Name: La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a cuantificar interacciones proteína-proteína mediante anisotropía de fluorescencia usando las proteínas SBDS y EFL1. Esta técnica proporciona datos cuantitativos y cualitativos esenciales para la bioquímica celular.

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Los autores agradecen el apoyo financiero del proyecto número 167359 y 177138 del CONACyT, y del proyecto número IN201615 de la DGAPA-UNAM.

1. SBDS-flash expresión de la proteína Tag y Purificación NOTA: Para los experimentos de anisotropía, una etiqueta de flash correspondiente a la secuencia de-Pro-Cys-Cys-Cys Gly Cys se añadió a la C-terminal de la secuencia de codificación SBDS humanos por PCR. Este constructo se subclonó en el vector de expresión pRSET-A y se transformó en células C41 Escherichia coli para expresar una proteína que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal (His-tag), los SBDS humanos secuencia y un C-terminal etiqueta FLASH 10 de codificación. <ol><li> Expresión de la proteína SBDS-Flash <ol><li> Transformar E. competente células de E. coli C41 con el plásmido pRSET-HisSBDS-flash utilizando un protocolo estándar de choque térmico 19. Placa de las células en medios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina 100 mg / ml. LB composición medios sólidos se compone de 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona y 20 g de agar para el volumen de 1 L. </li><li> bacterias transformadas cultivo a 37 ° C hastaabsorbancia a 600 nm (A 600) alcanza 0,5 a 0,7 en 1 L de medio líquido LB suplementado con 100 g de ampicilina / ml. </li><li> Inducir la expresión de la proteína mediante la adición de 0,5 mM isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido a la cultura y continuar la incubación durante más de 5 horas. </li><li> Recoger la suspensión bacteriana por centrifugación a 3.800 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. En este punto, ya sea almacenar el sedimento celular a -20 ° C o utilizar inmediatamente para la purificación de proteínas. </li></ol></li><li> La purificación de proteínas SBDS-Flash NOTA: Todas las etapas cromatográficas se realizan usando un sistema de cromatografía líquida (FPLC) de proteínas rápida o una bomba peristáltica. Cromatografía de Ni 2+ -affinity utiliza una columna de flujo rápido de 5 ml. cromatografía de intercambio aniónico utiliza una columna de intercambio de sulfopropilo catiónico fuerte 5 ml. Una velocidad de flujo de 3 ml / min fue utilizado para todas las etapas cromatográficas. <ol><li> Resuspender las células en 35 ml de SBDS lisis bUffer (50 mM tampón de fosfato pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y se lisan por sonicación durante un tiempo total de 4 min usando ciclos de 10 seg ON y 30 seg OFF, en 4 DO. </li><li> Centrifugar la muestra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li><li> Mantenga el sobrenadante y desechar el sedimento para eliminar los restos celulares. </li><li> Equilibrar la columna de afinidad de Ni 2+ con 3 volúmenes de columna (CV) de tampón de lisis SBDS e introducir el conjunto sobrenadante clarificado en la columna. </li><li> Eliminar la proteína no unida mediante lavado con 3 CV de tampón de lisis SBDS y se eluye con 3 CV de tampón de elución SBDS (tampón fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM). </li><li> Diluir la proteína 6 veces se eluyó con tampón fosfato 50 mM pH 6,5 y eliminar los posibles agregados por filtración a través de una membrana de 0,22 micras de celulosa. </li><li> Equilibrar la columna de intercambiador de cationes de sulfopropilo con 3 CV de falta de sal columna Stampón (tampón fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introducir la muestra de proteína de la etapa anterior. </li><li> el material no unido de lavado con 3 CV de baja sal S tampón de columna y se eluye la proteína en un solo paso con tampón fosfato 50 mM pH 6,5, 1 M NaCl. </li><li> Diluir la proteína 3,3 veces eluida con 50 mM de tampón de fosfato de pH 6,5. Se concentra la proteína con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar la proteína en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Verificar la pureza de la proteína por análisis de SDS-PAGE y tinción de Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Expresión y Purificación de Proteínas NOTA: EFL1 se expresó bajo la regulación del promotor Gal 1/10 divergentes 21 y el Saccharomyces cerevisiae MAT Un 3&#39;UTR en el vector pRS426. La proteína recombinante codifica la isoforma humana EFL1 1 fusionado a una proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV) sitio de reconocimiento y una etiqueta de hexahistidina en el extremo C-terminal. <ol><li> Expresión de la proteína EFL1 <ol><li> Transformar S. células cerevisiae BCY123 con el plásmido pRS426-EFL1TevHis usando un protocolo de acetato de litio estándar 22. Placa de todas las células transformadas en caída sintético a cabo los medios de comunicación sin uracilo (SD-URA) suplementado con 2% (w / v) de glucosa. Composición de los medios de comunicación SD-URA consiste en 8 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11 g de casaminoácidos, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, 60 mg de leucina y 60 mg de triptófano para el volumen de 1 L. </li><li> Cultivo transformado levadura a 30 ° C hasta 600 A llega a 1,8 en 1 l de medio SD-ura suplementado con 0,5% (w / v) de glucosa. </li><li> Inducir la expresión de proteína mediante la adición de 2,8% de galactosa (v / w) al cultivo y continuar la incubación durante otras 18 horas a 30 ° C. </li><li> Recoger la suspensión de levadura por centrifugación a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.En este punto, ya sea almacenar el sedimento celular a -20 ° C o utilizar inmediatamente para la purificación de proteínas. </li></ol></li><li> La purificación de proteínas EFL1 NOTA: Todas las etapas cromatográficas se realizan usando un sistema FPLC o una bomba peristáltica. Cromatografía de Ni 2+ -affinity utiliza una columna de flujo rápido de 5 ml a un caudal de 3 ml / min. cromatografía de exclusión por tamaños utiliza una columna de 125 ml pre-empaquetada con resina Superdex 200 a una velocidad de flujo de 1 ml / min. <ol><li> Resuspender las células en 50 ml de EFL1 tampón de lisis (Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol) suplementado con PMSF 1 mM y benzamidina 1 mM y romper las células por la fricción en un batidor de bolas usando perlas de vidrio (Ø = 0,5 mm) para un tiempo total de 6 min utilizando ciclos de 2 min ON y OFF 15 min, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la muestra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li><li> Mantenga el sobrenadante y desechar el sedimento para eliminar los restos celulares. </li&gt; <li> Equilibrar la columna de afinidad de Ni 2+ con 3 CV de tampón de lisis EFL1 e introducir todo el sobrenadante clarificado en la columna. </li><li> Eliminar la proteína no unida mediante lavado con 3 CV de tampón de lisis EFL1 y se eluye con 3 CV de tampón de elución EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol). </li><li> Equilibrar la columna de exclusión de tamaño con 1,5 CV de tampón de Anisotropía (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol). </li><li> Se concentra a 1 ml de la proteína EFL1 eluida de la columna de afinidad de Ni 2+ con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3.800 xg hasta el volumen deseado. Introducir la muestra en la columna de exclusión de tamaño. </li><li> Recoger la proteína eluida y se concentra por ultrafiltración a una concentración final de aproximadamente 30 mM. Flash congelar la proteína en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior. verificar THe pureza de la proteína por análisis de SDS-PAGE y tinción de Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 3. El etiquetado de SBDS-flash con el flash colorante fluorescente 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína <ol><li> Mezclar 3 nmol de la proteína SBDS-flash con 3 nmol de la 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína en un volumen de 5 l de tampón de anisotropía. </li><li> Deje que la reacción transcurra durante 8 horas a 4 ° C. Se dializa la muestra frente a tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre. </li><li> Usar la ley de Lambert-Beer para cuantificar el% de proteína marcada. Medir la absorbancia a 280 nm y 508 nm en un espectrofotómetro usando una cubeta de cuarzo de volumen apropiado. NOTA: Tenga en cuenta los siguientes coeficientes de absorción molar (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Calcular la concentración de proteína SBDS-flash marcada usando la ecuación 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Calcular la concentración de proteína total SBDS utilizando la Ecuación 3, sustituyendo el calculado C SBDS-flash de la etapa anterior. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Calcular el porcentaje de proteína marcada utilizando la ecuación 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Experimentos de anisotropía de fluorescencia NOTA: los experimentos de anisotropía se realizaron en un espectrofluorómetro equipado con una caja de herramientas de recogida de polarización y los datos se realizó utilizando el programa de anisotropía proporcionada en el software del equipo. La longitud de onda de excitación se fijó a 494 nm con un ancho de banda espectral de 8 nm y la emisión se registró usando un filtro de paso de banda de 530 ± 25 nm. Las mediciones se realizaron a 25 ° C en una cubeta de 200 l con una longitud de la trayectoria 5 mm 10. <ol><li><html> En una cubeta de fluorescencia, colocar 200 l de 30 nm SBDS intermitencias en tampón de anisotropía y se valora 2 l de EFL1 30 mM. Mezclar bien y dejar reposar la reacción durante 3 minutos antes de medir el valor de anisotropía. </li><li> Repita el paso 4.1 hasta un volumen total de 40 l de EFL1 se ha añadido. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Ajustar los datos al modelo de unión apropiada usando un algoritmo de regresión de mínimos cuadrados no lineal. Las ecuaciones para los modelos de unión más comunes se presentan en la Tabla 1. </li><li> Evaluar el mejor modelo que describe la interacción entre las proteínas mediante la inspección de los residuos de la forma 23. Apoyar el modelo elegido con experimentos adicionales. </li></ol> Tabla 1. Modelos de unión común la interacción proteína-proteína y las ecuaciones matemáticas que los describen.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla. <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

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Los autores no tienen nada que revelar y no tienen intereses financieros contrapuestos.

La mayoría de los experimentos bioquímicos con proteínas requieren no sólo proteína pura, sino también grandes cantidades de ellos, independientemente de la técnica utilizada. Por esta razón, las proteínas utilizadas para este tipo de experimentos se obtienen mediante la expresión heteróloga, como era el caso que aquí se presenta. espectroscopia Florescence requiere la presencia de un fluoróforo en la molécula estudiada. residuos aromáticos constituyen los fluoróforos intrínsecos de una proteína, sin embargo, el uso de ...

Las células contienen una multitud de biomacromoléculas que interactúan constantemente entre sí. Esta asociación da lugar a complejos que participan en las vías celulares responsables de su funcionamiento en la transducción de señales, regulación de la expresión génica y la migración celular entre otros. Todas las interacciones proteína-proteína que se producen en una célula comprenden una red conocida como el interactome. En Saccharomyces cerevisiae más de 70% de sus proteínas se ha demostrado que tiene que interactúan socios 1. La comprensión de la interactoma de una célula y sus funciones proporcionar información relevante sobre la complejidad y la diversidad de los organismos vivos. Varios métodos han sido descritos para identificar y caracterizar las interacciones proteína-proteína. Diferentes alta a través de métodos tales como poner dos híbridos de levadura 2, ensayos de complementación de proteínas fragmento 3, 4 purificación por afinidad acoplada a espectrometría de masas y microarra proteínasys se utilizan para identificar una interacción 5,6. Una vez identificados, es necesario para validar y esto puede variar sobre una base de caso por caso. Típicamente, estos experimentos implican la interrupción de la interacción en sí misma en el nivel de los miembros individuales de la pareja de interacción, por ejemplo, por deleción del gen o la sobreexpresión de una de las proteínas y, a continuación en busca de cambios en las propiedades o la función del otro miembro en el nivel celular. Posteriormente, técnicas biofísicas 7 se utilizan para caracterizar la interacción proteína-proteína en el nivel molecular. Con este fin, la estructura de los complejos de proteínas se determinó por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y crio-microscopía electrónica mientras calorimetría y espectroscopía de fluorescencia se utilizan para describir cuantitativamente y de manera mecánica. En este trabajo, la anisotropía de fluorescencia se usó como una técnica para caracterizar la interacción entre la GTPasa EFL1 y el SBDproteína S. Estas proteínas participan en la síntesis de los ribosomas mediante la promoción de la liberación del factor de iniciación eucariótico 6 de la superficie de las subunidad 60S ribosomal 8. La proteína SBDS está mutado en una enfermedad conocida como el síndrome de Shwachman-Diamond 9 y actúa como un factor de intercambio de nucleótidos de guanina para EFL1 disminuyendo su afinidad por difosfato de guanosina 10,11. mutaciones de la enfermedad en SBDS abolir la interacción con EFL1 de materiales, evitando su activación. La anisotropía de fluorescencia se utiliza comúnmente en aplicaciones biológicas para estudiar la proteína-péptido o interacciones proteína-ácido nucleico. Se basa en el principio de que un fluoróforo excitado con los resultados de luz polarizada en una emisión parcialmente polarizada. La anisotropía de fluorescencia se define por la Ecuación 1: <img alt="ecuación1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> donde VV y VH son laintensidades de fluorescencia de la vertical (VV) y horizontalmente (VH) de emisión polarizadas cuando la muestra se excita con luz polarizada verticalmente 12. La anisotropía de fluorescencia es sensible a los factores que afectan a la tasa de la difusión rotacional del fluoróforo y por lo tanto depende de la temperatura, la viscosidad de la solución y el tamaño molecular aparente del fluoróforo. El tamaño aparente de una proteína que contiene un fluoróforo aumenta cuando interactúa con otra proteína y tal cambio, entonces se puede evaluar como un cambio en la anisotropía. Más específicamente, un fluoróforo que gira lentamente en solución con respecto a su tiempo de vida fluorescente tendrá un valor grande I VV y valor pequeño I VH y por lo tanto exhibirá un relativamente grande anisotropía. Para fluoróforos que caen rápidamente en relación a su tiempo de vida fluorescente, me VV y VH será similar y su valor será pequeña anisotropía 12 </sup&gt; (Figura 1). Además, para una buena señal de anisotropía para la medición del ruido, es necesario disponer de un fluoróforo con una vida de fluorescencia similar al tiempo de correlación rotacional de la molécula de interés. De lo contrario, no es posible registrar con precisión la diferencia de anisotropía entre la proteína libre y que en el complejo. Por ejemplo, la anisotropía de una sonda fluorescente con una vida útil cerca de 4 nseg tales como fluoresceína o rodamina unidos a un compuesto de bajo peso molecular de 100 Da es 0,05. La unión a una molécula de 160 kDa aumentará su valor de anisotropía a 0,29; una diferencia que se puede medir con precisión. Por el contrario, la misma sonda fluorescente que participan en una reacción de unión cuyo aumento en el tamaño molecular varía de 65 a 1000 kDa sólo resultará en un cambio de anisotropía de 0,28 hasta 0,3, que es demasiado pequeña para ser medida con precisión. En este escenario, una sonda con un tiempo de vida de 400 nseg sería más adecuado 12. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática del equipo utilizado para medir la anisotropía de fluorescencia y el procedimiento. Representación esquemática del equipo utilizado para realizar una medición de anisotropía de fluorescencia proteína-proteína experimento interacción. Fluoróforos que caen rápido pantalla pequeña anisotropía que aumenta tras la unión a un compañero de interacción. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> aplicaciones de fluorescencia requieren la presencia de un fluoróforo en cualquiera de las moléculas estudiadas. Para el estudio de las interacciones proteína-proteína hay tres tipos de fluoróforos: 1) los residuos de triptófano presentes en las proteínas, 2) fluoróforos unidos químicamente y 3) parejas de fusión fluorescentes tales como proteína verde fluorescente (GFP) y su derivatantes. La mayoría de las proteínas tienen residuos de triptófano en su estructura, por tanto, la manera más fácil de medir una interacción es mediante el control de los cambios en los espectros de fluorescencia correspondiente o mediante el control de los cambios en la intensidad de fluorescencia de los residuos de triptófano. Sin embargo, los residuos de triptófano pueden estar presentes en ambas proteínas que complican el análisis. Por otra parte, por un fluoróforo para cambiar sus propiedades fluorescentes debido a una interacción que tiene que estar situado en o cerca del sitio de unión y que podría interferir con la interacción en sí misma. Esto necesita una atención especial cuando se utiliza fluoróforos voluminosos tales como GFP. Si ninguno de estos fluoróforos se puede utilizar para estudios de unión es necesario, entonces, para introducir fluoróforos extrínsecas a la de las proteínas implicadas. Existen muchos fluoróforos sintetizados químicamente y pueden ser unidos covalentemente a las proteínas a través de sus grupos reactivos tales como los grupos amina (cadena lateral de lisinas o N-terminal) y los grupos tiol en cisteína. Fderivados luorophore con ésteres de isotiocianato y succinimidilo reaccionan con grupos amida mientras yodoacetamida y maleimida son grupos reactivos con tiol 13. Los colorantes más comunes utilizados en aplicaciones de fluorescencia son derivados de la fluoresceína y los colorantes rodamina verde, cumarinas, fluoróforos BODIPY y colorantes Alexa Fluor. Una lista detallada de fluoróforos disponibles en el mercado y su uso se puede encontrar en las referencias 14,15. Para el etiquetado de éxito, el grupo reactivo debe ser expuesto en la superficie de la proteína, pero debido a la gran cantidad de grupos funcionales reactivos típicamente presentes en polipéptidos que es muy difícil de conseguir la modificación específica de sitio. La proteína de interés en este estudio, SBDS, contiene 5 cisteínas libres y 33 lisinas que pueden resultar en el etiquetado de múltiples sitios. etiquetado no uniforme puede afectar a la unión y complicará el análisis de datos como diferentes moléculas de fluoróforo pueden provocar diferentes señales de intensidad de fluorescencia tras la unión. para overcome este problema, hemos utilizado el fluoróforo flash, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína a la etiqueta sitio directa la proteína SBDS. Este es un colorante de arsenóxido con una alta afinidad por cuatro cisteínas espaciadas en un motivo de saber como Flash-tag consiste en la secuencia CCXXCC donde X es cualquier aminoácido distinto de cisteína 16,17. Este motivo de tetracisteína se añade a la N- o C-terminal de la proteína por ingeniería genética junto con un enlazador adecuado para evitar la interrupción del pliegue general de la proteína. La pareja que consiste en FLASH tinte y Flash-tag fue diseñado originalmente para las proteínas de etiquetas específicas del lugar en las células 17 que vivían, pero también puede ser utilizada para etiquetar proteínas purificadas in vitro como se ejemplifica aquí. Además, las estrategias enzimáticos también se han desarrollado para permitir la funcionalización específica de sitio de proteínas 18. En este manuscrito se describe la utilidad de anisotropía de fluorescencia de unaherramienta sa para estudiar las interacciones proteína-proteína. La unión puede evaluarse por simple inspección de la forma de la curva de unión mientras que la información cuantitativa puede obtenerse a partir del ajuste de los datos experimentales.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Perlas de vidrio</td><td>Productos Biospec 11079105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>Glicerol ultra puro</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>colorante 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceína</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Este kit contiene el colorante para etiquetar una etiqueta FlAsH</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa Anhidra</td><td>para medio</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galactosa</td><td>para medio</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>para medio</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofan&nbsp;</td><td>Para</td><td></td> el clorhidrato de bezamidina de DOC0189 <td></td></tr><tr><td></td><td>medio Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>para el medio</td><td>NAC02</td><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Fosfato de potasio dibásico</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Fosfato de sodio monobásico</td></tr><tr><td>Levadura base nitrogenada sin aminoácidos</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td> micro granulado <td></td><td>Para sulfato</td> de adenina de DOC0193 <td></td></tr> medio <tr><td></td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtración</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; Filtro</td></tr> de <tr><td>membrana</td> kDa <td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtro de membrana, ésteres de celulosa mixtos, hidrófilos, 0,22&nbsp; y micro; m, 47 y nbsp; mm, blanco, liso</td></tr><tr><td>Columna de afinidad de Ni2+</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Cartucho precargado con 5&nbsp; ml Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>Columna intercambiadora de cationes de sulfopropilo fuerte</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Columna de exclusión de tamaño</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Célula de fluorescencia</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Agilent Technologies G6860AA</td><td></td><td>Cary 60 Agitador UV-Vis</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Rango de temperatura de sobremesa Ambiente-15 grados a 60 grados; </td></tr><tr><td>Centrífuga</td> C <td>ThermoFischer Scientific 75004271</td><td></td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Descatalogado</td><td>Sistema FPLC Monitor de conductividad UV-MM II Fracción de bomba P500</td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro</td><td>Olis</td><td>No aplicable</td><td>Olis DM 45 con polarización Toolbox</td></tr></tbody></table>

la anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel esencial en la función de un organismo vivo. Una vez que una interacción ha sido identificado y validado es necesario caracterizar en el nivel estructural y mecánica. Existen varios métodos bioquímicos y biofísicos para tal fin. Entre ellos, anisotropía de fluorescencia es una técnica poderosa particularmente cuando se utiliza la intensidad de fluorescencia de una proteína marcada con fluoróforo permanece constante tras la interacción proteína-proteína. En esta técnica, una proteína marcada con fluoróforo se excita con luz polarizada verticalmente de una longitud de onda apropiada que excita selectivamente un subconjunto de los fluoróforos en función de su orientación relativa con el haz entrante. La emisión resultante también tiene una direccionalidad cuya relación en los planos vertical y horizontal define la anisotropía (r) como sigue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), donde I VV y yo <sub&gt; VH son las intensidades de fluorescencia de los componentes verticales y horizontales, respectivamente. La anisotropía de fluorescencia es sensible a la difusión rotacional de un fluoróforo, es decir, el tamaño molecular aparente de un fluoróforo unido a una proteína, que se altera tras la interacción proteína-proteína. En el presente texto, el uso de la anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína se ejemplifica para hacer frente a la unión entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación como-1 GTPasa (EFL1). Convencionalmente, el etiquetado de una proteína con un fluoróforo se lleva a cabo en los grupos tiol (cisteína) o en los grupos amino (N-terminal de amina o de lisina) de la proteína. Sin embargo, SBDS posee varias cisteínas y lisinas que no permitían sitio etiquetado dirigido de la misma. Como una técnica alternativa, el colorante 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína se utiliza para etiquetar específicamente un motivo de tetracisteína, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, ingeniería genética en el C-terminal de la proteína recombinante SBDS. El ajuste de los datos experimentales proporcionan información cuantitativa y mecanicista en el modo de unión entre estas proteínas.

Para llevar a cabo cualquier experimento anisotropía es importante para descartar grandes cambios en la intensidad de fluorescencia del fluoróforo ya que la anisotropía observada de una mezcla de especies está representada por la Ecuación 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> donde F i representa la fluorescencia fra...

interacciones de proteínas están en el corazón de la función de la célula. técnicas calorimétricas y espectroscópicas son comúnmente utilizados para caracterizarlos. Aquí describimos anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar la interacción entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación 1 similar GTPasa (EFL1).

La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

El objetivo general de este experimento es evaluar y cuantificar la interacción entre dos proteínas de interés utilizando la anisotropía de fluorescencia. Estas mediciones pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica y la biofísica de proteínas, como las proteínas cuyas interacciones son importantes para la función celular.La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener información cuantitativa y cualitativa sobre la interacción proteína-proteína. Para preparar la proteína SBDS-FlAsH purificada, primero prepare un litro de medio líquido LB suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Y en él, cultive bacterias transformadas a 37 grados Celsius hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance entre 0,5 y 0,7.Induzca la expresión de la proteína SBDS-FlAsH añadiendo 0,5 milimolar de IPTG al cultivo y continúe la incubación durante cinco horas más. A continuación, recoja la suspensión bacteriana por centrifugación a 3800 ×g durante diez minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante.Re-suspender las células en 35 mililitros de tampón de lisis SBDS suplementado con un milimolar de PMSF. Lisisar por sonicación durante un tiempo total de cuatro minutos utilizando ciclos de diez segundos encendidos y 30 segundos apagados a cuatro grados Celsius. Luego, centrifugar la muestra a 9.000 × g durante 50 minutos a cuatro grados Celsius.Mantenga el sobrenadante y deseche el precipitado para eliminar los restos celulares. Después de equilibrar la columna de afinidad para níquel con tres volúmenes de columna del tampón de lisis SBDS, aplique todo el sobrenadante clarificado sobre la columna. Elimine las proteínas no unidas lavando con tres volúmenes de columna del tampón de lisis SBDS.Después del lavado de la columna, eluir la proteína retenida con tres volúmenes de columna del tampón de elución SBDS. Para purificar aún más la proteína, equilibrar la columna de intercambiador catiónico sulfopropilo con tres volúmenes de columna del tampón de columna de bajo contenido salino. Diluir la proteína seis veces con tampón fosfato 50 milimolar pH 6,5 e introducirla en la columna.Lave el material no unido con tres volúmenes de columna de tampón S con bajo contenido salino. A continuación, eluya la proteína en un solo paso añadiendo tampón fosfato 50 milimolar, pH 6,5, con un molar de cloruro de sodio sobre la columna. Diluya el eluido tres veces con tampón fosfato 50 milimolar, pH 6,5.Luego, concentre la proteína utilizando dispositivos de ultrafiltración mediante centrifugación a 3800 × g durante quince minutos. La calidad de las proteínas utilizadas en este tipo de experimento es muy importante. La interpretación de los datos se complica si las muestras de proteína utilizadas no son de alta pureza.Verifique la pureza de la proteína SBDS-FlAsH mediante análisis por SDS-PAGE y tinción con Coomassie. Congele rápidamente la proteína en nitrógeno líquido y almacénela a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior. Para preparar la proteína EFL1 purificada, primero cultive levadura transformada a 30 grados Celsius en un litro de medio sintético de eliminación sin uracilo, suplementado con 0,5 por ciento de glucosa, hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 1,8.Induzca la expresión proteica añadiendo un 2,8 por ciento de galactosa al cultivo y continúe la incubación durante 18 horas a 30 grados Celsius. Recolecte la suspensión de levadura por centrifugación a 3800 × g durante diez minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante tras la centrifugación.Re-suspender las células en 50 mililitros de tampón de lisis EFL1 suplementado con un milimolar de PMSF y un milimolar de benzamidina. Romper las células por fricción en un homogenizador con perlas utilizando perlas de vidrio durante un tiempo total de seis minutos, con ciclos de dos minutos encendido y quince minutos apagado a cuatro grados Celsius. Luego, centrifugar la muestra a 9.000 × g durante 50 minutos a cuatro grados Celsius.Mantenga el sobrenadante y deseche el precipitado para eliminar los restos celulares. A continuación, equilibre la columna de afinidad para níquel con tres volúmenes de columna del tampón de lisis EFL1. Aplique todo el sobrenadante clarificado sobre la columna equilibrada.Después de eliminar la proteína no unida lavando la columna con tres volúmenes de columna del tampón de lisis EFL1, eluya la proteína unida con tres volúmenes de columna del tampón de elución EFL1. Para purificar aún más la proteína EFL1, equilibre la columna de exclusión por tamaño con 1,5 volúmenes de columna del tampón de anisotropía. Concentre la proteína EFL1 eluida de la columna de afinidad al níquel hasta un mililitro utilizando dispositivos de ultrafiltración mediante centrifugación a 3800 × g. Luego, introduzca la muestra concentrada en la columna de exclusión por tamaño.Recoger la proteína eluida y concentrarla mediante ultrafiltración hasta una concentración final de aproximadamente 30 micromolares. Verificar la pureza de la proteína EFL1 mediante análisis por SDS-PAGE y tinción con Coomassie. Congelar rápidamente la proteína en nitrógeno líquido y almacenarla a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior.Mezcle tres nanomoles de la proteína SBDS-FlAsH con tres nanomoles del colorante lumio verde en un volumen de cinco microlitros de tampón de anisotropía. Deje que la reacción transcurra durante ocho horas a cuatro grados Celsius. Después de ocho horas, diализar la muestra frente al tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre.Mida las absorbancias a 280 nanómetros y 508 nanómetros en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo. Luego, utilice la ley de Lambert-Beer para cuantificar el porcentaje de proteína marcada según se describe en el protocolo del texto. Antes de medir el valor de anisotropía, cada paso de filtración del aislado proteico debe realizarse con cuidado, asegurando que toda la muestra se dispensa en la solución y se vuelva homogénea.En una cubeta de fluorescencia, coloque 200 microlitros de SBDS-FlAsH 30 nanomolar en tampón de anisotropía y realice una titulación con dos microlitros de EFL1 30 micromolar. Mezcle bien y deje reposar la reacción durante tres minutos antes de medir los valores de anisotropía y fluorescencia. Repita este proceso hasta que se haya agregado un volumen total de 40 microlitros de EFL1.Como paso final, ajuste los datos a un modelo de unión supuesto, tal como se describe en el protocolo del texto. Para realizar cualquier experimento de anisotropía, es importante descartar cambios grandes en la intensidad de fluorescencia. Como se muestra aquí, la fluorescencia de SBDS-FlAsH no cambia notablemente al unirse a EFL1.La titulación de EFL1 en una cubeta de cuarzo que contiene SBDS-FlAsH provoca un aumento en la anisotropía observada inicialmente. Varias adiciones de EFL1 describen la curva de unión correspondiente, que puede ajustarse mediante regresión no lineal de mínimos cuadrados a un modelo de unión supuesto. En este caso, un modelo de un solo sitio de unión no describe adecuadamente los datos experimentales.En cambio, un modelo de dos sitios de unión no idénticos describe adecuadamente los datos experimentales. Una vez dominado, el experimento de unión por anisotropía de fluorescencia puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante contar con proteína purificada en grandes cantidades.Paralelamente a este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ensayo de complementación basado en fragmentos o la anisotropía de fluorescencia con diferentes dominios de la proteína estudiada, con el fin de respaldar el modelo de unión adecuado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de unión seguido de anisotropía de fluorescencia.

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Investigación

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Biochemistry

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