La medición de la rigidez de Ex Vivo Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos para utilizar la microscopía de fuerza atómica para medir el módulo elástico ex vivo de las aortas de ratón. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biomecánica vascular y las enfermedades, como las enfermedades cardiovasculares y el envejecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que el AFM caracteriza las propiedades biomecánicas de muestras biológicas blandas como arterias y células con un gran grado de precisión a niveles de Danoescala.

Presentaré los procedimientos de AFM, y el doctor Shu-lin Liu, investigador asociado de nuestro laboratorio, mostrará cómo aislar las aortas de los ratones. Para comenzar, eutanasia a un ratón y diseccionarlo hasta la aorta como se describe en el protocolo de texto adjunto. Con un par de pinzas pequeñas, agarre la grasa que rodea la aorta y use un par de tijeras pequeñas para cortar con cuidado la grasa que se encuentra alrededor de la aorta.

A continuación, agarre suavemente la aorta con pinzas y haga un corte a través del vaso al comienzo de la aorta ascendente y otro corte al final de la aorta descendente, justo por encima de la aorta abdominal. Transfiera la aorta disecada a un plato de 60 milímetros que contenga PBS sin calcio ni magnesio. En el plato, continúe diseccionando cualquier resto de tejido graso de la aorta y luego abra la aorta longitudinalmente.

A continuación, corte una pieza de 2 milímetros por 4 milímetros de la aorta descendente y una pieza del mismo tamaño del arco aórtico, para su análisis con el microscopio de fuerza atómica. Coloque estos trozos de pañuelo en un plato de plástico nuevo de 60 milímetros y manténgalos húmedos en una gota de PBS. Retire con cuidado el PBS de alrededor del tejido con una toallita de laboratorio sin tocar la aorta.

Asegúrese de que el lado luminal del tejido esté hacia arriba y use de cinco a 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato para pegar suavemente cada extremo de la aorta abierta a la placa. Es fundamental que la aorta no se estire durante este proceso. Al terminar, compruebe que la aorta pegada no esté doblada ni flotante.

Después de secar al aire el pegamento en la aorta durante 30 a 60 segundos, agregue suavemente PBS y sumerja la muestra. Con unas pinzas, deslice una sonda AFM de nitrato de silicona con una punta esférica sobre el soporte de la sonda. A continuación, fije firmemente el soporte de la sonda a la montura ZScanner del cabezal AFM.

A continuación, abra el software AFM. Para elegir el tipo de experimento, vaya a la Categoría de experimento y seleccione Modo de contacto. Luego, ve a Grupo de Experimento y selecciona Modo de Contacto en Fluid, y finalmente ve a Experimento y selecciona Modo de Contacto en Fluid.

Una vez seleccionados, haga clic en Cargar experimento. Esto encenderá el láser. A continuación, prepare una muestra utilizada para alinear el láser como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Coloque la muestra en el AFM. Coloque el punto láser en la punta de la sonda AFM, ajustando las perillas de posicionamiento láser. Luego, use las perillas de posicionamiento del detector para ajustar la posición del fotodiodo hasta que los valores de la deflexión vertical estén entre cero y menos un voltio, y la deflexión horizontal esté cerca de cero voltios.

A continuación, compruebe que la señal de suma del láser esté maximizada. Si es necesario, reajuste la posición del rayo láser en la punta del AFM y la posición del fotodiodo para obtener la señal de suma máxima. Para comenzar la calibración, seleccione comprobar parámetros y establezca el parámetro Tamaño de escaneo en cero.

Establezca la velocidad de escaneo en un hercio. Establezca la Muestra/Línea en 256 y el Punto de ajuste de Deflexión en 20 nanómetros. A continuación, seleccione Participar.

Una vez que la sonda haga contacto con la superficie de la placa, haga clic en Rampa. A continuación, seleccione el modo expandido en el menú de la barra de herramientas de escaneo y configure los parámetros como se muestra aquí. En la barra de herramientas de rampa, seleccione rampa continua y obtenga una curva de fuerza en la placa.

En esta curva de fuerza, establezca el Canal 1 en Error de deflexión para permitir que el software grafíe los resultados como deflexión vertical frente a la posición Z. Haga clic en los extremos izquierdo o derecho de la curva de fuerza y arrastre el cursor para abarcar una región lineal de la curva de fuerza que se ajustará a la línea recta. A continuación, seleccione Rampa en la barra de herramientas y haga clic en Actualizar sensibilidad.

Registre el valor actual. A continuación, seleccione Calibrar y haga clic en Detector. Entrada y valor promedio de las cinco mediciones en el cuadro Sensibilidad a la deflexión.

Haga clic en Retirar dos o tres veces para levantar la cabeza del AFM y evitar la interacción entre la punta del AFM y la placa durante el proceso de ajuste térmico. A continuación, haz clic en Thermal Tune en la barra de herramientas. Establezca el rango de ajuste térmico entre uno y 100 kilohercios, y establezca la corrección de sensibilidad a la deflexión en 1,144 para voladizos en forma de V y 1,166 para voladizos rectangulares.

En el menú Ajuste térmico, haga clic en Adquirir datos para obtener una curva de ajuste térmico. A continuación, coloque un guión rojo en las líneas a ambos lados de la curva y seleccione el modelo de oscilador armónico simple o el modelo de oscilador armónico simple, según el que mejor se ajuste a los datos. A continuación, haga clic en Ajustar datos y seleccione Calcular muelle K para guardar este valor.

Coloque una placa de cultivo de 60 milímetros que contenga el tejido aórtico en la platina del microscopio y asegure la placa con el soporte magnético de la placa. Una vez que la aorta esté enganchada con el voladizo, asegúrese de que el centro piezoeléctrico esté estable y haga clic en Rampa. Establezca el tamaño de la rampa en tres micrómetros, el modo de disparo en relativo y el umbral de activación en 100 nanómetros.

A continuación, seleccione rampa continua. Observe que el punto de contacto entre la sonda y la muestra se produce aproximadamente en el centro de los tres cuartos inferiores del ciclo de rampa Z. Si esto no se observa, desconéctese de la muestra, ajuste el tamaño de la rampa según sea necesario y vuelva a conectar la muestra.

A continuación, haga clic en Microscopio en la barra de menú y seleccione Configuración de Engage. Cambie el retiro de SPM a 30 micrómetros, luego haga clic en Aceptar. Después de observar la curva de fuerza, haga clic en Capturar en la barra de menú y seleccione Capturar nombre de archivo. Ingrese el nombre de archivo que desee que termine en OOO, seleccione una carpeta designada y guarde los datos.

Para comenzar el análisis, abra el software de análisis de curva de fuerza, cargue el archivo que se va a analizar y modifique y suavice los datos como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, seleccione Corrección de línea base en la barra de menú y configure las entradas como se muestra aquí. A continuación, ajuste la línea azul punteada vertical en el gráfico para abarcar la parte plana de la curva de fuerza y haga clic en Ejecutar.

A continuación, haga clic en Sangría en el menú de la barra de herramientas y configure las entradas como se muestra aquí. Guarde estos valores y analice el módulo de Young de cada una de las áreas de interés midiendo cinco curvas de fuerza por área que se toman a una pequeña distancia entre sí. Para determinar la rigidez general de la muestra de tejido, se deben tomar hasta 25 mediciones en cinco regiones diferentes del área de la muestra dentro del tejido.

Estas áreas se pueden usar para comparar tejido en diferentes ubicaciones, como el arco aórtico y la aorta descendente. En estos gráficos, se muestran curvas de fuerza representativas de la aorta descendente y el arco aórtico de la misma muestra de aorta de ratón. Sobre la base de estos datos, se puede calcular el módulo elástico para cada grupo y utilizarlo para comparar entre diferentes regiones o condiciones.

Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo aislar correctamente la aorta del ratón y medir el módulo elástico mediante microscopía de fuerza atómica. Después de intentar este procedimiento, es importante recordar realizar la medición de AFM inmediatamente después del aislamiento del tejido. Una vez dominado, el aislamiento de las aortas puede completarse en aproximadamente 45 minutos por ratón, y la medición y el análisis de la AFM pueden completarse en una hora y media, si se realiza correctamente.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunofluorescecencia o los ensayos de proliferación, para responder a preguntas adicionales relacionadas con el remodelado vascular o la proliferación de células del músculo liso vascular.