La medición de la discapacidad neurológica progresiva en un modelo de ratón de la esclerosis múltiple

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el deterioro neurológico progresivo en ratones con enfermedades desmielinizantes crónicas. Logramos esto ofreciendo recomendaciones de parámetros de prueba adecuados para estudiar la discapacidad neurológica a largo plazo en el modelo del virus de Theilers de esclerosis múltiple progresiva, utilizando la prueba de Rotarod. Este procedimiento proporciona una línea de base contra la cual evaluar la relevancia del modelo de ratón para la desmielinización progresiva y es útil para probar terapias destinadas a tratar afecciones neurológicas progresivas como la esclerosis múltiple.

La ventaja de esta prueba optimizada sobre el sistema tradicional de puntuación visual es que genera una variable objetivo para cuantificar el efecto a largo plazo de las terapias y los procedimientos experimentales sobre las funciones motoras. Darlene Royce, técnica del laboratorio de neuroinmunología de Dartmouth, demostrará este procedimiento. Con el fin de evaluar el equilibrio basal, la coordinación y el control motor, se debe iniciar el protocolo de adaptación cinco días antes de la infección por TMEV permitiendo primero que los ratones se aclimaten a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos.

Mientras los ratones se aclimatan, preconfigure el Rotarod con los parámetros de entrenamiento de menos cinco DPI. Luego, levante un mouse por la cola y colóquelo en la barra de espaldas al operador. Si el ratón se cae o salta, colóquelo de nuevo en su carril en el Rotarod hasta que todos los ratones estén en posición.

Después de cargar los cuatro ratones, presione el botón enter para iniciar el experimento. Asegúrese de que los temporizadores se inicien automáticamente y observe las rotaciones por minuto en pantalla para cada carril. Luego, a medida que cada animal cae de la vara, registre la velocidad de la vara en el momento de la caída, así como la duración del tiempo que el animal permaneció en la vara.

Después de que todos los ratones hayan caído, use un pañuelo de papel para eliminar los boli fecales y la orina de la varilla, ya que la presencia de orina y material fecal puede afectar la capacidad de los ratones para agarrar correctamente la varilla. Después de un descanso de tres minutos, dé a los ratones una segunda y luego una tercera prueba en la que el tiempo máximo por prueba individual es de 240 segundos. Administre un total de tres ensayos durante cada día de prueba.

Finalmente, regrese los ratones a su jaula de origen. En los días menos cuatro, menos tres, menos dos y menos uno PI, preajuste el Rotarod con los parámetros del protocolo de entrenamiento apropiados y repita el experimento del Rotarod. Comience moviendo las jaulas que contengan ratones SJL hembras de cuatro a seis semanas de edad del estante a un espacio de trabajo cómodo.

Utilice punzones en las orejas para marcar a los ratones y permitir la evaluación individual de la enfermedad clínica e histológica. A continuación, extraiga 30 microlitros de material infeccioso de TMEV en PBS en una aguja de jeringa de insulina de calibre 29. Prepare la máquina de gas de anestesia asegurándose de la presencia de cantidades adecuadas de oxígeno e isoflurano durante la duración del procedimiento.

Coloque el animal en la cámara de inducción y selle la parte superior. Después de unos minutos, retire al animal de la cámara y pruebe el ratón pellizcando la almohadilla del pie para asegurar una anestesia adecuada. A continuación, limpie el lugar de la inyección con alcohol isopropílico al 70% e inyecte los 30 microlitros de material infeccioso de TMEV en el hemisferio cerebral derecho mediante inyección a mano alzada.

Finalmente, regrese el mouse a su jaula de retención una vez que esté completamente alerta y móvil. En el séptimo día después de la infección, preajuste el Rotarod con los parámetros experimentales apropiados y repita el ejercicio completo de entrenamiento con Rotarod con los parámetros del protocolo experimental apropiados. Después de la tercera prueba de cada día, pese cada ratón y anote el peso corporal en la hoja de datos.

Pruebe a los ratones dos veces por semana durante las siguientes seis semanas de la misma manera. Después de seis semanas, pruebe a los ratones una vez a la semana con el mismo protocolo experimental durante un promedio de 150 días experimentales. A continuación, analice los datos brutos y expréselos como un índice funcional neurológico, o NFI.

Para determinar el valor individual del NFI, calcule el umbral de rendimiento de referencia de cada ratón como la media de todos los tiempos de funcionamiento de 15 a 45 días después de la infección. Con el fin de permitir la evaluación del rendimiento motor como resultado de la desmielinización progresiva y excluir cualquier déficit contribuyente debido a la encefalitis temprana. A continuación, calcule el valor NFI como la media de los tres tiempos medios de ejecución más recientes dividida por el umbral de rendimiento de referencia del ratón.

Por último, calcule un IFN ajustado dividiendo el valor del IFN por el valor medio del IFN obtenido por el grupo tratado simulado en ese día específico. Esta figura muestra que los ratones infectados con TMEV muestran déficits neurológicos significativamente mayores a lo largo del tiempo en comparación con los ratones de control. La infección crónica con dos cepas diferentes de TMEV afectó negativamente los tiempos de carrera de los ratones.

Ambos grupos de ratones infectados con TMEV tenían valores de NFI significativamente más bajos que los de los ratones simulados. Además, no hubo diferencias entre la progresión de la discapacidad en los ratones infectados con la cepa BeAn y los infectados con la cepa DA en todos los puntos temporales. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar los métodos tradicionales de puntuación visual, como la prueba del reflejo de enderezamiento, para evaluar rápidamente la salud general en ratones.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la esclerosis múltiple y las enfermedades neurodegenerativas probaran la efectividad de las terapias y otras intervenciones para retrasar la discapacidad progresiva. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la discapacidad progresiva a largo plazo en ratones. Este procedimiento no solo es útil para detectar la discapacidad neurológica progresiva en el modelo de virus de Theiler, sino que también es útil para descubrir deficiencias en otros modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas.