Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón
19 de diciembre de 2016
Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.
El objetivo general de este ensayo de gel matriz in vivo es investigar la interacción de las células endoteliales con parásitos. Este ensayo de matrigel está diseñado para ayudar a los investigadores a estudiar las etapas principales de la androgénesis. También permitirá la identificación de las vías de señalización responsables de las etapas principales en la formación de vasos sanguíneos, así como de los genes cuya disfunción puede provocar trastornos vasculares y otras aberraciones de la androgénesis.
La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la formación de vasos sanguíneos in vivo que involucra tanto a las células endoteliales como a sus células de soporte, los pericitos. Para comenzar, cultive células endoteliales humanas y cultivos celulares de parásitos en placas de 100 milímetros con 10 mililitros del medio adecuado. Cambie el medio cada dos o tres días hasta que las células alcancen una confluencia del 80 %.
Para preparar la solución de gel matriz para mezclar con las células, descongele un stock de gel matriz durante la noche a cuatro grados Celsius. Luego, prepare alícuotas de 1,5 mililitros para almacenar a largo plazo a veinte grados Celsius bajo cero, o a cuatro grados Celsius durante hasta dos semanas. Cada tapón experimental requerirá 200 microlitros de gel matriz.
Así, un tubo cargado puede abastecer seis placas con un exceso del 25%. Prepare cada alícuota necesaria para su uso añadiendo 15 microlitros de stock de beta-FGF 100x descongelado. Mezcle el beta-FGF en solución mediante pipeteo, luego incube en hielo durante al menos 30 minutos antes de añadir las células.
En este momento, enfríe algunas jeringas de insulina de 1 cc con aguja de 28 gauge para las inyecciones. Para recolectar las células de las placas de cultivo, retire el medio y lave las células una vez con PBS. Después de retirar el PBS, agregue un mililitro de solución de tripsina y devuelva las placas al incubador durante un minuto.
Luego, pipetee dos mililitros de medio de cultivo sobre las placas para desprender las células y recoja el medio en un tubo de 15 mililitros. Ahora, verifique la concentración de las muestras utilizando un hemocitómetro. A continuación, prepare alícuotas de células en tubos de 15 mililitros.
Se utiliza aquí una combinación de un millón de células endoteliales y 200.000 parásitos para el grupo experimental. A continuación, centrifugue las alícuotas celulares a 400g durante cinco minutos. Luego, agregue el volumen calculado de gel matriz al sedimento celular y mezcle con pipeteo suave para que no se forme espuma, ya que las burbujas de aire no pueden inyectarse.
Ahora mantenga las preparaciones en hielo hasta que los ratones estén listos para la inyección. Después de anestesiar un ratón con isoflurano y confirmar el estado de anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie, sujete el ratón al sistema de no rebreathing que suministra isoflurano y colóquelo sobre la almohadilla calefactora, con el lado ventral hacia abajo. Ahora retire aproximadamente un centímetro cuadrado de pelo de ambas regiones laterales posteriores.
A continuación, limpie la piel expuesta con alcohol al 70%. Luego, cargue un mililitro de la solución celular preparada en una jeringa enfriada, lo suficiente para cuatro implantes. Para realizar una inyección, levante la piel de la espalda para localizar el espacio subcutáneo.
Luego, inyecte lentamente 200 microlitros de manera uniforme en el espacio subcutáneo posterior a la caja torácica, y retire lentamente la aguja para evitar fugas. Después de la inyección, se formará un bulto en el sitio. Limpie el sitio con alcohol y luego marque el contorno del bulto con un rotulador permanente para poder localizarlo más tarde.
A continuación, repita el procedimiento de inyección en el otro lado del ratón. Asegúrese de inyectar todas las células dentro de los tres minutos, ya que de lo contrario comenzarán a adherirse a la jeringa. Es fundamental realizar bien el paso de inyección para garantizar que el tapón de gel matriz se forme entre las capas de piel y músculo, de modo que el tapón mantenga una buena forma y no se difunda.
Antes de proceder a inyectar el siguiente ratón, deje que el ratón inyectado permanezca sobre la almohadilla térmica durante un minuto para dar tiempo a que la matriz se gelifique. Tras la eutanasia, coloque el ratón sobre la mesa de operaciones. Después de eliminar cualquier pelo regenerado en el sitio de inyección, busque las líneas marcadoras que identifican la ubicación del tapón.
Luego, utilizando tijeras quirúrgicas finas, realice una incisión a lo largo del borde marcado del cilindro, perpendicularmente a la piel y hasta el músculo subyacente. Corte cuidadosamente alrededor de la periferia del borde marcado. A continuación, retire el cilindro, manteniéndolo intercalado entre las capas de piel y músculo.
Lave inmediatamente el injerto en un vaso de precipitados pequeño con PBS para eliminar la sangre. Luego, coloque todo el injerto en un tubo de 50 mililitros con 25 mililitros de paraformaldehído al 4%. Deje que se fije a temperatura ambiente durante 24 horas sin agitación.
Al día siguiente, transfiera los fragmentos a 25 mililitros de etanol al 70 % durante 24 horas. Luego, continúe con la inclusión en parafina. Las secciones de los fragmentos que contienen solo células endoteliales muestran que algunos vasos no se perfunden con la sangre del huésped después de 14 días in-vivo.
Por el contrario, los implantes que contienen tanto células endoteliales como parásitos muestran muchos vasos perfundidos tras 14 días in-vivo. Estos implantes presentan células positivas para la tinción de actina de músculo liso, visibles en rojo, inmediatamente adyacentes a células endoteliales positivas para CD31, visibles en verde. Por lo tanto, los parásitos podrían desempeñar un papel importante en la formación de nuevos vasos sanguíneos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar esta poderosa técnica in vivo para estudiar la formación de vasos sanguíneos utilizando múltiples tipos celulares. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren diversos temas de biología vascular en modelos de ratón. Tras seguir este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa y el inmunotransferido tipo Western, para responder preguntas adicionales, tales como los cambios en la expresión génica y en proteómica.
Esta técnica poderosa permitirá al investigador estudiar in vivo cómo interactúan las células endoteliales y los parásitos durante la formación de vasos sanguíneos, que es un paso clave en la androgénesis. Esta técnica poderosa también permitirá al investigador estudiar otras interacciones entre células que son relevantes para comprender enfermedades vasculares como la hipertensión pulmonar, entre otras.
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Descripción general
Este protocolo presenta un método para estudiar las interacciones endoteliales-pericitarias humanas in vivo mediante un ensayo de angiogénesis en tapón de gel matriz. El ensayo tiene como objetivo esclarecer las vías de señalización implicadas en la formación de vasos sanguíneos e identificar los genes asociados con trastornos vasculares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Angiogénesis
- Interacciones celulares
- Biología vascular
Antecedentes
- La interacción entre las células endoteliales y los pericitos es fundamental para la estabilidad de los vasos sanguíneos.
- Comprender estas interacciones puede proporcionar información sobre los trastornos vasculares.
- El ensayo de tapón de gel matriz permite la observación in vivo de estos procesos.
- Estudios previos han destacado la importancia de las vías de señalización en la angiogénesis.
Objetivo del estudio
- Para investigar las interacciones entre endotelio y pericitos.
- Para identificar las vías de señalización implicadas en la formación de vasos sanguíneos.
- Para explorar los genes que podrían provocar trastornos vasculares cuando funcionan de manera anómala.
Métodos Utilizados
- Ensayo in vivo con gel de matriz.
- Cultivo de células endoteliales y pericitos humanos.
- Observación de la formación de vasos sanguíneos.
- Análisis de las vías de señalización y la expresión génica.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de interacciones endoteliales-pericitarias in vivo.
- Identificación de las vías de señalización clave implicadas en la angiogénesis.
- Conocimientos sobre los genes asociados con trastornos vasculares.
- Demuestra las ventajas del ensayo de tapón de gel matriz.
Conclusiones
- El ensayo de tapón de gel matriz es efectivo para estudiar las interacciones endotelio-pericitos.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la formación de vasos sanguíneos.
- Implicaciones potenciales para estrategias terapéuticas dirigidas a trastornos vasculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo de implante de gel matricial in vivo aborda un vacío crítico en la investigación de la angiogénesis al permitir el estudio de las interacciones humanas entre endotelio y pericitos dentro de un microentorno fisiológico, lo cual es esencial para reducir los riesgos en la validación de dianas vasculares y mejorar la confianza predictiva en modelos preclínicos. El ensayo posibilita estudios mecanicistas sobre la maduración de vasos sanguíneos y el reclutamiento de pericitos, aportando relevancia traslacional para trastornos vasculares pulmonares y sistémicos. Complementa los sistemas in vitro existentes al proporcionar lecturas funcionales como la formación de vasos perfundidos y la cobertura por pericitos, que son directamente aplicables a los flujos de trabajo de validación de dianas y descubrimiento de compuestos líderes en la I+D de biofármacos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas respecto a la señalización endotelial-pericitaria en la maduración vascular.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad con el fin de evaluar la interacción con el blanco y la modulación de la vía in vivo.
- Valor científico: Apoya la reducción mecanicista de riesgos al aclarar el papel funcional de los pericitos en la estabilidad y perfusión de los vasos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos basados en histología, incluyendo longitud, número, tamaño de los vasos y cobertura por pericitos, para análisis comparativo.
- Valor operativo: Proporciona lecturas vasculares estandarizadas y reproducibles adecuadas para la validación de ensayos y cascadas de cribado de compuestos.
- Valor científico: Permite la preparación de sistemas biológicos validados para la evaluación posterior de candidatos angiogénicos o antiangiogénicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Ofrece un modelo relevante para la enfermedad que permite estudiar trastornos vasculares como la hipertensión pulmonar mediante el trasplante de células humanas en ratones inmunodeprimidos.
- Valor operativo: Facilita la alineación traslacional de biomarcadores al vincular la cobertura de pericitos y la maduración de vasos con resultados funcionales.
- Valor científico: Apoya la continuidad preclínica al permitir la evaluación de intervenciones genéticas o farmacológicas sobre la formación de redes vasculares.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, especialmente para programas de biología vascular que requieren la validación funcional de mecanismos angiogénicos o de estabilización vascular.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la observación de la comunicación cruzada entre endotelio y pericitos en un microentorno vivo.
- Tamizaje: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante la formación estandarizada de tapones, fijación y seccionado para análisis histológico cuantitativo.
- Análisis: Proporciona lecturas basadas en parámetros morfométricos y en la perfusión (tamaño y número de vasos, cobertura por pericitos, lúmenes que contienen glóbulos rojos) que permiten la evaluación comparativa entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar in vivo interacciones vasculares humanas, relevantes para la angiogénesis pulmonar y sistémica.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para estudios genéticos, interrogación de vías y campañas de descubrimiento de fármacos dirigidas a dianas vasculares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas vasculares mediante la observación directa de la maduración vascular dependiente de los pericitos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante proporciones definidas de células, preparación de geles de matriz y protocolos de cuantificación histológica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales de maduración vascular en una etapa temprana del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas vasculares basada en el reclutamiento de pericitos y la funcionalidad vascular in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo primario de células humanas, técnicas quirúrgicas estériles y procesamiento histológico.
- Depende de modelos de ratón inmunocomprometido (por ejemplo, SCID) y acceso a gel matriz, marcadores de perfusión y reactivos para inmunohistoquímica.
- Exige estandarización entre equipos para la preparación celular, la consistencia en las inyecciones y el análisis histológico ciego.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen fuentes celulares específicas de especie, tipos de pericitos y pruebas de compuestos angiogénicos frente a antiangiogénicos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la duración del ensayo de 14 días, la variabilidad en la recuperación del tapón y la dependencia del análisis histológico terminal en lugar de imágenes en tiempo real.
