Name: La medición de la rigidez de Ex Vivo Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a medir el módulo elástico de aortas de ratón ex vivo mediante microscopía de fuerza atómica. Este protocolo permite caracterizar propiedades biomecánicas vasculares con precisión nanométrica para investigar enfermedades cardiovasculares.

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AFM se realizó en instrumentación respaldada por el Instituto del Músculo de Pensilvania y el Instituto de Medicina y Terapéutica Traslacional de la Escuela de Medicina Perelman, la Universidad de Pensilvania. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH HL62250 y AG047373. YHB contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón.

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<li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness%3A+methodological+issues+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

AFM indentación puede ser utilizado para caracterizar la rigidez (módulo elástico) de las células y tejidos. En este trabajo, ofrecemos protocolos detallados paso a paso para aislar la aorta descendente y arco aórtico en el ratón y determinar los módulos de elasticidad de estas regiones arteriales ex vivo. Ahora tenemos resumir y discutir las cuestiones técnicas y las limitaciones del método descrito en este documento. Varios problemas técnicos pueden surgir en el aislamiento y el a...

Las propiedades biomecánicas de las arterias son un determinante crítico en las enfermedades cardiovasculares (ECV) y el envejecimiento. La rigidez arterial, un importante factor de riesgo independiente del colesterol y un indicador de la progresión de la ECV, aumenta con la lesión vascular, la aterosclerosis, la edad y la diabetes1-8. El endurecimiento de la pared arterial se asocia con un aumento de la desdiferenciación, migración y proliferación de las células del músculo liso vascular9-12. Además, el aumento de la rigidez arterial se ha relacionado con una mayor adhesión de macrófagos1, permeabilidad endotelial y transmigración de leucocitos13, y remodelación de la pared de los vasos14,15. Por lo tanto, las terapias que podrían prevenir el endurecimiento arterial en las ECV o el envejecimiento podrían complementar las intervenciones farmacológicas actualmente disponibles para tratar las ECV al reducir el colesterol alto en la sangre. 
AFM es una poderosa herramienta analítica utilizada para diversas aplicaciones físicas y biológicas. La AFM se utiliza cada vez más para obtener imágenes de alta resolución y caracterizar las propiedades biomecánicas de muestras biológicas blandas como tejidos y células1,2,10,16,17 con un gran grado de precisión a nivel nanométrico. Una gran ventaja de la MFA es el hecho de que se puede utilizar con células vivas.
Este artículo describe nuestro método para medir el módulo elástico de las arterias de ratón ex vivo utilizando AFM. El método descrito muestra cómo 1) aislamos correctamente las arterias de ratón (aorta descendente y arco aórtico) y 2) medimos el módulo elástico de estos tejidos mediante AFM. Las mediciones de los módulos elásticos descargados en las arterias pueden ayudar a dilucidar los cambios en la matriz extracelular (MEC) que se producen en respuesta a una lesión vascular, una ECV y el envejecimiento.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst, sistema AFM</td>, <td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Nikon Eclipse TE 200, microscopio invertido,</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, sonda AFM de nitruro de silicio</td>, <td>Novascan Technologies</td><td>, PT. SI02. SN.1</td><td>0,06 N/m voladizo; 1 y micro; m SiO2 partícula</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Ver sección 1.4</td></tr><tr><td>Pinzas de #5SF Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Ver sección 1.8</td></tr><tr><td>Tijeras finas-ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Ver sección 1.4 (tamaño mediano)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Tijeras de resorte Bingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>Ver sección 1.6 (tamaño pequeño)</td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultivo celular tratada con TC</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Sin calcio ni magnesio</td></tr><tr><td>Krazy Glue líquido instantáneo para todo uso</td><td>Krazy Glue</td><td>KG58548R</td><td>Ver sección 2.2</td></tr><tr><td>Puntas de carga de gel, 1 - 200 y micro; l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>Ver sección 2.2</td></tr><tr><td>Pinzas de punta</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>78092-CP</td><td>Ver sección 3.2</td></tr><tr><td>Platos de 50 mm, con fondo de vidrio de pared transparente</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>Ver sección 4.4</td></tr></tbody></table>

la medición de la rigidez de<em&gt; ex vivo</em&gt; ratón aortas usando microscopía de fuerza atómica

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

la rigidez arterial es un importante factor de riesgo y biomarcadores para la enfermedad cardiovascular y un sello de envejecimiento. Microscopía de fuerza atómica (AFM) es una herramienta analítica versátil para la caracterización de propiedades mecánicas viscoelásticas para una variedad de materiales que van desde el disco (plástico, vidrio, metal, etc.) las superficies a las células sobre cualquier sustrato. Ha sido ampliamente utilizado para medir la rigidez de las células, sino que se utiliza con menos frecuencia para medir la rigidez de aortas. En este artículo, vamos a describir los procedimientos para el uso de AFM en modo de contacto para medir el módulo elástico ex vivo de las arterias de ratones sin carga. Describimos nuestro procedimiento para el aislamiento de las aortas de ratón y, a continuación ofrecemos información detallada para el análisis AFM. Esto incluye instrucciones paso a paso para la alineación del haz de láser, la calibración de la constante de elasticidad y sensibilidad de desviación de la sonda de AFM, y la adquisición de curvas de fuerza. También proporcionamos un protocolo detallado para Analy datossis de las curvas de fuerza.

<html> La Figura 5A muestra una imagen de contraste de fase de la aorta descendente (torácica) de un 6-meses de edad, macho C57BL / 6 de ratón. El voladizo AFM está en su lugar directamente sobre el tejido y listo para el sangrado. Figuras 5B y 5C muestran curvas de fuerza representativos obtenidos por AFM indentación en el modo de contacto. Las líneas verdes se muestran en las figuras 5B y 5C representan las mejores curvas de ajuste obt...

Presentamos protocolos detallados para el aislamiento de aortas de ratones y la medición de su módulo elástico utilizando microscopía de fuerza atómica.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos para utilizar la microscopía de fuerza atómica con el fin de medir el módulo elástico ex vivo de aortas de ratón. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biomecánica vascular y las enfermedades, como las enfermedades cardiovasculares y el envejecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que la MFA caracteriza las propiedades biomecánicas de muestras biológicas blandas, tales como arterias y células, con un alto grado de precisión a niveles nanoscópicos.Presentaré los procedimientos de microscopía de fuerza atómica (AFM), y el Doctor Shu-lin Liu, investigador asociado de nuestro laboratorio, mostrará cómo aislar aortas de ratón. Para comenzar, se debe sacrificar un ratón y diseccionarlo hasta obtener la aorta, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Usando un par de pinzas pequeñas, sujete la grasa que rodea la aorta y utilice un par de tijeras pequeñas para cortar cuidadosamente la grasa que se encuentra alrededor de la aorta.A continuación, tome suavemente la aorta con pinzas y haga un corte a través del vaso al comienzo de la aorta ascendente y otro corte al final de la aorta descendente, justo por encima de la aorta abdominal. Transfiera la aorta diseccionada a una placa de 60 milímetros que contenga PBS sin calcio ni magnesio. En la placa, continúe eliminando cualquier tejido adiposo residual de la aorta y luego abra la aorta longitudinalmente.A continuación, corte un fragmento de 2 milímetros por 4 milímetros de la aorta descendente y otro fragmento del mismo tamaño del arco aórtico, para su análisis mediante el microscopio de fuerza atómica. Coloque estos fragmentos de tejido en una nueva placa de plástico de 60 milímetros y manténgalos húmedos en una gota de PBS. Retire cuidadosamente el PBS alrededor del tejido utilizando una toallita de laboratorio sin tocar la aorta.Asegúrese de que el lado luminal del tejido esté orientado hacia arriba, y utilice de cinco a diez microlitros de adhesivo de cianoacrilato para pegar suavemente cada extremo de la aorta abierta a la placa. Es fundamental que la aorta no se estire durante este proceso. Una vez finalizado, verifique que la aorta pegada no esté doblada ni flotando.Después de dejar secar al aire el pegamento sobre la aorta durante 30 a 60 segundos, agregue PBS suavemente y sumerja la muestra. Utilizando pinzas, deslice una sonda de AFM de nitrato de silicona con punta esférica sobre el soporte de la sonda. A continuación, asegure firmemente el soporte de la sonda al montaje ZScanner de la cabeza del AFM.A continuación, abra el software del microscopio de fuerza atómica (AFM). Elija el tipo de experimento yendo a la categoría de experimento y seleccionando el modo de contacto. Luego, vaya al grupo de experimento y seleccione el modo de contacto en fluido, y finalmente vaya al experimento y seleccione el modo de contacto en fluido.Una vez seleccionados, haga clic en Cargar experimento. Esto encenderá el láser. A continuación, prepare una muestra utilizada para alinear el láser, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto.Coloque la muestra sobre el microscopio de fuerza atómica (AFM). Posicione el punto láser sobre la punta de la sonda del AFM ajustando los mandos de posicionamiento del láser. Luego, utilice los mandos de posicionamiento del detector para ajustar la posición del fotodiodo hasta que los valores de Desviación Vertical estén entre cero y menos un voltio, y la Desviación Horizontal esté cercana a cero voltios.A continuación, verifique que la señal de suma del láser esté maximizada. Si es necesario, vuelva a ajustar la posición del haz de láser sobre la punta del microscopio de fuerza atómica (AFM) y la posición del fotodiodo para obtener la señal de suma máxima. Para comenzar la calibración, seleccione verificar parámetros y establezca el parámetro de tamaño de escaneo en cero.Establezca la velocidad de barrido en un hercio. Establezca la muestra/línea en 256 y el punto de consigna de desviación en 20 nanómetros. A continuación, seleccione Acoplar.Una vez que la sonda haga contacto con la superficie de la placa, haga clic en Ramp. A continuación, seleccione el modo expandido en el menú de la barra de escaneo y configure los parámetros como se muestra aquí. En la barra de herramientas de rampa, seleccione ramp continuus y obtenga una curva de fuerza en la placa.En esta curva de fuerza, configure el Canal 1 en Error de Deflexión para permitir que el software grafique los resultados como deflexión vertical versus posición Z. Haga clic en los extremos izquierdo o derecho de la curva de fuerza y arrastre el cursor para abarcar una región lineal de la curva de fuerza que será ajustada con una línea recta. Luego, seleccione Rampa en la barra de herramientas y haga clic en Actualizar Sensibilidad.Registre el valor actual. A continuación, seleccione Calibrar y haga clic en Detector. Introduzca y promedie el valor de las cinco mediciones en el cuadro Sensibilidad de Desviación.Haga clic en Retraer dos o tres veces para elevar la cabeza del microscopio de fuerza atómica (AFM) y evitar la interacción entre la punta del AFM y la placa durante el proceso de calibración térmica. Luego, haga clic en Calibración térmica en la barra de herramientas. Establezca el rango de calibración térmica entre uno y 100 kilohercios, y configure la corrección de sensibilidad de deflexión en 1,144 para los cantiléver en forma de V y en 1,166 para los cantiléver rectangulares.En el menú Ajuste Térmico, haga clic en Adquirir Datos para obtener una curva de ajuste térmico. A continuación, coloque líneas con trazos rojos a ambos lados de la curva y seleccione el modelo Lorentziano o el del oscilador armónico simple, según cuál se ajuste mejor a los datos. Luego, haga clic en Ajustar Datos y seleccione Calcular K del Resorte para guardar este valor.Coloque un plato de cultivo de 60 milímetros que contenga el tejido aórtico sobre la platina del microscopio y asegure el plato con el soporte magnético. Una vez que la aorta esté enganchada al cantiléver, asegúrese de que el centro del piezo sea estable y haga clic en Rampa. Establezca el tamaño de la Rampa en tres micrómetros, el modo de Disparo en Relativo y el umbral de Disparo en 100 nanómetros.Luego, seleccione rampa continua. Observe que el punto de contacto entre la sonda y la muestra ocurre aproximadamente en la mitad central hasta los tres cuartos inferiores del ciclo de rampa en Z. Si esto no se observa, desacople de la muestra, ajuste el tamaño de la rampa según sea necesario y vuelva a acoplar la muestra.A continuación, haga clic en Microscopio en la barra de menú y seleccione Configuración de activación. Cambie la retracción del MSP a 30 micrómetros y luego haga clic en Aceptar. Después de observar la curva de fuerza, haga clic en Capturar en la barra de menú y seleccione Nombre de archivo de captura. Ingrese un nombre de archivo deseado que finalice con OOO, seleccione una carpeta designada y guarde los datos.Para comenzar el análisis, abra el software de análisis de curvas de fuerza, cargue el archivo que se va a analizar y modifique y suavice los datos según se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, seleccione Corrección de línea base en la barra de menú y configure las entradas como se muestra aquí. Luego, ajuste la línea vertical punteada azul en la gráfica para abarcar la porción plana de la curva de fuerza y haga clic en Ejecutar.A continuación, haga clic en Sangría en el menú de la barra de herramientas y configure las entradas como se muestra aquí. Guarde estos valores y analice el módulo de Young de cada una de las áreas de interés midiendo cinco curvas de fuerza por área, tomadas a una pequeña distancia unas de otras. Para determinar la rigidez general de la muestra de tejido, se deben realizar hasta 25 mediciones en cinco regiones diferentes del área de la muestra dentro del tejido.Estas áreas pueden utilizarse para comparar tejido en diferentes ubicaciones, como el arco aórtico y la aorta descendente. En estas gráficas, se muestran curvas de fuerza representativas de la aorta descendente y del arco aórtico provenientes de la misma muestra de aorta de ratón. Con base en estos datos, se puede calcular el módulo elástico para cada grupo, y utilizarlo para comparar entre diferentes regiones o condiciones.Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo aislar adecuadamente la aorta de ratón y medir el módulo elástico mediante microscopía de fuerza atómica. Después de intentar este procedimiento, es importante recordar realizar la medición por AFM inmediatamente después del aislamiento del tejido. Una vez dominado, el aislamiento de aortas puede completarse en aproximadamente 45 minutos por ratón, y la medición y el análisis por AFM pueden finalizarse en una hora y media, si se realiza correctamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunofluorescencia o ensayos de proliferación para responder preguntas adicionales relacionadas con el remodelado vascular o la proliferación de células musculares lisas vasculares.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

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Medición ascendente aórtica Rigidez En Vivo En ratones usando ultrasonido

Presentamos un método para investigar los cambios osteoartríticos tempranos a nivel celular en el cartílago articular mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AFM).

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En este protocolo, mostramos cómo preparar tejido de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM) y realizar mediciones de indentación en cartílago de extremidades intacto y en regeneración.

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Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

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