Name: Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende a medir la actividad de fosfolípido escramblasa mediante un ensayo de fluorescencia en liposomas con opsina reconstituida. Este método robusto permite estudiar el transporte lipídico intercelular.

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Este estudio contó con el apoyo de la Velux Stiftung (A.K.M.), la subvención de los NIH EY024207 (A.K.M.) y el proyecto J3686 (B.P.) del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF).

1. Preparación de liposomas y proteoliposomas <ol><li> formación de liposomas <ol><li> Usando una jeringa de vidrio, añadir 1.435 POPC l (25 mg / ml, en cloroformo) y 160 POPG l (25 mg / ml, en cloroformo) a un matraz de fondo redondo para obtener 52,5 mol lípidos en una relación molar de POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Secar los lípidos de 30 min usando un evaporador rotatorio a una velocidad de rotación de 145 rpm (no se necesita baño de agua para este volumen de disolvente), a continuación, transferir el matraz a un desecador de vacío durante al menos 3 horas o durante la noche, a temperatura ambiente (RT). </li><li> Hidratar la película lipídica seca con 10 ml de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM (en adelante como tampón A) girando suavemente el matraz hasta un homogéneos resultados, suspensión turbias; NOTA: La concentración de lípidos en esta etapa se espera que sea 5,25 mM como no hay pérdidas deberían haber ocurrido hasta ahora. </li><li> Sonicar la suspensión en un baño de agua durante 10 min a temperatura ambiente con una frecuencia of 40 kHz. La solución se verá un poco más clara. </li><li> El uso de un extrusor, pasar la suspensión 10 veces a través de una membrana con un tamaño de poro 400 nm, seguido por un segundo ciclo de extrusión con 4 pases a través de una membrana con un tamaño de poro 200 nm. NOTA: El diámetro medio de las LUVs resultantes es de ~ 175 nm. Si es necesario, el tamaño y la homogeneidad de las LUVs se pueden comprobar por Dynamic Light Scattering de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Cuantificar la concentración de fosfolípidos de la suspensión LUV como se describe en la sección 1.2). NOTA: Debido a las pérdidas durante la extrusión, la concentración suele ser alrededor de 3,6 mM. </li><li> Almacenar los LUVs a 4 ° C durante aproximadamente 2 semanas si no se utiliza inmediatamente. </li></ol></li><li> La cuantificación de fosfolípidos NOTA: para determinar la concentración de fosfolípidos de la suspensión LUV utilizada para la reconstitución, así como la de los proteoliposomas que eventualmente se generan, una parte alícuota de la muestra es Subjected a la oxidación por el ácido perclórico. Este procedimiento rompe fosfolípidos para la liberación de fosfato inorgánico que luego se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico en comparación con las normas 23. <ol><li> Preparar una solución madre 40 mM de fosfato de sodio (Na 2 HPO 4) en agua destilada desionizada. </li><li> Diluir la solución madre con agua destilada desionizada para obtener 4 mM y 0,4 mM de soluciones que servirán como patrones de calibración de trabajo. </li><li> Uso de las soluciones de trabajo, preparar los estándares en tubos de 13 x 100 mm 2 de vidrio que van de 0 a 80 nmol de fosfato de sodio en un volumen final de 50 l. </li><li> Tomar 10 l cada una de las muestras LUV y proteoliposoma que se cuantifiquen y se diluye con 40 l de ddH2O en 13 tubos de vidrio x 100 mm2. NOTA: Como la concentración de lípidos de los LUVs y proteoliposomas está en el intervalo desde 2,5 hasta 5 M, los 10 l de la muestra deberá contener desde 25 hasta 50 nmol de fósforo lipídico.</li><li> Se añade ácido perclórico 300 l de cada uno de los patrones y las muestras y el calor durante 1 hora a 145 ° C en un bloque de calentamiento. Ponga canicas en los tubos para evitar la evaporación. </li><li> Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente y se añade 1 ml de ddH2O </li><li> Añadir 400 l cada uno de molibdato recién preparada de 12 g / l de amonio y ascorbato de sodio / L de 50 g y agitar para mezclar. </li><li> El calor durante 10 minutos a 100 ° C con mármoles en la parte superior de los tubos. Retire los tubos del bloque de calefacción y dejar que se enfríe a temperatura ambiente. </li><li> Medir la absorbancia de las muestras contra la (muestra patrón que contiene fosfato de sodio 0 nmol) en blanco con un espectrómetro para una longitud de onda de 797 nm. </li><li> Determinar el contenido de fosfato de muestras en la curva estándar de calibración. </li></ol></li><li> La reconstitución de Opsin NOTA: Es necesario determinar las condiciones óptimas de hinchamiento para la reconstitución ya que estos dependen de la naturaleza del detergente, asícomo la composición de lípidos y la concentración de los LUVs. Como LUV cambian sus propiedades de dispersión de luz sobre el proceso de la inflamación puede ser controlada por la medición de absorbancia (Figura 2) tal como fue revisado por Rigaud y Levy 24 y Geertsma et al. 25. <ol><li> Pipetear 800 l de LUVs (de la Sección 1.1, como la recuperación de lípidos después de la extrusión es 70%, la concentración esperada de LUVs es fosfolípido 3,6 mM) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. </li><li> Añadir 5,3 l de tampón A y 34,7 l de 10% (w / v) DDM disolvió en tampón A. </li><li> Incubar durante 3 horas a temperatura ambiente con mezcla de extremo a extremo. </li><li> Mientras tanto preparar las perlas de poliestireno: <ol><li> Utilice 400 mg de cuentas por muestra y pesar en un vaso de precipitados de vidrio. </li><li> Lavar dos veces con metanol, tres veces con agua y una vez con tampón A. Para cada lavado utilice el paso 5 ml de líquido y se agita lentamente durante 10 minutos. NOTA: Se recomienda preparar el poliestirenolos granos para las varias muestras a la vez, por ejemplo, pesan en 6 g de perlas y se lavan con 75 ml de líquido. perlas en exceso se pueden almacenar en un refrigerador durante varios días. </li></ol></li><li> Durante los últimos 30 minutos de la desestabilización de la vesícula secar el fosfolípido marcado con NBD en un tubo de vidrio con tapón de rosca ( &#39;reconstitución tubo de cristal&#39;): por ejemplo, 9,5 l de NBD-PC (1 mg / ml en cloroformo, con un rendimiento de 0,4% en moles de fosfolípidos totales) se secan bajo una corriente de nitrógeno en un tubo de vidrio y posteriormente se disolvió en 45 l de 0,1% (w / v) en tampón A. DDM </li><li> Después de 3 h de desestabilización vesícula añadir el fosfolípido marcado con NBD-disuelto, la proteína solubilizada y DDM-tampón A tal que el volumen final de 1 ml contiene 0,36% (w / v), es decir, 7 mM, DDM. <ol><li> Por lo tanto, para generar los liposomas libres de proteínas (usado como una muestra de control) añadir 45 l de NBD-PC (disuelto en 0,1% de DDM), 60 l de 0,1% de DDM y 55 l de tampón A; proteoliposomas para añadir, para el examenPLE, 40 l de proteína (de una solución madre típica de ~ 110 ng / l) en 0,1% DDM, 45 l de NBD-PC (disuelto en 0,1% de DDM), 20 l de 0,1% de DDM y 55 l de tampón A . NOTA: El orden de adición debe ser como se indica. </li></ol></li><li> Mezclar la muestra para un fin hr adicional sobre el extremo a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 80 mg de las perlas de poliestireno preparadas e incubar la muestra con-extremo sobre extremo de mezclar durante 1 hora a RT. </li><li> A continuación añadimos una 160 mg adicional de perlas de poliestireno y se incuba con-extremo sobre extremo de mezcla para un 2 hr adicional a temperatura ambiente. </li><li> Transferir la muestra (dejando las perlas de poliestireno pasado detrás) a un tubo de vidrio con tapón de rosca que contiene 160 mg de perlas de poliestireno frescas y mezclar durante la noche a 4 ° C. NOTA: La forma más fácil de transferir la muestra y evitar la succión hasta perlas es el uso de una pipeta Pasteur que se empuja a la parte inferior del tubo de vidrio con un poco de presión positiva. Una vez que la punta de la pipeta está firmemente en elparte inferior del tubo, a continuación, la muestra puede ser retirada fácilmente sin interferencia de las perlas. </li><li> A la mañana siguiente, la transferencia de la muestra a un tubo de microcentrífuga sin llevar más de las bolas y colocarlo en el hielo en la preparación para el ensayo de actividad escramblasa. </li></ol></li></ol> 2. Ensayo de la actividad escramblasa NOTA: La intensidad de fluorescencia de liposomas o proteoliposomas diluidas con tampón A se controla con el tiempo tras la adición de ditionito en un espectrómetro de fluorescencia. Para obtener una intensidad de partida estable, la fluorescencia se registra durante al menos 50 segundos (o hasta que se consigue una señal estable) antes de la adición de ditionito a una muestra constantemente agitada y luego es seguido por al menos 500 segundos después de la adición de ditionito. <ol><li> Añadir 1.950 l de tampón A a una cubeta de plástico que contiene una mini barra de agitación. </li><li> Añadir 50 l de la proteo preparada (liposomas) y dejar que la muestra se equilibre en el espectrofotómetro de fluorescenciametros con agitación constante durante varios segundos. </li><li> Mientras tanto preparar una solución de 1 M de ditionito en 0,5 M Tris no tamponada (por ejemplo, para dos muestras pesar 20 mg de ditionito en un tubo de microcentrífuga y se disuelven en 114 l 0,5 M Tris directamente antes del uso y mantener en hielo para la siguiente enfriado en hielo muestra). NOTA: La solución de ditionito debe prepararse poco y no debe ser utilizado más de 20 min después de la preparación; si muchas mediciones se deben hacer, alícuotas de ditionito se pueden pesar de antemano y se disuelven justo antes de su uso. </li><li> Iniciar la monitorización de la fluorescencia (excitación 470 nm, emisión 530 nm, anchura de rendija de 0,5 nm). </li><li> Añadir 40 l de la solución de ditionito de 1 M a la cubeta 50 seg después de comenzar la grabación de fluorescencia (utilizar el septum en la tapa de la cámara de cubeta si es posible) y continuar registrando la fluorescencia para un 4-600 sec más. </li><li> Analizar los datos tal como se describe en la sección 3. </li></ol> 3.Análisis de los datos <ol><li> Cinética de la aleatorización <ol><li> Caracterizar la traza de la fluorescencia de cada muestra obtenida por el ensayo de actividad escramblasa mediante la definición de la fluorescencia inicial, F i, antes de la adición de ditionito, y la fluorescencia de punto final, M, alcanzado después de&gt; 400 seg. F i se determina para cada muestra como el valor medio de la fluorescencia para el período de 30 segundos antes de la adición de ditionito. </li><li> Determinar los datos de punto final correspondientes a la extensión de la reducción de fluorescencia, R = 100 • F / F i. Usamos los términos R L para los liposomas libres de proteínas y R P para proteoliposomas que contiene opsina. </li></ol></li><li> Determinar el peso molecular de la reconstituidas funcionalmente escramblasa <ol><li> Convertir los datos de reducción de la fluorescencia de acuerdo con la siguiente ecuación: p (≥1 escramblasa) = (R P - R L) / (R max - R L) (Ecuación 1) NOTA: ¿Dónde R max es la reducción máxima que se obtiene cuando la proteína suficiente se reconstituye de manera que todas las vesículas de la muestra poseen al menos un escramblasa funcional, y p es la probabilidad de que una vesícula particular en una muestra reconstituida se &quot;activa escramblasa-&#39;, es decir, que posee al menos un escramblasa funcional. El valor de R L es típicamente 45%, mientras que 3 R max es típicamente 82,5% 3, en lugar del 100% esperado (R puede ser determinado experimentalmente para proteoliposomas opsina con un PPR de&gt; 1 mg / mmol max). Como R max &lt;100%, se supone que una subpoblación de las vesículas es refractario a la reconstitución. Para R max = 82,5%, la fracción de vesículas que no puede aceptar la proteína es 0,35. </li><li> Describir la relación entre p (≥1 escramblasa) y PPR (mg de proteína / fosfolípido mmol) por las estadísticas de Poisson de la siguiente manera: p (≥1 escramblasa) = 1 - e <sarriba&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Ecuación 2) NOTA: En caso de m = número de scramblases por vesículas y α = constante ajuste mono-exponencial en unidades de mg de fosfolípidos proteína / mmol. </li><li> Como una fracción de las vesículas no contribuye a la aleatorización incluso a alta PPR (véase la discusión), modificar la ecuación a: p (≥1 escramblasa) = 1 - exp (-PPR * / α) (Ecuación 3) NOTA: En caso de PPR * = PPR / (1- f), donde f es la población de vesículas refractaria o, en este caso, PPR * = PPR / 0,65 (Ecuación 4). NOTA: La constante de ajuste α se determina mediante el ajuste de un gráfico de p (≥1 escramblasa) versus PPR * con una función mono-exponencial. Si opsina (peso molecular 41,7 kDa) reconstituye funcionalmente en vesículas de 175 nm de diámetro (cada vesícula tiene 280.000 fosfolípidos 26) como un monómero, alfa = 0,187 mg mmol -1. Si opsina dimerizes antes de la reconstitución 3 para producir vesículas escramblasa-activo, entonces α= 0,37 mg mmol -1. Si en lugar de PPR PPR * iban a ser utilizados para el análisis, a continuación, los valores alfa correspondiente sería 0,122 y 0,244 mg mmol -1. Estos valores predichos para α asumen que todas las moléculas de opsinas son funcionalmente competente. Si sólo una fracción de las moléculas es competente para codificar los lípidos, a continuación, los valores correspondientes de α será más grande. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de actividad escramblasa nos permitió originalmente para determinar que la opsina tiene actividad escramblasa fosfolípido 2. El ensayo también nos permitió caracterizar la actividad escramblasa de opsina por evaluación de la especificidad (se utilizó una variedad de lípidos reportero marcados con NBD tales como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado con NBD en una cadena de acilo como se muestra para NBD-PC en la Figura 1A, o en el grupo de cabeza, NBD-esfingomielina o NBD- fosfatidilse...

La rodopsina fotorreceptor, una proteína G-receptor acoplado prototípico (revisado por ejemplo en la referencia 1), es la primera escramblasa fosfolípido ser identificados y bioquímicamente verificada 2,3. Scramblases son transportadores de fosfolípidos que aumentan la tasa intrínsecamente lenta de transbilayer movimiento fosfolípido a fisiológicamente niveles apropiados en un bidireccional, de manera independiente de ATP 4-6. Ejemplos de sus acciones se pueden encontrar en el retículo endoplásmico y la membrana citoplasmática bacteriana donde aleatorización constitutiva se necesita para la homeostasis de la membrana y el crecimiento, así como para una variedad de vías de glicosilación 5. Se necesita fosfolípido regulada aleatorización para exponer la fosfatidilserina (PS) en la superficie de las células apoptóticas, donde actúa como un &quot;comer-me&quot; -señal de macrófagos 7 y proporciona una superficie procoagulante de las plaquetas sanguíneas activadas para catalizar la producción de la proteína factors es necesario para la coagulación de la sangre. En las membranas de disco fotorreceptoras, la actividad de aleatorización de la rodopsina se ha sugerido para contrarrestar el desequilibrio de fosfolípidos entre las dos valvas de membrana de la bicapa que se genera por el dependiente de ATP, de lípidos unidireccional flipasa ABCA4 4,8,9 10-12. A pesar de la importancia fisiológica de scramblases, su identidad sigue siendo difícil hasta la rodopsina se informó como un escramblasa en discos fotorreceptoras 2, los miembros de la familia de proteínas TMEM16 fueron identificados como Ca 2+ scramblases dependientes necesarios para la exposición de PS en la membrana plasmática (revisado en referencia 13), y se propuso la proteína bacteriana FtsW como escramblasa requiere un lípido II para la síntesis de peptidoglicano 14. Estos descubrimientos se basan en la reconstitución de proteínas purificadas en liposomas y la demostración de la actividad escramblasa en los proteoliposomas resultantes utilizando la metodología described aquí. Otros posibles scramblases 15-21 - las proteínas MurJ y AMJ implicados en la biosíntesis del peptidoglicano, WzxE y proteínas relacionadas implicadas en la codificación precursores de antígeno O, proteínas MPRF necesario para trasladar fosfatidilglicerol aminoacylated través de la membrana citoplasmática bacteriana, y miembros de la familia Xkr8 que se han propuesto para exponer PS en la superficie de las células apoptóticas - permanecen a ensayar bioquímicamente. Esto pone de relieve la importancia de un sólido ensayo para identificar y caracterizar la actividad escramblasa. A continuación, describimos la reconstitución de la opsina purificada, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores, en grandes vesículas unilaminares (LUVs), y posterior análisis de la actividad escramblasa en los proteoliposomas resultantes utilizando un ensayo basado en fluorescencia. Hay varios protocolos bien descrita en la literatura disponibles para la expresión heteróloga y la purificación de la opsina, por lo tanto, no lo harádescribirla en este protocolo; utilizamos los protocolos descritos en Goren et al. 3 que el rendimiento de FLAG-etiquetados, opsina termoestable a aproximadamente 100 ng / l en 0,1% (w / v) dodecilmaltósido (DDM). La reconstitución se consigue mediante el tratamiento de LUVs con detergente suficiente para que se hinchan pero no se disuelven. En estas condiciones, una proteína de membrana - se suministra en forma de micelas de proteína-detergente - integrará en los liposomas y llegar a ser reconstituido en la membrana del liposoma después de la retirada de detergente, lo que resulta en proteoliposomas. Para reconstituir la opsina (obtenida como una proteína purificada en 0.1% (w / v) DDM), LUVs se preparan a partir de una mezcla de POPC (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina) y POPG (1- palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) y se saturó con DDM antes de añadir la opsina y NBD-PC. El detergente se elimina a continuación mediante tratamiento de la muestra con perlas de poliestireno. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; El principio subyacente del ensayo basado en la fluorescencia se muestra en la Figura 1B. LUVs son simétricamente reconstituirse con una cantidad traza de NBD-PC u otro reportero fosfolípido fluorescente marcado con NBD (Figura 1A). En la adición de ditionito, un no fluorescente dianión membrana impermeable, las moléculas de NBD-PC en el prospecto exterior de las LUVs se representan como el nitro-grupo de NBD se reduce a un grupo amino no fluorescente. Como ni moléculas NBD-PC ni ditionito son capaces de atravesar la membrana en la escala de tiempo del experimento (&lt;10 min), esto se traduce en la reducción de 50% de la señal fluorescente. Sin embargo, si los liposomas se reconstituyen con un escramblasa, las moléculas de NBD-PC en el prospecto interior pueden codificar rápidamente hacia el exterior en el que se reducen. Esto resulta en la pérdida total de la fluorescencia en el caso ideal (Figura 1C). en / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Representación esquemática del ensayo de actividad escramblasa El ensayo utiliza un fluorescente reportero lípidos NBD-marcado; Se muestra NBD-PC (A). Grandes vesículas unilamelares se reconstituyen con una cantidad traza de NBD-PC. La reconstitución produce vesículas simétricas, con NBD-PC distribuido por igual en los folletos exterior e interior. Ditionito (S 2 O 4 2-) reduce químicamente el grupo nitro de NBD a un grupo amino no fluorescente. El tratamiento de los liposomas libres de proteínas con ditionito (B, arriba) provoca una reducción del 50% de la fluorescencia, ya que sólo las moléculas de NBD-PC en el exterior prospecto se reducen: ditionito está cargado negativamente y no puede atravesar la membrana para reaccionar con las moléculas de NBD-PC en el prospecto interior. Tratamiento ditionito de proteoliposomas que contiene opsina-(b, abajo), es decir, proteoliposomas escramblasa-activa, da como resultado la pérdida del 100% de la fluorescence como opsina facilita el movimiento del NBD-PC entre el interior y el exterior prospecto. (C) muestra trazas de fluorescencia idealizadas obtenidos en el tratamiento de los liposomas libres de proteínas y proteoliposomas que contiene opsina-con ditionito. La tasa de pérdida de fluorescencia es la misma en ambos casos que indican que la reducción química de NBD por ditionito es limitante de la velocidad, y que de aleatorización se produce a una velocidad igual o mayor que la velocidad de la reacción química. Las huellas obtenidas a partir de un experimento real se muestran en la Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Los métodos que describimos se pueden utilizar para reconstituir y el ensayo de otras proteínas purificadas, así como mezclas de proteínas de membrana obtenidos, por ejemplo, mediante la extracción de microsomas con detergente 22.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-RAc-(1-glicerol) (sal de sodio)</td><td>Ápices Avanti Lípidos Polares</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]hexanoil}-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl Sigma</td><td></td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecil-&beta;-D-maltósido</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Cubetas de fluorímetro</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorímetro</td><td></td></tr><tr><td>hidrosulfito de sodio de grado técnico, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditionito</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 5 software</td><td></td><td></td><td>Prisma</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extrusora&nbsp;</td><td>Lípidos del Norte, Inc.</td><td></td><td>Extrusora</td></tr><tr><td>Whatman, Disco de drenaje, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Soporte de disco</td></tr><tr><td>Whatman Membranas grabadas con pista de nucleporos, 0,4 y micro; m, 25 mm de diámetro</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>membrana de 400 nm</td></tr><tr><td>Membranas Whatman Nucleopore Track-Etched, 0,2 y micro; m, 25 mm de diámetro</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membrana</td></tr><tr><td>fosfato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo VWR, desechables, vidrio de borosilicato, 13 x 100 mm</td><td>Tubos de vidrio</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de amonio Tetrahidrato</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>Molibdato de amonio</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sodio</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>ascorbato de sodio</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbentes</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>perlas de poliestireno</td></tr><tr><td>&nbsp; 2,0 ml Microtubos transparentes</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742 Tubos de</td><td>reconstitución Tubo</td></tr><tr>de<td>vidrio de reconstitución</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800 Tubos de</td><td>vidrio de reconstitución</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern&nbsp;</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa actividad

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocan fosfolípidos través de la bicapa de membrana bidireccionalmente de una manera independiente de ATP. La primera escramblasa a ser identificado y bioquímicamente verificada fue opsina, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores. La rodopsina es un receptor acoplado a proteína G localizados en las membranas de disco varilla de fotorreceptores de la retina donde es responsable de la percepción de la luz. Actividad escramblasa de rodopsina no depende de su ligando 11- cis retinal, es decir, la opsina apoproteína también es activo como un escramblasa. Aunque fosfolípido constitutiva y regulada de aleatorización jugar un papel importante en la fisiología celular, sólo unos pocos scramblases fosfolípidos han sido identificados hasta el momento, además de opsina. Aquí se describe un ensayo basado en la fluorescencia de la actividad escramblasa de opsina. Opsina se reconstituye en grandes liposomas unilamelares compuestos de fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y una cantidad traza de fluorescencia NBD marcado con PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} - sn -glicero-3-fosfocolina). actividad escramblasa se determina midiendo el grado en que las moléculas de NBD-PC situados en la cara interna de la vesícula son capaces de acceder a la cara externa, donde su fluorescencia se elimina químicamente por un agente reductor que no pueden atravesar la membrana. Los métodos que describimos tienen aplicabilidad general y se pueden utilizar para identificar y caracterizar las actividades escramblasa de otras proteínas de membrana.

Se describe la reconstitución de la opsina en LUVs para caracterizar su actividad escramblasa usando un ensayo basado en fluorescencia. Se analizan los resultados para establecer un límite inferior de la tasa de fosfolípidos mediada opsina codificación y para determinar el estado en el que oligomérica opsina reconstituye funcionalmente en las vesículas. Para identificar las condiciones óptimas de la reconstitución, es necesari...

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

El objetivo general de este procedimiento es reconstituir un receptor acoplado a proteína G típico en vesículas unilamelares grandes, y medir su capacidad para realizar la translocación independiente de 80p de fosfolípidos a través de una bicapa lipídica utilizando un ensayo basado en fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del transporte intercelular de lípidos, como cuál es la identidad molecular de las proteínas que pueden redistribuir lípidos y cuál es su mecanismo. La principal ventaja de esta técnica es que es muy confiable y robusta.Una vez que se haya establecido el procedimiento de reconstitución para una composición lipídica determinada y un detergente preferido. Para comenzar este procedimiento, utilice una jeringa de vidrio para agregar 1435 microlitros de una solución de 25 miligramos por mililitro de POPC y cloroformo a un matraz de fondo redondo. Agregue 160 microlitros de una solución de 25 miligramos por mililitro de POPG y cloroformo para obtener 52,5 micromoles de lípidos en una relación molar nueve a uno de POPC respecto a POPG.A continuación, seque los lípidos durante 30 minutos utilizando un evaporador rotatorio ajustado a 145 RPM. Una vez finalizada la secado, transfiera el matraz a un desecador al vacío durante tres horas a temperatura ambiente. Luego, agregue 10 mililitros de tampón A para hidratar la película lipídica seca.Agite suavemente el matraz hasta que se forme una suspensión turbia homogénea. Somete la suspensión a sonicación a una frecuencia de 40 kilohertz en un baño de agua a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, utilizando un extrusor, pase la muestra a través de una membrana con un tamaño de poro de 400 nanómetros, 10 veces.A continuación, realice un segundo ciclo de extrusión, pasando la muestra a través de una membrana con un tamaño de poro de 200 nanómetros, cuatro veces. Separe la suspensión resultante, que será visiblemente más clara y que contiene vesículas unilamelares grandes de fosfolípidos de aproximadamente 175 nanómetros de diámetro. Una vez finalizada la extrusión, prepare estándares en tubos de vidrio de 13 por 100 milímetros según se detalla en el protocolo del texto.Luego, agregue 10 microlitros de cada muestra de LUV y proteoliposoma a un tubo de vidrio diferente y diluya con 40 microlitros de agua destilada desionizada. Añada 300 microlitros de ácido perclórico a cada tubo y caliente durante una hora a 145 grados Celsius en un bloque calefactor. Coloque una bolita de vidrio en cada tubo para evitar la evaporación.Luego, deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente y agregue un mililitro de agua destilada desionizada a cada uno. Añada 400 microlitros de una solución recién preparada que contenga 12 gramos por litro de molibdato de amonio y 50 gramos por litro de ascórbato de sodio a cada tubo, y mezcle mediante vortex. Incube los tubos durante 10 minutos a 100 grados Celsius utilizando canicas para evitar la evaporación.Luego retire los tubos del bloque calefactor y déjelos enfriar a temperatura ambiente. Utilizando un espectrómetro ajustado a 797 nanómetros, obtenga una curva de calibración utilizando los patrones. A continuación, mida la absorbancia de las muestras frente al blanco y determine el contenido de fosfato.Comience pipeteando 800 microlitros de cada suspensión de LUV extruidas en un tubo microfusible de dos mililitros diferente. Añada 5,3 microlitros del tampón A y 34,7 microlitros de DDM al 10% masa por volumen, disuelto en tampón A, a cada tubo. A continuación, incube las muestras durante tres horas a temperatura ambiente con mezcla de extremo a extremo.Mientras las muestras están en incubación, pese 400 miligramos por muestra de perlas en un vaso de precipitados de vidrio. Lave las perlas con cinco mililitros por muestra de metanol, agitando lentamente durante 10 minutos. Repita este lavado una vez con metanol, tres veces con agua y una vez con tampón A. Durante los últimos 30 minutos de incubación de las muestras, seque 9,5 microlitros por muestra de fosfolípido marcado con NBD en un tubo de vidrio con tapón de rosca bajo una corriente de nitrógeno.Luego, agregue 45 microlitros por muestra de DDM al 0,1% masa por volumen en tampón A para disolver el fosfolípido seco. Una vez finalizada la incubación, agregue la solución de fosfolípido marcado con MBD disuelta a cada muestra. A continuación, agregue DDM al 0,1%, tampón A y la opsina solubilizada con DDM en la cantidad deseada, en ese orden, para obtener un volumen final de un mililitro con una concentración de siete milimolar de DDM.La reconstrucción de una proteína de membrana se logra tratando vesículas con un detergente suficiente para que la hinchazón no disuelva. Y en esas condiciones, que deben determinarse empíricamente para cada composición lipídica y detergente, la proteína se integrará en los liposomas. Incube las muestras durante una hora a temperatura ambiente.Luego, agregue 80 miligramos de las perlas de poliestireno preparadas a cada tubo e incube nuevamente durante una hora a temperatura ambiente con mezcla de extremo a extremo. Agregue 160 miligramos adicionales de perlas de poliestireno a cada muestra e incube durante dos horas a temperatura ambiente con mezcla de extremo a extremo. Cuando finalice la incubación, transfiera las muestras, dejando las perlas atrás, a tubos de vidrio limpios, cada uno conteniendo 160 miligramos de perlas frescas.Mezcle de extremo a extremo durante la noche a cuatro grados centígrados, protegido de la luz. A continuación, transfiera las muestras, sin los perlas, a tubos microfusibles individuales. Coloque los tubos sobre hielo en preparación para el ensayo de actividad de scramblasa.Comience añadiendo 1950 microlitros del tampón A a una cubeta de plástico que contenga una barra magnética. Luego, añada 50 microlitros de la muestra de proteoliposomas preparada. Deje que la muestra se equilibre en el espectrómetro de fluorescencia con agitación constante durante cinco segundos.Mientras la muestra se equilibra, prepare una solución de ditionito un molar en tris no tamponado 0,5 molar. Inicie el monitoreo de fluorescencia con una excitación de 470 nanómetros, una emisión de 530 nanómetros y un ancho de rendija de 0,5 nanómetros. Registre durante 50 segundos para obtener una señal estable.Luego, agregue 40 microlitros de una solución unimolar de ditionito al cubilete. Registre la fluorescencia durante al menos 500 segundos. Finalmente, analice los datos según se describe en el protocolo del texto.Para un análisis completo de los datos de fluorescencia, cuando se trata de determinar la fracción de vesículas que no pueden ser reconstituidas. La recuperación de proteínas y lípidos en las vesículas reconstituidas y también la distribución de tamaños de las vesículas. En este estudio, la opsina se reconstituye en vesículas unilamelares grandes para caracterizar su actividad de translocasa mediante un ensayo basado en fluorescencia.Las vesículas se reconstituyen con NBD-PC, que se distribuye equitativamente entre las hojuelas externa e interna. El ditionito reduce el grupo nitro del NBD en el exterior de la vesícula a grupos amino no fluorescentes, lo que resulta en una reducción del 50 % de la fluorescencia en liposomas libres de proteínas. Sin embargo, cuando la opsina facilita el movimiento del NBD entre la hojuela interna y la externa, ocurre una pérdida completa de fluorescencia.Los resultados representativos de este enfoque a diferentes relaciones proteína-fosfolípido se pueden observar aquí. El grado de reducción de la fluorescencia aumenta con la cantidad de opsin reconstituida en vesículas, que varía desde cero hasta 4,95 microgramos. Se añadió ditionito en el momento indicado, y se monitoreó la fluorescencia NBD durante 400 segundos.La reducción de la fluorescencia es más significativa a mayores relaciones proteína:fosfolípido, siendo la reducción máxima del 85 %. La reducción de fluorescencia en el punto final se utiliza entonces para determinar la probabilidad de actividad de la scramblasa, es decir, la probabilidad de que las vesículas tengan al menos una scramblasa, mediante la estadística de Polson. La curva roja representa un ajuste monoexponencial para la opsina. Mientras tanto, las líneas grises discontinuas representan ajustes monoexponenciales para la reconstitución de la opsina en vesículas como monómeros, dímeros preformados o tetrámeros preformados.El método que describimos puede adaptarse fácilmente a diferentes necesidades. Los procedimientos son versátiles y pueden utilizarse para identificar y caracterizar la actividad de scramblasas de fosfolípidos de otras proteínas de membrana en el futuro. El procedimiento de reconstitución puede aplicarse a cualquier proteína de membrana.Esta técnica nos permitió identificar la opsina como la primera scramblasa de fosfolípidos verificada bioquímicamente y nos permitió, entonces, caracterizar la actividad de diferentes estados de conformación de la proteína, así como su capacidad para transportar diferentes lípidos.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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