Name: Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo Ex Ovo Time-lapse de pollo temprano embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a cultivar embriones de pollo ex ovo mediante el método de sándwich de papel de filtro sumergido para obtener imágenes time-lapse de alta calidad. Esta técnica permite observar eventos morfogenéticos como neurulación y gastrulación sin necesidad de cámara climática.

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Los autores reconocen el apoyo financiero de una subvención ZonMW-VICI 918.11.635 (Países Bajos). Los autores desean agradecer a la tienda de herramientas de la Vrije Universiteit Amsterdam por sus sugerencias prácticas y para la fabricación de los componentes de la instalación y Jarno Voortman de Carl Zeiss Holanda útil para el asesoramiento en la microscopía. Marjolein Blaauboer fue una gran ayuda en el comentario crítico sobre varios borradores del manuscrito.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con los experimentos en los Países Bajos Ley de Animales. NOTA: El método del papel de filtro sumergido sándwich se modifica a partir del 1. 1. Filtro de papel sumergido Preparación Sandwich <ol><li> Pannett-Compton (PC): solución salina 27,28 <ol><li> Preparar soluciones madre A (1 L de ultrapura H 2 O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl 2 · H 2 O, y 12,7 g de MgCl 2 · 6H 2 O) y B (1 L de ultrapura H2O, 2,365 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O y 0,188 g de NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) en botellas de 1 l limpias. Almacenarlos a 4 ° C. </li><li> Preparar 1 L de PC-solución salina mezclando 900 ml de ultrapura H 2 O con 40 ml de solución madre de A y 60 ml de la solución madre B (en este orden para evitar la precipitación). Preparar fr recién PC-solución salinaom soluciones madre A y B cada semana. NOTA: Las soluciones madre se pueden almacenar a 4 ° C durante varios meses. El tratamiento en autoclave y / o la adición de antibióticos o antimicóticos no son necesarios. </li></ol></li><li> La incubación de los huevos de gallina fertilizados <ol><li> En un incubador humidificado, poner los huevos de su lado y los incuban a 37,5 ° C hasta que alcancen la edad deseada. NOTA: Guarde los huevos no más de dos semanas (preferiblemente a 12 - 15 ° C) antes de la prueba, ya que el porcentaje de nacimientos disminuirá significativamente </li></ol></li><li> Portadoras de papel de filtro (adaptado de 1) <ol><li> Si está disponible, utilice una máquina de corte láser para cortar las compañías de papel de filtro con forma de reloj de arena de papel de filtro grueso (28 mm x 22 mm). Taper la anchura en el centro de 22 mm a 10,4 mm. Cortar una abertura elíptica central (10,6 mm x 5,5 mm), con el eje más largo de la elipse orientada paralela al lado mayor de la portadora de papel de filtro (Figura 1-M). <ol><li> Opcionalmente, preparar una plantilla de cartón con las dimensiones correctas y transferir su contorno y la de la abertura central de papel de filtración de espesor con un lápiz. Cortar el soporte de papel de filtro con unas tijeras finas. </li></ol></li><li> Cortar dos soportes de papel de filtro idénticos para cada embrión para ser explantado. Preparar las compañías de papel de filtro adicionales como respaldo en caso de un embrión se pierde durante la explantación. </li></ol></li><li> Con control de temperatura del baño de aceite (en el día del experimento) <ol><li> Colocar el vaso de precipitados con control de temperatura en el centro de la xy platina motorizada del microscopio zoom en posición vertical y conectar el vaso de precipitados a su controlador de temperatura. </li><li> Ponga cuatro anillos grandes de acero inoxidable (30 mm de diámetro exterior, 4 mm de alto, 1,5 mm de espesor de pared) en una placa de 6 cm Petri para actuar como pesos y colocar el plato en el centro del vaso de precipitados con control de temperatura. NOTA: Este plato Petri simplemente sirve como un marcador de posición para ajustar el aceite level. </li><li> Llenar el vaso de precipitados con control de temperatura con 130 ml de aceite mineral ligero. Ajuste el nivel de aceite si es necesario de modo que termine aproximadamente 3 mm por debajo del borde superior de la 6 cm placa de Petri. </li><li> Retire la placa de Petri de 6 cm desde el vaso de precipitados con control de temperatura y ajustar la temperatura a 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Filtro de papel sumergido Sandwich Producción <ol><li> El medio de cultivo (en el día del experimento) <ol><li> Verter 30 ml de PC-solución salina (como se ha preparado en los pasos 1.1.1 a 1.1.2) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml llenado con 30 ml de PC-solución salina por cada dos embriones a ser explantado. </li><li> Con cuidado, romper un huevo no incubados en una placa de Petri de 10 cm. </li><li> Cosecha de albúmina fina moviendo una pipeta de transferencia de plástico a lo largo de las paredes de la placa de Petri y la succión en la albúmina fina. Recoger 30 ml albúmina fina en un tubo de centrífuga de 50 ml por cada dos embriones a ser explantado. Asegúrese de obtener sólo el thin albúmina. NOTA: Por lo general, 3 - 4 huevos permiten la cosecha de alrededor de 30 ml de albúmina fina. </li><li> Verter 20 ml de albúmina fina en cada PC-rellenos de solución salina 50 ml tubo de centrífuga (tal como se preparó en el paso 2.1.1). </li><li> Mezclar la PC-solución salina con la albúmina fina invirtiendo suavemente los tubos varias veces. Se deja reposar durante varios minutos y comprobar si la mezcla, llamado medio de cultivo a partir de aquí, está claro. Si el medio de cultivo no está claro, preparar fresca PC-salina de la solución madre y la cosecha de albúmina fina frescas. </li></ol></li><li> Coloque dos pequeños anillos de acero inoxidable (20 mm de diámetro exterior, de 4 mm de altura, espesor de pared de 1,5 mm, 6,5 mm hueco en el anillo) tan distantes como sea posible en un nuevo máximo de 6 cm placa Petri de plástico y llenarlo con 22 ml de cultivo medio (como se ha preparado en los pasos 1.4.1 a 1.4.4) usando una pipeta de plástico 25 ml (Figura 1-H). Asegúrese de que los residuos acumulados en la parte superior del medio se mantiene en el tubo de centrífuga. </li><li> Eliminar los residuos or burbujas a partir del medio utilizando una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Llenar un plato de 10 cm de Petri con 75 ml de PC-solución salina (para ser utilizado en el paso 2,15). </li><li> Retirar un huevo de la incubadora y se deja reposar en el banco en su lado durante 1 minuto para dejar que el embrión llega a la parte superior de la yema. </li><li> Con cuidado, romper el huevo en una placa de Petri (Figura 1-A). Remojar el borde de un pedazo de papel de seda fina en las albúmina gruesa y centrar el blastodermo tirando, si es necesario. </li><li> Eliminar la mayor parte de la albúmina delgado y grueso de la placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico (con la punta cortada para facilitar la absorción de las albúmina gruesa). </li><li> Crear una ventana en la albúmina gruesa alrededor del embrión frotando suavemente las albúmina gruesa con un trozo de papel de seda, alejándose del centro (Figura 1-B). Evitar que el papel de seda se adhiera a la membrana vitelina. </li><li> Con unas pinzas, cuidadosamente coloque un soporte de papel de filtro en la Vitemembrana lline alrededor del embrión, con el eje más largo de la abertura elíptica paralelo al eje anterior-posterior del embrión (Figura 1-C). </li><li> Pellizcar una punta de las tijeras de uñas a través de la membrana vitelina cerca del soporte de papel de filtro y cortar rápidamente por todo el portador de papel de filtro (Figura 1-D). </li><li> El uso de pinzas, levantar el portador de papel de filtro fuera de la yema de huevo en una dirección oblicua paralela al eje anterior-posterior del embrión (Figura 1-E). </li><li> Gire el soporte de papel de filtro en torno a tener la cara ventral del embrión en la parte superior y sumergirlo en el PC-solución salina. Sumergir el soporte de papel de filtro a lo largo del eje anterior-posterior del embrión en una dirección oblicua. </li><li> Deshacerse de toda la yema todavía unida la membrana vitelina y blastodermo lavando suavemente con PC-solución salina de una pipeta de transferencia de plástico. Mantenga la totalidad del soporte de papel de filtro sumergido a unall veces (Figura 1-F). </li><li> Retire el soporte de papel de filtro de la PC-solución salina a lo largo del eje anterior-posterior del embrión en una dirección oblicua y deshacerse del exceso de líquido taponando el borde del soporte de papel de filtro en un papel de seda. </li><li> Mantenga el papel de filtro en posición horizontal, con el lado ventral del embrión hacia arriba, y colocar otro portador de papel de filtro en la parte superior de la primera, el uso de un segundo par de pinzas. Sus aberturas deben coincidir exactamente, intercalando de ese modo el embrión entre las dos capas de papel de filtro (Figura 1-G). </li><li> Inmediatamente sumerja el sándwich de soporte de papel de filtro en el medio de cultivo en una dirección oblicua a lo largo del eje-posterior-anterior del embrión. Colocarlo en la zona que abarca el espacio entre los dos anillos de acero (Figura 1-H). </li><li> Fijar el sándwich de papel de filtro mediante la colocación de dos más anillos de acero en la parte superior de los otros dos, asegurándose de que la abertura con el correombryo permanece completamente cubierto (Figura 1-I). </li><li> Compruebe el nivel medio y asegurarse de que el espaciador superior se acaba sumergido en el medio. Si es necesario, añadir o eliminar pequeñas cantidades de medio. </li><li> Con cuidado, coloque la placa de Petri en el centro del baño de aceite de temperatura controlada y estabilizar el plato lateralmente mediante la colocación de tres grandes anillos de acero inoxidable (diámetro 30 mm exterior, 4 mm de alto, 1,5 mm de espesor de pared) al lado del plato en el aceite . Asegúrese de que los anillos de acero tocan los bordes del plato (Figura 1-J). </li><li> Pipetear lentamente aproximadamente 6 ml de aceite mineral ligero en la parte superior del medio con una pipeta de transferencia de plástico, de modo que el medio está cubierto con una capa continua de aceite mineral (Figura 1-K). </li><li> Configurar la adquisición de lapso de tiempo. NOTA: imágenes de los embriones como panorámicas horizontales de cinco sub-imágenes superpuestas (azulejos) permite obtener imágenes detalladas (objetivo 5X), con un Overvi generalesew de la morfología 29-30. Intervalos de imagen entre 3 y 10 minutos permiten el seguimiento detallado de los cambios morfológicos de 31 años, y la adquisición de pequeñas z-pilas (de cinco a siete diferentes planos con una distancia de 30 micras) compensa la mayor parte del engrosamiento y giro del embrión 30 . Z-planos con el mayor contraste se pueden seleccionar antes del procesamiento adicional de 32 cuadros para formar películas a intervalos (véase la sección Resultados Representante para obtener información detallada sobre la adquisición de imágenes). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg"> Figura 1: Configuración de la Sumergido Sandwich papel de filtro. (A) Un huevo se quebró en una placa de Petri. (B) La mayoría de la albúmina gruesos y finos se retira de la placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico (no mostrado). A continuación, se crea una ventana en la albúmina gruesa unaalrededor del embrión frotando suavemente las albúmina gruesa con un pañuelo de papel. Soporte de papel (C) Un filtro se coloca alrededor del blastodermo en la parte superior de la yema. (D) El soporte de papel de filtro se corta suelto de la membrana vitelina que rodea y (E) retirado de la parte superior de la yema. (F) La yema restante se lava cuidadosamente en un baño de PC-solución salina. (G) El embrión se intercala con un segundo soporte de papel de filtro idénticos. (H) El sándwich de papel filtro se sumerge en el medio y se coloca en los anillos de acero inoxidable de dos metales (embrión dorsal frente o de lado ventral hacia arriba). (I) dos anillos estabilizan el sándwich de la parte superior. (J) La placa de Petri que contiene el embrión se transfiere al baño de aceite de temperatura controlada. anillos de acero inoxidable estabilizan lateralmente la placa de Petri. (K) El medio de cultivo se cubre con una capa de aceite mineral.(L) Esquema del sándwich de filtro sumergido. (M) Las dimensiones de los soportes de papel de filtro utilizados para el sándwich de papel de filtro sumergido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Protoc.+Vol.+I%22%5BJournal%5D)">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como una nueva variante de la cultura CE bien establecida-1, el sándwich de papel filtro sumergida facilita la adquisición de campo claro y campo oscuro películas de lapso de tiempo a largo plazo de la temprana del embrión de pollo ex ovo haciendo una temperatura y humedad controlada alrededor de la incubadora el microscopio prescindible. En lugar de ser cultivadas en un semi-sólido inferior agar-albúmina, los embriones se mantienen totalmente sumergidos en un medio de cultivo simple que consiste en PC-solución salina y albúmina fina. La evaporación y la pérdida de calor se reducen al mínimo por una capa de aceite mineral flotando en la superficie del medio de cultivo. Los embriones pueden cultivarse fácilmente, ya sea dorsal o lateral ventral hacia arriba, sin diferencias visibles en la calidad. Como se muestra aquí, los embriones en el sándwich de papel filtro sumergido son accesibles para intervenciones de microcirugía, como la aplicación de los granos de morfogenes empapado. Las futuras aplicaciones incluyen fluorescencia en vivo de imágenes, microinyección y electroporación, y silenciamiento de genes a manipulate y el estudio de una amplia gama de eventos morfogenéticos durante el desarrollo ventral (por ejemplo, corazón temprano y somitogenesis) y dorsal (por ejemplo, la gastrulación tardía, cierre del tubo neural, y principios del cerebro). Un tratamiento con fármacos dependiente del tiempo es factible si la placa de Petri que contiene el sándwich de papel de filtro se reemplaza con una cámara de perfusión, que permite el intercambio del medio de cultivo por debajo de la capa de aceite mineral. El filtro de papel sándwich sumergida va a desarrollar su potencial completo de imágenes en combinación con imágenes basado en láser (incluyendo microscopía de hoja de luz) y objetivos de inmersión. Algunas dificultades con la preparación del bocadillo de papel de filtro sumergido se abordarán en los siguientes párrafos. A pesar de que requiere sólo una cantidad moderada de la formación para transferir un embrión de la yema en el sándwich de papel de filtro, varios pasos todavía pueden influir significativamente en la calidad del embrión en el cultivo. Antes de que el portador de papel de filtro escolocado en la yema de huevo, la membrana vitelina en todo el embrión debe ser liberado de cualquier albúmina de espesor. Sólo entonces la conexión entre el papel de filtro y la membrana vitelina ser lo suficientemente fuerte para soportar el lavado en PC-solución salina. El papel de filtro que lleva el embrión debe cruzar la interfaz líquido / aire lo menos posible para reducir al mínimo la tensión en las membranas. Una vez introducidos en el PC-solución salina para lavar, todo el portador de papel de filtro debe estar completamente sumergido en todo momento. El tiempo en el baño de PC-solución salina debe limitarse a aproximadamente 30 - 60 seg, como la membrana vitelina se iniciará la liberación del papel de filtro. Aún así, la limpieza del embrión debe ser ejecutado muy a fondo, como restos de yema posteriormente ocultar la vista del embrión. Durante el lavado, nunca apunte la corriente de la pipeta de transferencia directamente sobre el embrión, pero siempre radialmente fuera de ella. Después de la eliminación del embrión desde el PC-solución salina, asegúrese de mantener el papel de filtro en posición horizontal para reducir al mínimola tensión en las membranas embrionarias. Entonces, estabilizar el embrión con el segundo soporte de papel de filtro. Una vez que se coloca el segundo portador de papel de filtro, evitar la creación de cualquier tensión lateral, lo que podría cambiar los soportes de papel de filtro con relación a otra y desgarrar las membranas embrionarias. Cuando el sándwich de papel de filtro se pone en el medio de cultivo, sino que también debe cruzar la interfaz aire / líquido sólo una vez para minimizar la tensión en las membranas. El segundo par de anillos de acero inoxidable utilizados para estabilizar el sándwich de papel de filtro de la parte superior debe ser colocado muy lentamente y sin ningún tipo de presión para reducir al mínimo la compresión de las membranas embrionarias. Pequeñas rupturas de la zona opaca del embrión normalmente se curan durante la primera hora de la cultura, sino un embrión dañado pueden y deben siempre ser reemplazados por una nueva muestra antes de la capa de aceite se pipeta en la parte superior del medio de cultivo. A la imagen de un embrión completo o varias muestras para alta resolución películas a intervalos, el micrófonoROSCOPE debe estar equipado con un xy platina motorizada, controlado por el software microscopio. Es de crucial importancia para que el movimiento xy escenario con una velocidad mínima para evitar daños a los embriones y turbulencias en el medio de cultivo y el aceite, lo cual disminuirá la calidad de la imagen. Para la adquisición de las películas a intervalos presentados aquí, xy platina motorizada movía con una velocidad aproximada de 1,75 mm / seg. En el futuro, la imagen podría mejorarse aún moviendo primero la etapa en la posición deseada y la adquisición de la imagen después de un breve período de descanso para permitir que las vibraciones y las turbulencias se desvanecen. Como limitación, los usuarios potenciales deben ser conscientes de la distancia de trabajo relativamente largo (aproximadamente 1 cm) necesaria para este método de cultivo si se utiliza un microscopio vertical y sin objetivos de inmersión. Esta distancia de trabajo los resultados de la capa de medio y de aceite mineral en la parte superior del embrión. En la placa de 6 cm de Petri, la capa de aceite tiene un thickness de aproximadamente 1 a 1,5 mm, y el embrión se sumerge aproximadamente 4 mm de profundidad en el medio de cultivo. Dependiendo del diámetro del objetivo, el borde superior de la placa de 6 cm Petri también podría limitar el acceso al embrión. Esto podría evitarse mediante el uso de un plato más grande. La distancia de trabajo de la parte superior puede ser ligeramente reducido al minimizar los espesores de las capas líquidas. Además, la distancia de trabajo desde abajo podría reducirse al mínimo por lo que el embrión más abajo a la parte inferior de la placa de Petri y la reducción del espesor de la ventana de cristal del vaso de precipitados se calienta. Mientras que el protocolo se ha optimizado para trabajar con un microscopio distancia zoom largo de trabajo en posición vertical, que podría ser instalado en un microscopio invertido así. Los futuros usuarios deben tener en cuenta que sumergir el embrión demasiado profundamente en el medio de cultivo podría dar lugar a O 2 -diffusion problemas, aunque los experimentos preliminares sugieren que la difusión limitada no parece ser un problem, siempre y cuando el embrión está rodeado por una suficientemente a gran reservorio de medio de cultivo y el papel de filtro intercalada no se presiona a la parte inferior de la placa de Petri. Otra limitación es la de control de temperatura. Mediante el ajuste de la temperatura del controlador para el vaso de precipitados se calentó a 40 ° C, la temperatura en el medio se equilibra a 37,5 ° C alrededor de los embriones cuando el medio está cubierto con aceite mineral. Esto muestra que algo de energía se pierde entre la parte inferior del vaso de precipitados, donde se encuentran los elementos de calefacción y el sensor de temperatura, y la ubicación de los embriones. El control de temperatura puede ser optimizado mediante la reubicación del sensor y la redistribución de los elementos de calentamiento.

Embriogénesis ha fascinado al hombre desde el comienzo de la historia. ¿Cómo la estructura y morfología del embrión se desarrollan de manera temporal y espacial, bien definido? El embrión de pollo se ha convertido en uno de los modelos animales vertebrados clásicos para la embriogénesis por varias razones: Es fácilmente disponible, barato, transparente en sus primeras etapas, y accesible para las manipulaciones experimentales, ya que se desarrolla fuera de la madre. Además, tiene una geometría casi plana durante los eventos morfogenéticos tempranas, tales como el corazón y la formación del cerebro, la gastrulación, neurulación, y somitogenesis 15. procesos morfogenéticos pueden entenderse mejor si se estudian de forma dinámica, como por ejemplo a través de la adquisición de imágenes con lapso de tiempo. El embrión de pollo se puede visualizar in ovo 16 pero con mala accesibilidad para las manipulaciones experimentales y visibilidad limitada para obtener imágenes de microscopía de luz de transmisión. Por lo tanto, cortarAL técnicas se han propuesto a los embriones de pollo de cultivo ex ovo, ya sea en sistemas de cultivo de yema enteros 13,17 - 19 o como cultivos de explantes de 1,20 - 23. En sistemas de cultivo de yema de enteros, el embrión permanece en la parte superior de la yema intacta, y todo el contenido del huevo se transfiere a otro recipiente para la incubación. Este recipiente puede ser una cáscara de huevo sustituto 17, una placa de Petri de 19, o una hamaca hecha de plástico se aferran abrigo 13,18. Los embriones en cultivos de yema enteros pueden ser, idealmente, se cultivaron hasta la eclosión y son accesibles a micromanipulaciones. Estas técnicas son especialmente útiles para el estudio del desarrollo de los embriones después de la iniciación de la circulación de la sangre (que aumenta el contraste), mientras que los embriones más jóvenes permanecen difícil de visualizar. Estos embriones tempranos se pueden obtener imágenes mejor si se escindieron de la yema y se cultivaron como explantes in vitro. Los explantes son fácilmente accesibles para el experimentoAL manipulaciones y requieren menos espacio para el cultivo. Durante muchos años, una técnica iniciada por Denis nuevo en 1955 y sus variaciones fueron las normas de oro de los métodos de cultivo de explantes de embriones de pollo, con lo que el embrión accesible para la microscopía de lapso de tiempo y las intervenciones de microcirugía 20,21. A pesar de su gran éxito, la técnica de nuevo es relativamente exigente y consume mucho tiempo. Blastodermo menudo se separa cuando la membrana vitelina, que lleva el blastodermo, se estira alrededor de un anillo de vidrio para lograr la tensión adecuada 1. Por otra parte, el embrión sólo puede ser cultivado con su lado ventral hacia arriba. El cultivo CE (Early polluelo), una técnica más reciente desarrollada por Chapman y Collignon 1, evita el estiramiento de la membrana vitelina mediante el uso de un soporte de papel de filtro con una abertura central. El papel de filtro se une a la membrana vitelina, lo cual mantiene su tensión natural, y rodea al embrión como un cuadro 1.Los embriones se cultivan a continuación en una parte inferior de agar-albúmina, por lo general con su lado ventral hacia arriba. El cultivo dorsal hacia arriba parece sólo es posible para los embriones en HH8 15 años o más. Muchos grupos han adaptado el soporte de papel de filtro para sus necesidades, tales como mediante la sustitución de la parte inferior agar-albúmina con un soporte hecho a partir de fibras de sutura quirúrgica 24 o un colágeno de la membrana 25 recubierto. A menudo, los embriones cultivados con la técnica de Nuevo o con la cultura CE están expuestos, con su aleta dorsal o ventral de aire para facilitar la difusión de oxígeno de 1,20. Estos cultivos de explantes tienen que ser mantenidos en una atmósfera humidificada para evitar la evaporación del medio y para evitar que el embrión se sequen. Esto se consigue mediante la incubación de la cápsula con la cultura explante en un plato más grande de Petri que contiene un pañuelo de papel humedecido 1. La adquisición de imágenes con lapso de tiempo de estos embriones requiere o bien el uso de una incubadora con temperatura controlada alrededor de todo el microscopio o un temperamentoATURALEZA controlado recipiente con una tapa térmica para evitar la condensación en la trayectoria luminosa 14. Sin embargo, los embriones de pollo también pueden desarrollar ex ovo completamente sumergido en medio de cultivo en forma de cultivos de papel de filtro 25, emparedada entre una capa de aceite mineral pesado y la albúmina en adaptaciones de la técnica de New 2,21, o como explantes blastoderm plegables en la &quot;Cornish Pasty Cultura &quot;23,26, sin contacto directo con el aire. El sándwich de papel de filtro sumergido es una nueva variante de la técnica de soporte de papel de filtro. Al combinar el conocimiento anterior sobre el cultivo de embriones de pollo ex ovo, hace que la incubadora de temperatura controlada y la tapa térmica prescindible. El embrión se intercala entre dos portadores de papel idéntico (cortado con láser) de filtro 24 y se cultivaron totalmente sumergido en un medio de cultivo sencillo (Pannett-Compton solución salina 27,28 y albúmina fina en una proporción de 3: 2) en una temperatura controlada contenerer. Una capa de aceite mineral ligero que flota en la parte superior del medio impide 2,21 evaporación y minimiza la pérdida de calor al ambiente. El fondo del contenedor tiene una ventana de vidrio, y toda la configuración se lleva a cabo en un microscopio distancia zoom largo de trabajo en posición vertical. Esta configuración permite la adquisición de alta resolución de campo claro y campo oscuro películas a intervalos de aproximadamente 30 h de desarrollo embrionario, que van desde la etapa temprana línea primitiva a la etapa 28 somitas (equivalente a las etapas de Hamburger y Hamilton 5 a 16, HH5-16 ) 15. Los embriones pueden cultivarse igualmente bien con su ventral o dorsal hacia arriba. Por lo tanto, los embriones son accesibles a la observación y manipulación de ventral (por ejemplo, 7,8 cardíaca temprana y somitogenesis 6) y dorsal (por ejemplo, a finales de la gastrulación 2, cierre del tubo neural 3 - 5 de, y principios de cerebro 9 - 13 de) el desarrollo. El filtro sumergido papel sándwich provides un entorno sencillo y estable para la microcirugía, la implantación de bolas, la microinyección, el silenciamiento de genes, y los estudios de electroporación. Su potencial de formación de imágenes puede ser empujado mucho más mediante el uso de imágenes basado en láser (incluyendo microscopía de hoja de luz) y objetivos de inmersión.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&nbsp; Sistema de purificación de agua de referencia</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Durán&nbsp; frascos de laboratorio, con tapón, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td> KCl Merck Millipore 1049361000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Whatman papel de filtro cualitativo, Grado 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de corte por láser MLS-90120-C130, CO2-láser, 130&nbsp; W, longitud de onda 10.6&nbsp; y micro; m</td><td>Micro Lasersystems</td> Tork Tejidos faciales extra suaves <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de látex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Accu-jet pro Controlador</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de plástico, 25&nbsp; ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Fundas de plástico para</td><td></td><td></td><td></td>documentos</tr><tr><td>Incubadora de huevos - Incubadora mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huevos de gallina fertilizados (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultivo</td><td>de tejidos Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Placas de Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos de centrífuga, tubos de centrífuga Greiner o tubos Cellstar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Anillos de acero inoxidable, a medida</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anillos grandes, diámetro exterior de 30 mm, 4 mm de altura, 1,5 mm de espesor</td><td></td><td></td><td></td>de pared</tr><tr><td>Anillos pequeños, 20 mm de diámetro exterior, 4 mm de altura, 1,5 mm de espesor de pared, 6,5 mm de espacio en el anillo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td></td><td></td><td></td>de uñas</tr><tr><td>Pinzas, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas y muy afiladas para cortar papel de filtro</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&nbsp; Aceite mineral Sigma-Aldrich</td> Número CAS de <td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Agar bottoms for EC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Microbead implantation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &micro; m se utilizaron cuentas)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de acupuntura: tipo J, No.02, 0.12x30&nbsp; mm</td><td>SEIRIN&</td><td>nbsp; tipo J, No.02, 0.12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific 10010023</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Sensor de temperatura de vaso de precipitados con control de temperatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD con carcasa roscada M4 RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>RTD herméticamente sellado Sensores HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Termistor y cable de extensión RTD EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>Mini conectores de 3 pines para termopares, RTD's de 3 hilos y termistores MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (película de poliimida) Calentadores flexibles aislados KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura/proceso CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de aluminio hecho a medida, aislado con poliacetal (dibujos ver hoja 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Configuración del microscopio</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 con ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&nbsp; mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Control giratorio manual MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminación superior 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Platina de medición motorizada S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de inserción S, vidrio 237x157x3&nbsp; mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Panel de control del sistema SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Hamamatsu ORCA Flash 4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Estación de trabajo de microscopía de alta gama Xeon Quad-Core multilingüe</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de idioma Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>Monitor TFT LCD HP ZR2440w 24"</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>ya no está disponible</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware Clave de licencia</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>ya no está disponible</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cámaras Hardware Clave de licencia</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>Módulo ZEN Z Stack</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>Módulo ZEN Mosaicos/Posiciones</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>Módulo ZEN Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>Diseñador de experimentos de módulos ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>Clave de licencia de hardware ZEN Desk 2012</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>ya no está disponible</td></tr></tbody></table>

un filtro de papel sumergido sandwich para el largo plazo ex ovo time-lapse de pollo temprano embriones

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Debido a su disponibilidad, bajo coste, la geometría plana, y la transparencia, la ex ovo embrión de pollo se ha convertido en un importante modelo animal vertebrado para el estudio de la morfogénesis eventos, tales como la gastrulación 2, neurulation 3 - 5 de, somitogenesis 6, corazón doblado 7, 8, y el cerebro la formación de 9 - 13 de, durante la embriogénesis temprana. La clave para entender los procesos morfogenéticos es seguir de forma dinámica por la imagen de lapso de tiempo. La adquisición de películas a intervalos de polluelo embriogénesis ex ovo se ha limitado ya sea a las ventanas de tiempo cortos o a la necesidad de una incubadora para controlar la temperatura y la humedad en todo el embrión 14. A continuación, presentamos una nueva técnica para la cultura de pollo embriones ex ovo de alta resolución de imagen de lapso de tiempo utilizando microscopía de luz transmitida. El sándwich de papel de filtro sumergida es una variante de la Techn portador de papel de filtro bien establecidaique (EC-cultivo) 1 y permite el cultivo de embriones de pollo sin la necesidad de una cámara climática. El embrión se intercala entre dos soportes de papel de filtro idénticos y se mantiene totalmente sumergido en un medio simple, con control de temperatura cubierto por una capa de aceite mineral ligero. A partir de la fase de línea primitiva (Hamburger-Hamilton etapa 5, HH5) 15 hasta al menos la etapa 28 somitas (HH16) 15, los embriones pueden ser cultivadas ya sea con su ventral o dorsal hacia arriba. Esto permite la adquisición de películas a intervalos que cubren aproximadamente el 30 hr del desarrollo embrionario. se muestran cuadros y películas a intervalos representativos. Los embriones se comparan morfológicamente a un embrión cultivado en las CE-cultivo estándar. El sándwich de papel filtro sumergido proporciona un entorno estable para estudiar dorsal principios y procesos morfogenéticos ventrales. También permite la formación de imágenes de fluorescencia en vivo y micromanipulaciones, tales como la microcirugía, imp granolantation, microinyección, el silenciamiento de genes, y la electroporación, y tiene un gran potencial para ser combinados con los objetivos de inmersión para la formación de imágenes basada en láser (incluyendo microscopía de lámina de luz).

Aquí, presentamos una nueva técnica para cultivar embriones de pollo ex ovo para imágenes de lapso de tiempo utilizando luz transmitida y microscopía de fluorescencia. El sándwich de papel de filtro sumergido es una variante de la técnica de portador de papel de filtrobien establecida 1 que permite el cultivo de embriones de pollo completamente sumergidos en un medio de cultivo líquido.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo Ex Ovo Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

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