su función precisa y papel fisiológico por lo general no se conoce. Aquí describimos un protocolo, para clonar y sobreexpresan lipasas (fosfo) predichos o potenciales. Este manuscrito se explica cómo los ensayos enzimáticos pueden ser desarrollados y optimizados para la lipasa sobreexpresa (fosfo) mediante el uso de sustratos cromogénicos artificiales. Proporcionamos ejemplos de cómo en un ensayo enzimático optimizado el (fosfo) sustrato de la lipasa real puede ser encontrado y cómo estos hallazgos podrían enriquecer nuestra comprensión de la fisiología microbiana.

<table><tbody><tr><td>Cloroformo</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>TLC análisis & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>Análisis TLC & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Análisis TLC & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Análisis TLC & Extracción de lípidos</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>agua bidestilada</td><td>&nbsp; CUALQUIER&</td><td>nbsp; NA</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crecimiento bacteriano, 10 g de triptona + 5 g de extracto de levadura + 10 g de NaCl por litro de agua bidestilada</td></tr><tr><td>triptona</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td> Extracto de levadura <td>de crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>Caldo TY</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crecimiento bacteriano, 8 g de triptona + 3 g de extracto de levadura + 66 mg de CaCl2&#183; 2H2O por litro de agua bidestilada</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>isopropil-&beta;-D-tiogalactósido (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Fosfolipasa A2 serpiente veneno</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Fosfolipasa C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenilo fosfato</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo estearato</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo dodecanoato</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo decanoato</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo palmitato</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo butirato</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>p-nitrofenil octanoato</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Ácido acético, sal sódica [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Gel de sílice HPTLC de aluminio 60 placas. Placas de gel de sílice HPTLC tamaño 20 x 20 cm, 25 hojas.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>TLC análisis & </td></tr><tr><td>Espectrómetro de extracción de lípidos UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Escáner de luminiscencia fotoestimulable&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de centelleo multipropósito</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Cuantificación de radiactividad</td></tr><tr><td>Célula de presión francesa</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Rotura de células</td></tr><tr><td>papel de cromatografía 3MM Chr</td><td>Whatman 3030917</td><td></td><td>TLC analysis</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021nuestra</td><td>referencia 11</td><td></td><td>cepa estudiada</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Células competentes</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>cepa de expresión de proteínas</td></tr><tr><td>vector pET9a</td><td>Novagen</td><td>69431</td><td>vector de expresión de proteínas</td></tr><tr><td>vector pET17b</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>vector de expresión de proteínas</td></tr><tr><td>poliestireno estéril tubo de fondo redondo (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiomarcaje de cultivos bacterianos tubos de</td></tr><tr><td>microcentrífuga de polipropileno (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Ensayos enzimáticos</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicerol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>patrón lipídico</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoil</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>patrón lipídico</td></tr><tr><td>DL-&alpha;-monopalmitina</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>patrón</td></tr><tr><td>lipídico ácido palmítico</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>patrón lipídico</td></tr></tbody></table>

la definición de sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Los microorganismos producen un amplio espectro de lipasas (fosfo) que son secretadas en el fin de hacer los sustratos externos disponibles para el organismo. Alternativamente, otros (fosfo) lipasas pueden estar asociadas físicamente con el organismo productor causando una facturación de lípidos intrínsecos y con frecuencia dando lugar a una remodelación de las membranas celulares. Aunque potenciales (fosfo) lipasas se pueden predecir con un número de algoritmos cuando la secuencia de gen / proteína está disponible, no ha sido obtenido con frecuencia prueba experimental de las actividades enzimáticas, especificidades de sustrato, y posibles funciones fisiológicas. Este manuscrito describe la optimización de las condiciones de ensayo de (fosfo) lipasas prospectivos con especificidades de sustrato desconocidos y cómo emplear estas condiciones optimizadas en la búsqueda para el sustrato natural de un respectivo lipasa (fosfo). El uso de sustratos cromogénicos artificiales, tales como derivados de p-nitrofenil, puede ayudar a detectar un menorla actividad enzimática de una lipasa predicho (fosfo) en condiciones estándar. Después de haber encontrado una actividad enzimática tal menor, los parámetros distintos de un ensayo enzimático se pueden variar con el fin de obtener una hidrólisis más eficiente del sustrato artificial. Después de haber determinado las condiciones en las que una enzima funciona bien, una variedad de posibles sustratos naturales deben ser analizadas para su degradación, un proceso que puede ser seguido empleando métodos cromatográficos diferentes. La definición de especificidades de sustrato de nuevas enzimas, a menudo proporciona hipótesis para un posible papel fisiológico de estos enzimas, que a continuación pueden ser probados experimentalmente. Siguiendo estas directrices, hemos sido capaces de identificar una fosfolipasa C (SMc00171) que degrada la fosfatidilcolina a fosfocolina y diacilglicerol, en un paso crucial para la remodelación de las membranas en la bacteria Sinorhizobium meliloti de las condiciones de fósforo limitante del crecimiento. Para dos predijo patatin-como fosfolipasas (SMc00930 y SMc01003) del mismo organismo, podríamos redefinir sus especificidades de sustrato y aclarar que SMc01003 es una lipasa diacilglicerol.

Actividad de la fosfolipasa-PC específico C SMc00171 con Bis- fosfato de p-nitrofenil Extractos libres de células obtenidas a partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, que tenían smc00171 expresaron, fueron estudiados por su capacidad para hidrolizar ésteres de fosfato-nitrofenil bis- p, utilizando un ensayo enzimático espectrofotométri...

Muchas de las (fosfo)lipasas predichas están mal caracterizadas con respecto a sus especificidades de sustrato y funciones fisiológicas. Aquí proporcionamos un protocolo para optimizar las actividades enzimáticas, buscar sustratos naturales y proponer funciones fisiológicas para estas enzimas.

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

El objetivo general de este procedimiento es acelerar la detección de sustratos fisiológicos para posibles lipasas y fosfolipasas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Entomología, como la forma en que las fosfolipasas contribuyen al remodelado de lípidos en membranas biológicas. La principal ventaja de esta técnica es que la optimización de la actividad enzimática y la búsqueda del sustrato natural para la enzima pueden realizarse de manera independiente.Aunque este método puede proporcionar información sobre la especificidad de sustrato de lipasas y fosfolipasas bacterianas, también puede modificarse para estudiar hidrolasas de cualquier otro organismo modelo. Tuvimos la idea inicial de este método cuando buscábamos una actividad enzimática que pudiera degradar el lípido intrínseco de membrana fosfatidilcolina en *Sinorhizobium meliloti*. Para preparar extractos proteicos libres de células, descongele las suspensiones de células bacterianas y almacénelas en hielo.Luego, pase las suspensiones celulares tres veces a través de una celda de presión fría a 20.000 libras por pulgada cuadrada. Elimine las células íntegras y los restos celulares mediante centrifugación a 5.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, prepare alícuotas de 100 y 500 µL del sobrenadante para su posterior análisis.Configure el ensayo enzimático previamente optimizado utilizando los esquemas de pipeteo que se indican en el protocolo escrito. Para una cobertura inicial de actividades enzimáticas distintas, use sustratos artificiales que produzcan un producto coloreado tras la hidrólisis, como derivados de para-nitrofenol o PNP. Siga el curso temporal del aumento de absorbancia a 405 nanómetros, debido a la formación de PNP en un espectrofotómetro a 30 grados Celsius durante un período de cinco minutos.Finalmente, realice los cálculos según se describe en el protocolo del texto. Para la marcación radiactiva de lípidos, prepare un cultivo previo nocturno de un organismo de interés en cinco mililitros del medio de cultivo deseado y crezca a 30 grados Celsius. A partir del cultivo previo, inocule en 20 mililitros de medio fresco en un matraz de cultivo de 100 milímetros para obtener una densidad óptica inicial a 620 nanómetros de 0,3 para el cultivo.A continuación, transfiera una alícuota de un mililitro de la cultura a un tubo estéril de poliestireno de fondo redondo de 14 mililitros bajo condiciones estériles. Añada un microcurio de acetato 114 c al cultivo de un mililitro. Luego, incube el cultivo líquido con agitación a 30 grados Celsius durante un período de 24 horas.Al final del período de incubación, transfiera el cultivo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 12.000 × g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Reuspenda el precipitado en 100 microlitros de agua. En este punto, almacene la suspensión celular a menos 20 grados Celsius o continúe inmediatamente con la extracción de lípidos polares.Para realizar la extracción de lípidos polares, agregue 375 microlitros de una solución de metanol a cloroformo en proporción dos a uno a los 100 microlitros de suspensión celular acuosa. Vortexee la muestra durante 30 segundos antes de incubarla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, centrifugue durante cinco minutos a 12.000 ×g a temperatura ambiente.Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue 125 microlitros de cloroformo y 125 microlitros de agua al sobrenadante. Después de mezclar en vórtex durante 30 segundos, centrifugue la muestra durante un minuto a 12 000 × g a temperatura ambiente.Transfiera la fase inferior de cloroformo a un tubo nuevo. Luego, seque la solución con una corriente de gas nitrógeno. Disuelva los lípidos secos en 100 microlitros de solución de cloroformo a metanol.Para la separación de lípidos neutros polares mediante cromatografía en capa fina, aplique alícuotas de tres microlitros de las muestras de lípidos sobre una placa de aluminio recubierta con gel de sílice para cromatografía en capa fina de alto rendimiento, comenzando a dos centímetros de los bordes de la placa. Si se analizan múltiples muestras en cromatografía unidimensional, mantenga una distancia de al menos 1,5 centímetros entre los diferentes puntos de aplicación de las muestras. Transfiera la fase móvil a una cámara de desarrollo para TLC, revestida internamente con papel cromatográfico.Cubra con una placa de vidrio para permitir que la cámara se sature durante 30 minutos. Transfiera la lámina de gel de sílice HPTLC sobre aluminio con las muestras de lípidos secas a la cámara. Deje que la placa se desarrolle durante 30 minutos en una cámara cerrada antes de retirarla.Luego, deje que los disolventes se sequen en una campana de flujo durante dos horas. Una vez que la lámina de TLC desarrollada esté seca, incúbela con una pantalla de luminiscencia fotostimulable en una caja cerrada durante tres días. A continuación, exponga la pantalla incubada a un escáner de PSL y obtenga una imagen virtual de los lípidos marcados con radioisótopos separados.Para determinar la actividad de la diacilglicerol (DAG) lipasa, primero agregue 5.000 CPM de DAG marcado con 14C a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Asimismo, agregue una solución de Triton X-100 al tubo y mezcle mediante vortex. Seque la solución bajo una corriente de nitrógeno.Para un ensayo final de 100 microlitros, agregue tampón Tris-HCl, una solución de cloruro de sodio y agua bidestilada. Vortexee durante cinco segundos. Inicie la reacción añadiendo cinco microlitros de enzima a la solución.Incube la solución a 30 grados Celsius durante cuatro horas. Detenga la reacción mediante la adición de 250 microlitros de metanol y 125 microlitros de cloroformo, antes de extraer los lípidos según se describió anteriormente en este video. Proceda a analizar los lípidos neutros polares mediante TLC unidimensional (1DTLC) e imágenes posteriores por PSL como antes.Aunque la fosfolipasa predicha SMc01003 muestra actividad con ésteres acílicos artificiales de para-nitrofenol, la actividad es sólo el doble o triple de la actividad de fondo presente en extractos libres de células de Escherichia coli, en los cuales no se había expresado ningún gen foráneo. Esto indica que los ésteres acílicos de para-nitrofenilo no parecen ser buenos sustratos para SMc01003. Mientras que los extractos libres de células de E. coli no pueden degradar el diacilglicerol, los extractos de cepas en las que se había expresado la fosfolipasa predicha, SMc01003, provocaron una degradación del diacilglicerol.Aunque se predijo que SMc01003 era una fosfolipasa, en realidad es una diacilglicerol lipasa que degrada el diacilglicerol en monoacilglicerol y un ácido graso. Luego degrada aún más el monoacilglicerol en glicerol y otro ácido graso. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en unas pocas semanas si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo optimizar las actividades enzimáticas de lipasas y fosfolipasas, y cómo continuar con la búsqueda de sus sustratos fisiológicos. Una ventaja crucial de este procedimiento es que la optimización de la actividad enzimática puede separarse de la búsqueda del sustrato natural de la enzima. No olvide que trabajar con disolventes orgánicos o sustancias radiactivas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones necesarias al realizar este procedimiento.

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Investigación

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