Name: Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende el método de transducción-trasplante para generar modelos murinos con genes específicos en células hematopoyéticas. Esta técnica permite estudiar neoplasias mieloproliferativas y hematopoyesis normal en ratones.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la V Foundation Scholar (AGF) y la MPN Research Foundation (AGF).

Este estudio fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California, Irvine. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. 1. Generación de Ecotropic Retrovirus <ol><li> Preparar plásmidos de alta calidad con una concentración de al menos 1 g / l usando un kit maxi-prep comercial o la purificación de cloruro de cesio. NOTA: Estos incluyen un vector de MSCV columna vertebral que codifica el gen de interés (en este caso CALR 7,8) y marcador de elección (GFP, Neo, etc.), así como un plásmido de empaquetamiento ecotrópico, codificación gag-pol-env (en lo aquí como plásmido). </li><li> Descongelación y expandir las células 293T de bajo pasaje en DMEM suplementado con FBS al 10% y L-glutamina con penicilina / estreptomicina (D10). Placa de 5 x 10 6 células en un tejido de 10 cm placa de cultivo tratadas en una atmósfera humidificadacultura incubadora de tejidos a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Expandir las células 293T en cultivo. En el día antes de la transfección, lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y el sobrenadante aspirado en un matraz de vacío. </li><li> Para trypsinize células, añadir 2 ml 0,05% de tripsina y se incuba platos en un incubador de cultivo tisular humidificado durante 2 - 3 min a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Para detener la tripsinización, añadir 3 ml de D10 a plato y las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante en un frasco de vacío sedimento celular y resuspender en 2 ml de D10. </li><li> Contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro. </li><li> Semilla de 2 x 10 6 células por placa de 10 cm en tres placas de cultivo de tejidos tratados por el virus generados. NOTA: Para obtener resultados óptimos, no permita que las células se exceden 30 - 50% de confluencia en el momento de la transfección o un rendimiento deficiente del virus puede ser obtenida. </li><li> Inmediatamente antes de la transfección,medios de aspirado en un frasco de vacío y reemplazan con 5 ml de D10 fresco. </li><li> Por cada 10 cm placa de Petri a transfectar preparar un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril individual. </li><li> Pipetear 760 l de medio de suero reducido en cada tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir cuidadosamente 40 l de reactivo de transfección directamente en los medios de comunicación. Incubar los tubos en la campana de cultivo de tejido a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir 30 g de MSCV vector con el gen de interés (15 mg si se utiliza el vector vacío), así como 5 g de plásmido a cada tubo respectivo y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. Se incuba a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido durante 15 min adicionales. NOTA: Los vectores más pequeños tienden a tener rendimientos virales más altas. </li><li> Añadir con cuidado el volumen total de cada reacción (aproximadamente 800 l) gota a gota en su respectiva placa de 10 cm de Petri y se incline suavemente el plato de lado a lado para mezclar. Volver a la cu células del tejido humidificadolture incubadora. </li><li> Después de un 8 hr o incubación durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos, medios de aspirado en un frasco de vacío y suavemente reemplazan con 10 ml de D10 fresco. </li><li> A las 48 horas después de la transfección recoger el líquido sobrenadante en una jeringa de 35 ml y se filtra a través de una membrana de 0,45 micras para eliminar los restos celulares. </li><li> OPCIONAL: Colocar 10 ml de vuelta fresca D10 en las células 293T y el virus adicional puede ser cosechado a 72 horas después de la transfección. </li><li> Disponer de células 293T en residuos biológicos peligrosos cuando se recoge ningún virus adicional. </li><li> sobrenadante viral alícuota en volúmenes de un solo uso (por ejemplo 1 ml para el título del virus o 6,5 ml para la infección BM). virus de flash-congelación con nitrógeno líquido y el virus se almacena a -80 ° C. NOTA: Evitar ciclos de congelación / descongelación repetidos, ya que reducen en gran medida el título de virus. </li></ol> 2. Determinar el título viral relativa por Citometría de Flujo <ol><li> Descongelar las células 3T3 y mantener en D10. Cultivar las células en un 10 cmde cultivo de tejidos plato tratada en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Realizar título viral por triplicado. Para preparar las células, lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y el sobrenadante aspirado en un matraz de vacío. </li><li> Para trypsinize células, añadir 2 ml 0,05% de tripsina y se incuba platos en un incubador de cultivo tisular humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Para detener la tripsinización, añadir 3 ml de D10 a plato y las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante en un frasco de vacío sedimento celular y resuspender en 2 ml de D10. </li><li> Contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro. </li><li> Seed células 3T3 a una densidad de células de 1 x 10 5 en quince 60 mm placas de cultivo de tejidos tratados e incubar durante la noche. </li><li> Hacer 1: 3, 1:10, 1:30, y 1: 100 diluciones de sobrenadante viral descongelado utilizando D10 en un total de 1 ml. También incluir un control libre de virus. </li><li> me aspirardia de células 3T3 en un matraz de vacío y reemplazar con 4 ml de D10. </li><li> Superposición de las células 3T3 con las diluciones de sobrenadante viral y añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml a cada plato. Incubar durante 48 horas en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Determinar el título viral relativa por citometría de flujo: <ol><li> Para lavar las células, aspirar los medios de comunicación en un matraz de vacío y añadir 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar el PBS en un matraz de vacío. Añadir 1 ml 0,05% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 2-5 min para separar las células del plato. </li><li> Añadir 3 ml de D10 y la pipeta hacia arriba y abajo para separar las células restantes de la placa. Transferir las células a un tubo de FACS y se centrifuga a 400 xg durante 10 min. </li><li> Decantar el sobrenadante y lavar las células con 3 ml de PBS. Centrifugar a 400 xg durante 10 min y el sobrenadante se decanta. Resuspender en 200 l de PBS. </li><li> Las células se ejecutan en un citómetro de flujo 9. Recoger entre 20.000 - 30.000 eventos dentro de tque viven puerta celular (determinada por el FSC frente a SSC) y calcular el porcentaje de GFP + y - GFP células. NOTA: El título viral se considera aceptable cuando la dilución 01:30 de los rendimientos de sobrenadante viral por lo menos 50% + GFP células 3T3. Si a continuación, se pueden obtener resultados esta dilución en células GFP menos de 50% + de transducción de resultados subóptimos. El cálculo para determinar el título viral fue adaptado de Limón et al. , Blood (1997) 9. </li><li> Para determinar el título de virus relativa, utilice la ecuación: el título del virus = unidades formadoras de partículas (UFP) / ml = [(Número de células 3T3 × Frecuencia de células GFP +) / volumen de sobrenadante (ml)] x Factor de dilución. </li></ol></li></ol> 3. transducir donantes células de médula ósea <ol><li> Para preparar ratones donantes de médula ósea (BM) de la cosecha, primero anestesiar los ratones por vaporizador de isoflurano con un caudal de 5% suplementario combinadode oxígeno a 1 L / min. Una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta. NOTA: Los ratones donantes (menos de 8 semanas de edad) se deben preparar 5 días antes de la cosecha de médula ósea (8 días antes del trasplante). Uno ratones donantes proporcionarán suficientes células durante al menos 2 receptores. </li><li> Inyectar 150 mg / kg 5-fluorouracilo (5-FU) a través de la inyección de retro-orbital en ratones anestesiados utilizando una × ½ &quot;aguja 27 G. ¡PRECAUCIÓN! 5-FU un agente de quimioterapia contra el cáncer. Siempre maneje 5-FU dentro de una campana de humos química certificado o una cabina de bioseguridad por conductos. Consultar con el comité de seguridad en el laboratorio y animal de la institución para determinar el etiquetado apropiado de los ratones tratados con 5-FU. <ol><li> Coloque el ratón anestesiado en su lado y restringir utilizando tanto el pulgar y el índice tal que el ojo sobresale ligeramente de la cabeza. </li><li> Comenzando con el lateral de la aguja para el canto medial y con el bisel hacia arriba, inserte la aguja en un 45° de ángulo en la dirección medial y se detendrá cuando se inserta la aguja hasta la mitad. Inyecte lentamente las células y eliminar eliminar cuidadosamente la aguja. NOTA: Si esta técnica se realiza correctamente, el ojo debe retraerse ligeramente y sin resistencia, deben ser sentidas tras la inserción de la aguja. </li><li> Examine el ratón para detectar cualquier signo de daño tales como inflamación o sangrado. </li></ol></li><li> Extracción de la médula ósea después de 5 días de tratamiento con 5-FU (3 días antes del trasplante). <ol><li> Anestesie ratones por vaporizador de isoflurano con un caudal de 5% de oxígeno suplementario combinado a 1 L / min. Una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta. </li><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical. Esterilizar ratón pulverizando generosamente con EtOH al 70% hasta que la piel se moja. </li><li> Usando tijeras de disección, hacer una incisión en la piel y la fascia diseccionar lejos de los músculos de las piernas. A continuación, diseccionar la pierna lejos de ratón mediante el corte del fémur en la cadera y la tibia en el tobillo. </li><li> curvala pierna en forma de &quot;L&quot; y separar cada hueso de la pierna por el corte en la articulación de la rodilla con las tijeras de disección. </li><li> Para eliminar el cartílago en los extremos distales de cada hueso de la pierna, utilizar las tijeras de disección muscular para raspar suavemente hacia un extremo del hueso de la pierna hasta que se desacopla del cartílago. </li><li> El uso de una jeringa con una aguja de 27 G x ½ pulgadas, a ras cada hueso de la pierna con PBS suplementado con 2% de FBS sobre una membrana de nylon 100 mM en un tubo cónico de 50 ml. hueso Flush hasta que el hueso se vuelve blanco para maximizar el número de células cosechadas. </li><li> Utilice el émbolo de una jeringa para triturar las células a través de la membrana de nylon en el tubo cónico de 50 ml para obtener una suspensión de células individuales. Repita con la otra pierna del ratón. </li></ol></li><li> centrifugar las células a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. Resuspender en tampón BM 5 ml de cloruro de amonio potasio (ACK) para lisar las células rojas de la sangre. Se incuban las células en hielo durante 10 min. </li><li> Llenar el tubo con PBS para detener la lisis celular. CentriFUGE células a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. Repetir el paso de lisis si el sedimento BM es de color rojo. </li><li> Volver a suspender en 5 ml de PBS y contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro. </li><li> Resuspender las células a 2 x 10 6 células por m con el coctel pre-stim 2x que contiene DMEM suplementado con 20% de FBS, L-glutamina, penicilina / estreptomicina, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) y SCF (112 ng / ml). Placa de 2 ml por pocillo en placas de 6 pocillos. </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Añadir 2 ml de sobrenadante viral a cada uno de las células BM bien que contienen y añadir polibreno (8 mg / ml). placas de giro a 30 ° C durante 90 minutos a 1.500 xg entonces vuelven a la placa de cultivo de tejidos incubadora durante la noche. </li><li> suspensión celular pipeta en tubos cónicos y se centrifuga a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg, no descartan la placa. Resuspender las células en 2 ml 2x fresco cóctel antes de la estimulación por pozo y volver a los pozos originales. </li&gt; <li> Realizar una espinoculación 2º repitiendo los pasos 3.7-3.9. </li></ol> 4. Las células trasplante de donante en ratones receptores <ol><li> Preparar los ratones receptores singénicos para el trasplante con dosis de irradiación corporal total letal &lt;24 h antes de la inyección de células BM. NOTA: la irradiación Dosis letal para los ratones Balb / c es típicamente 800-900 cGy y 1.000-1.200 cGy para C57B / 6 10. La dosis normalmente se divide en dos sesiones de irradiación espaciadas al menos 3-4 horas de diferencia. </li><li> Continuación de la etapa 3.11, las células del donante transducidas cosecha de las placas de 6 pocillos pipeteando suavemente sobrenadante en tubos cónicos. Lavar cada pocillo con 1 ml de PBS para recoger las células residuales y añadir a 50 ml tubos cónicos. </li><li> Añadir 0,5 ml de tripsina al 0,05% a los pocillos y se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos de 5 min. </li><li> Añadir 1 ml de D10 pozos y retire cualquier resto de las células por pipeteo suave. Añadir células al tubo respectivos de la etapa 4.2 y pellet por centrifugación a 4 ° C durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Lavar las células con PBS y centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 400 x g. Volver a suspender en 5 ml de PBS y contar las células usando un hemocitómetro por exclusión de azul de tripano. NOTA: Si el vector tiene una etiqueta GFP entonces cuantificar el porcentaje de células positivas para GFP con un citómetro de flujo. </li><li> Resuspender 5 x 10 5 - 2 x 10 6 células en 50 - 100 l de PBS para inyección en ratones. </li><li> Inyectar células mediante inyección retro-orbital en ratones anestesiados utilizando un 27 G x ½ &quot;aguja estéril. NOTA: Otras técnicas incluyen la inyección de cola vena, esplénica, o femoral. <ol><li> Anestesiar ratón utilizando isoflurano y una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta. </li><li> Coloque el ratón sobre su lado y restringir utilizando tanto el pulgar y el índice tal que el ojo sobresale ligeramente de la cabeza. </li><li> Con el bisel hacia arriba, inserte el nEedle lateral al canto medial en un ángulo de 45 °. NOTA: Si esta técnica se realiza correctamente, el ojo debe retraerse ligeramente y sin resistencia, deben ser sentidas tras la inserción de la aguja. </li><li> Examine el ratón para detectar cualquier signo de daño tales como inflamación o sangrado. NOTA: los ratones después de un trasplante tendrán recuentos sanguíneos bajos durante un número de semanas y por lo tanto son susceptibles a la infección. La profilaxis con antibióticos o el uso de agua acidificada puede ser utilizado. </li></ol></li><li> Un mes después del trasplante, medir la GFP% en la sangre periférica como un indicador de las células del donante injertadas por citometría de flujo. NOTA: GFP sola no puede determinar el éxito de injerto de las células. La transducción viral puede haber fallado sin embargo, el injerto puede haber ocurrido. En este caso, se detectaron células GFP +, pero el injerto de las células trasplantadas se ha realizado correctamente. <ol><li> Tomar 10 l de sangre periférica by punción de la vena safena de la pierna con un 21 G 1 ½ &quot;x jeringa y añadirlo a EDTA 100 mM en PBS para evitar la coagulación. </li><li> Añadir 1 ml ACK a la sangre y se lisan en hielo durante 10 min. Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante en un matraz de vacío y se añade 1 ml de PBS suplementado con 2% de FBS para detener la lisis. Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante en un matraz de vacío y pellet se resuspende en 100 l de PBS suplementado con 2% de FBS. </li><li> Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo y recoger 300.000 eventos dentro de la puerta de células vivas (determinado por FSC frente a SSC) y calcular el porcentaje de GFP y GFP + - células 9. </li></ol></li><li> Adicionalmente a 1 mes después del trasplante, realizar recuentos sanguíneos completos (CBC) utilizando un analizador de hematología veterinaria automatizado 18 para controlar la progresión de la enfermedad. NOTA: Continúe controlando la enfermedad por%GFP en sangre periférica y CBC mensual. </li><li> Para terminar el experimento, anestesiar ratón utilizando isoflurano y una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta. Sacrificio ratón por dislocación cervical y el bazo y la médula ósea de la cosecha para histopatología. NOTA: La duración del experimento es subjetiva y la fecha de terminación debe ser evaluada en base al fenotipo de la enfermedad se esperaba. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo llevar a cabo trasplantes de médula ósea en ratones recapitular una enfermedad esencial trombocitemia-como con la progresión de la mielofibrosis con CALRdel52 mutación como el conductor de la enfermedad. el éxito del trasplante de células que expresan los resultados CALRdel52 en un aumento de las plaquetas, la expansión de megacariocitos, y fibrosis de la médula ósea. A medida que el trasplante de médula ósea es un proceso de varios pasos, es importante recono...

Transducción-trasplante es un método útil para modelar neoplasias hematológicas en ratones. Esta técnica ha sido particularmente valiosa para el estudio de las neoplasias mieloides que se remontan a la primera demostración de que la expresión ectópica de BCR-ABL1 podría recapitular fielmente la leucemia mielógena crónica en ratones 1. Esta técnica ha facilitado posteriormente el amplio estudio de JAK2 V617F y MPL W515K / L mutado neoplasias mieloproliferativas (MPN). NMP son un grupo de neoplasias malignas hematológicas caracterizadas por la sobreproducción de células mieloides maduras y fibrosis de la médula ósea. Estas enfermedades generalmente surgen de la expansión clonal de una célula madre hematopoyética que ha adquirido una mutación somática en cualquiera Jak2, MPL, o CALR. Transducción-trasplante de JAK2 V617F y MPL W515K modelos / L presentan las características clínicas de la policitemia vera y mielofibrosis 2 - 5 &lt;/ Sup&gt;. Recientemente, un modelo de ratón de la MPN calreticulin mutado también ha sido generado con el método de la transducción-trasplante 6. Estos ratones desarrollan una enfermedad esencial trombocitemia-como con el aumento de las plaquetas, aumento del número de megacariocitos, y fibrosis de médula ósea. En conjunto, estos modelos no sólo han proporcionado la oportunidad de conocer mejor la patogénesis molecular del MPN, sino también la capacidad para desarrollar y estudiar la terapéutica en un entorno preclínico. Este manuscrito ofrece una descripción detallada de la metodología de la transducción-trasplante con un enfoque en la mutación CALRdel52. Esta técnica implica el trasplante de células de médula ósea transducidas con retrovirus que expresan el mutante constructo en ratones receptores singénicos irradiados.

<table><tbody><tr><td><Líneas celulares fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>células 3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plásmidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, también conocido como pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>Las líneas celulares de empaquetamiento retroviral, como EcoPack 2-293, se pueden usar en lugar del plásmido EcoPak y las células 293T estándar. Hay disponibles plásmidos adicionales de envoltura y empaquetamiento de &gamma;-retrovirus en Addgene y otros.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene</td><td></td> <td>20672</td> Hay <td>disponibles plásmidos de transferencia &gamma;-retroviral adicionales de Addgene y otros.</td></tr><tr><td><fuerte>Consumibles</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2" agujas</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina/L-glutamina</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>Puede ser PBS casero</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Platos de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>platos de 60 mm</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher NC9840454</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181; Fisher</td><td></td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filtros de jeringa</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Se puede hacer en casa</td></tr><tr><td>Recombinante murino IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante murino IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Murino recombinante SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td></td><td>6365809001 Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiador</td><td></td><td></td><td></td> de rayos X</tr></tbody></table>

transducción-trasplante modelo de ratón de neoplasias mieloproliferativas

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

La transducción-trasplante es una forma rápida y eficiente de modelar neoplasias hematológicas humanas en ratones. Esta técnica da como resultado la expresión del gen de interés en las células hematopoyéticas y se puede utilizar para estudiar el papel del gen en la hematopoyesis normal y/o maligna. Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo realizar la transducción-trasplante utilizando mutaciones de calreticulina (CALR) identificadas recientemente en la neoplasia mieloproliferativa (NMP) como ejemplo. En este protocolo, las células de médula ósea completa de ratones donantes tratados con 5-flurouracil (5-FU) se transducen con un retrovirus que codifica CALR mutante y se trasplantan a huéspedes singénicos irradiados letalmente. Las células del donante que expresan CALR mutante se marcan con proteína fluorescente verde (GFP). Los ratones trasplantados desarrollan un fenotipo MPN que incluye plaquetas elevadas en la sangre periférica, expansión de megacariocitos en la médula ósea y fibrosis de la médula ósea. Proporcionamos una descripción paso a paso de cómo generar retrovirus, calcular el título viral, transducir células de médula ósea completa y trasplantarlas a ratones receptores irradiados.

La técnica de transducción-trasplante resulta en la reconstitución hematopoyética de los ratones receptores con células que expresan el gen de interés. La Figura 1 muestra una visión general del modelo de ratón de transducción-trasplante de calreticulin mutado MPN. Brevemente, retrovirus que expresan CALRwt o CALRdel52 se utiliza para infectar las células BM a partir de un ratón donante C57B / 6. Las células transducidas se trasplantan en irradiado C57B / 6 ratón recepto...

Este manuscrito proporciona una descripción de la metodología utilizada para establecer modelos de ratón de transducción-trasplante. Se da cuenta detallada de los errores técnicos que se deben evitar al realizar trasplantes de médula ósea. Se debe obtener una comprensión clara de la importancia del título viral alto, la transfección/transducción y la irradiación.

Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

El objetivo general de este procedimiento es generar ratones que expresen el gen de interés en células hematopoyéticas utilizando el método de transducción-trasplante. En un corto período de tiempo, este método puede ayudar a determinar si su gen de interés induce una malignidad hematológica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de malignidades hematológicas, debido al desarrollo acelerado de modelos murinos que permiten probar terapéuticos putativos.Aunque este método puede proporcionar información sobre la malignidad hematológica, también se puede utilizar para estudiar el papel de un gen de interés en la hematopoyesis normal. Por lo general, las personas nuevas en este experimento tendrán dificultades, ya que requiere múltiples pasos. Además, la generación de un virus de alto título es fundamental para el éxito de este experimento.La demostración visual de este procedimiento es importante, ya que trabajar con ratones puede ser difícil y requiere práctica. Después de anestesiar un ratón y verificar la profundidad de la anestesia según el protocolo descrito, coloque al ratón de lado y, utilizando el pulgar y el dedo índice, sujételo de forma que el ojo sobresalga ligeramente de la cabeza. Para inyectar 150 miligramos por kilogramo de 5-fluorouracilo, o 5-FU, mediante una inyección retroorbital, inserte una aguja de media pulgada y calibre 27 a un ángulo de 45 grados con el bisel hacia arriba en dirección medial, y deténgase cuando la aguja esté insertada hasta la mitad.Inyecte lentamente la solución y luego retire cuidadosamente la aguja. Examine al ratón en busca de signos de lesión, como hinchazón o sangrado, y asegúrese de que el animal se recupere y comience a caminar. Cinco días después, tras sacrificar al animal según el protocolo descrito, utilice etanol al 70 % para esterilizar al ratón rociando abundantemente hasta que el pelaje quede húmedo.Con tijeras de disección, haga una incisión en la piel y separe la fascia de los músculos de la pata. A continuación, seccione la pata del ratón cortando el fémur a nivel de la cadera y la tibia a nivel del tobillo. Doble la pata en forma de L y use las tijeras de disección para separar cada hueso de la pata cortando en la articulación de la rodilla.Luego, raspe suavemente el músculo hacia un extremo del hueso de la pata hasta que el cartílago se desenganche. A continuación, utilizando una jeringa con una aguja de media pulgada y calibre 27, en PBS suplementado con 2 % de FBS, lave cada hueso de la pata sobre una membrana de nailon de 100 micrómetros hacia un tubo cónico de 50 mililitros, hasta que el hueso se vuelva blanco, para maximizar la cantidad de células recolectadas. Con el émbolo de una jeringa, presione las células a través de la membrana de nailon hacia el tubo cónico de 50 mililitros para obtener una suspensión de células individuales.Repita con la otra pata del ratón. Centrifugue las células recolectadas a 400 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos y deseche el sobrenadante. Luego, agregue cinco mililitros de cloruro amónico potásico, o ACK, para resuspender la médula ósea.Incube la suspensión celular en hielo durante 10 minutos para lisar los glóbulos rojos. Para detener la lisis, use PBS para llenar el tubo. Luego, centrifugue nuevamente las células y deseche el sobrenadante.Re-suspenda las células con cinco mililitros de PBS y cuéntelas mediante un hemocitómetro utilizando la exclusión con azul de tripano. A continuación, añada el cóctel pre-stem 2x para re-suspender las células a una concentración de dos veces 10 a la sexta células por mililitro. Luego, plaque dos mililitros en los pocillos de placas de seis pocillos.Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante la noche. Después de la incubación, agregue dos mililitros de sobrenadante viral a cada pocillo, seguido de ocho microgramos por mililitro de polibreno. Centrifugue las placas a 1500 × g a 30 grados Celsius durante 90 minutos.Luego, devuelva las placas al incubador durante la noche. Pipetee la suspensión celular en tubos cónicos y centrifugue a 400 veces g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Utilice el cóctel pre-stem 2x por pocillo para resuspender las células y vuelva a sembrarlas en los pocillos originales.Después de preparar los ratones receptores para el trasplante según el protocolo descrito, recolecte las células donadoras transducidas de las placas de seis pocillos mediante pipeteo suave del sobrenadante hacia tubos cónicos. Utilice un mililitro de PBS para lavar cada pocillo y recoja las células residuales en los tubos. Añada 0,5 mililitros de tripsina al 0,05 % a los pocillos e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos.A continuación, agregue un mililitro de D-10 a los pocillos y desprenda las células restantes pipeteando suavemente. Luego, agregue las células a los tubos respectivos y centrifugue a 400 ×g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Lave las células nuevamente con PBS.Luego, después de centrifugar, use cinco mililitros de PBS para resuspender las células y cuéntelas mediante la exclusión con azul de tripano y un hemocitómetro. Para la inyección en ratones, resuspenda cinco veces 10 a la quinta hasta dos veces 10 a la sexta células en 50 a 100 microlitros de PBS. Coloque al ratón de lado y sujételo utilizando el pulgar y el dedo índice, de modo que el ojo sobresalga ligeramente de la cabeza.Con el bisel hacia arriba, inserte la aguja lateral al canto medial en un ángulo de 45 grados e inyecte. Tras la inyección, examine al ratón en busca de signos de lesión, como hinchazón o sangrado, en el sitio de inyección, y consulte el protocolo escrito para obtener indicaciones adicionales sobre los cuidados posteriores a la inyección. Finalmente, analice la expresión de GFP en sangre, según lo indicado en el protocolo escrito.Esta figura ilustra cómo calcular la titulación viral relativa, donde el porcentaje de GFP se calcula a partir de los eventos recopilados del compartimento de células viables. Aquí se muestra una titulación con más de una partícula viral por célula, y estas muestras representan titulaciones con una sola partícula viral por célula. Idealmente, se detectaría al menos el 50 % de células GFP-positivas con una dilución de uno a 30 del sobrenadante viral.En este experimento, se presenta un receptor de trasplante exitoso en el que los ratones CALRdel52 exhiben un fenotipo de MPN con plaquetas aumentadas, megacariocitos incrementados en la médula ósea y fibrosis de la médula ósea. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en ocho días, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante seguir cada paso del protocolo.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran los efectos de genes específicos en la hematopoyesis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir ratones que expresen su gen de interés en células hematopoyéticas.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video muestra la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped intestinal, EICH, en un ratón receptor irradiado letalmente utilizando células madre hematopoyéticas alogénicas y linfocitos T aloreactivos esplénicos inductores de EICH. Este protocolo ayuda a establecer un modelo de EICH intestinal aguda grave para comprender el mecanismo de la enfermedad y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras.

Inducción de la enfermedad de injerto contra huésped en modelos de ratón mediante trasplante alogénico de médula ósea y células esplénicas

Presentamos un protocolo rápido y flexible para un sistema de expresión in vivo basado en un solo receptor de células T (TCR) retroviral.  Los vectores retrovirales se utilizan para transducir células progenitoras de la médula ósea con el fin de estudiar el desarrollo y la función de las células T in vivo como alternativa a los ratones transgénicos TCR.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

La enfermedad de injerto contra huésped es una complicación importante después del trasplante alogénico de médula ósea. Las células dendríticas desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad del injerto contra el huésped. El artículo actual describe una nueva plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped y el efecto injerto-contra-leucemia.

Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

Describimos el trasplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurales humanas transducidas con un vector informador dual que expresa la proteína fluorescente verde luciferasa (GFP) en el cerebro del ratón. Después del trasplante, la señal de luciferasa se mide repetidamente utilizando bioluminiscencia in vivo y células injertadas que expresan GFP identificadas en secciones cerebrales mediante microscopía de fluorescencia.

Trasplante intracerebral y seguimiento de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas en el cerebro de ratón

Este protocolo describe el aislamiento de timocitos doble negativos del timo de ratón seguido de transducción retroviral y cocultivo en el sistema de cocultivo de líneas celulares del estroma del estroma de médula ósea que expresa 4 en forma delta (OP9-DL4) para un análisis funcional adicional.

Cocultivo y transducción de timocitos murinos en células estromales que expresan 4 similares a Delta para estudiar oncogenes en leucemia de células T

Aquí, la inyección intraperitoneal de células leucémicas se utiliza para establecer y propagar la leucemia mieloide aguda (LMA) en ratones. Este nuevo método es eficaz en el trasplante seriado de células de LMA y puede servir como una alternativa para aquellos que pueden experimentar dificultades e inconsistencias con la inyección intravenosa en ratones.

Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo murino reproducible de glioma de médula espinal mediante la inyección de células tumorales en el espacio intervertebral, ofreciendo un enfoque más eficaz y menos invasivo para la investigación y el desarrollo terapéutico.

Trasplante quirúrgico de células tumorales en la médula espinal de ratones

El protocolo tiene como objetivo describir un modelo de ratón para generar recaídas de leucemia linfoblástica aguda, basado en la dinámica de la respuesta a la quimioterapia de inducción.

Modelo murino de leucemia Recaída a quimioterapia de inducción para la leucemia linfoblástica aguda

Aprende el método de transducción-trasplante para generar modelos murinos con genes específicos en células hematopoyéticas. Esta técnica permite estudiar neoplasias mieloproliferativas y hematopoyesis normal en ratones.

Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas

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