Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con

El objetivo general de este ensayo basado en un marcador celular fluorescente es monitorear y caracterizar poblaciones celulares específicas de interés mientras migran desde la piel hasta el ganglio linfático drenante tras una infección en la almohadilla plantar con Bacilo de Calmette-Guérin, o BCG. Hemos utilizado esta técnica para identificar la población de células dendríticas que migra al ganglio linfático drenante tras la infección cutánea con BCG. Esta técnica permitió estudiar la migración celular mediante la inyección de los tumores durante una ventana definida de 24 horas.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que las etapas de inyección en la almohadilla del pie y aislamiento del ganglio linfático son difíciles de aprender a partir de texto. Para la inyección de microbacterium Bovus BCG, tras confirmar el nivel adecuado de sedación mediante el pellizco del dedo del pie, utilice una jeringa equipada con una aguja de 29 gauge y 1/2 pulgada para inocular la almohadilla plantar del pie trasero de un ratón de ocho a doce semanas de edad con uno por diez a la sexta unidades formadoras de colonias de la bacteria en 30 microlitros de PBS. Inyecte las almohadillas plantares de control únicamente con PBS.

Luego, supervise a los animales hasta que estén completamente recostados y puedan soportar peso sobre la almohadilla del pie inyectada. Para la inyección de CFSE, en el momento adecuado después de la inyección de BCG, diluya diez veces un vial de CFSE a temperatura ambiente y cinco milimolar en PBS, teniendo cuidado de resuspender completamente la solución. A continuación, cargue la jeringa con el CFSE diluido y administre 20 microlitros en la misma almohadilla del pie trasero que recibió la primera inyección.

24 horas después de la inyección de CFSE, realice cuidadosamente una incisión vertical en el muslo trasero y elimine la grasa muscular. A continuación, use tijeras y pinzas para exponer y extirpar el ganglio linfático poplíteo, ubicado profundamente dentro de la bolsa de grasa en la cavidad de la rodilla. Transfiera el ganglio linfático a 0,5 mililitros de PBS estéril sobre hielo, y homogenice el ganglio linfático a través de un filtro celular de 70 micrones dentro de un pocillo de una placa de seis pocillos que contiene cinco mililitros de PBS, utilizando el extremo posterior de una jeringa de tres mililitros.

Lave el filtro con otros 5 mililitros de tampón y transfiera la solución celular a un tubo de 15 mililitros. A continuación, centrifugue las células y resuspenda el precipitado en un volumen suficiente de tampón. Para etiquetar las células para citometría de flujo, distribuya de uno a diez por diez a la sexta células en tubos redondos de fondo poliestireno de 5 mililitros y lave las células con tampón FACS fresco.

Re-suspender los pellet en 50 a 100 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado que contenga anti-CD16 CD32 de ratón para bloquear interacciones inespecíficas mediadas por FC en tampón FACS sobre hielo, protegido de la luz. Después de 30 a 45 minutos, lavar las células en tampón FACS y re-suspender los pellet en 50 a 100 microlitros de tampón FACS fresco. La mayor parte de la marcación con CFSE en el ganglio linfático poplíteo se observa en células MHC-II alta y CD11c positivas bajas, consistente con células dendríticas de la piel que migran hacia los ganglios linfáticos drenantes de la piel.

Tanto la frecuencia como el número total de estas células marcadas parecen aumentar en los ganglios linfáticos poplíteos de ratones infectados con BCG, en comparación con los controles inyectados con PBS, lo que sugiere que el BCG potencia la reubicación de estas células hacia el ganglio linfático drenante. Las células dendríticas de la piel continúan entrando en el ganglio linfático drenante hasta cinco días después de la infección, extendiendo así la migración de células dendríticas en el modelo actual mucho más allá del período necesario para la activación inicial de linfocitos T CD4 positivos específicos para antígeno en el ganglio linfático poplíteo. Además, las células dendríticas migratorias de la piel expresan niveles elevados de moléculas coestimuladoras, lo que respalda la idea de que estas células dendríticas migratorias se encuentran activadas.

Es importante destacar que tanto las células dendríticas monocitoides como plasmacitoides resistentes de los ganglios linfáticos, que ingresan a los ganglios linfáticos inflamados a través de vénulas endoteliales altas y no de linfáticos aferentes, son negativas para CFSE, lo que verifica aún más que la marcación con CFSE ocurre principalmente en la almohadilla plantar. Además, análisis adicionales mediante citometría de flujo revelan que una subpoblación de células EpCAM baja CD11b alta constituye el principal subconjunto de células dendríticas migratorias de la piel que drena hacia el ganglio linfático poplíteo en respuesta a la infección por BCG. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco minutos si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante tener cuidado con el sitio de inyección y el volumen inyectado; debe tenerse mucha precaución para no dañar el ganglio linfático drenante durante la disección. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos como citometría de flujo o microscopía confocal para un análisis adicional de la microexpresión celular específica de subpoblaciones. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores rastrearan las células desde la piel hasta el ganglio linfático drenante, dentro de un período de 24 horas en respuesta a una infección o vacunación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar inyecciones en la almohadilla plantar y de cómo localizar y aislar los ganglios linfáticos drenantes para el seguimiento y la caracterización de poblaciones de células dendríticas migratorias de interés.