La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

interacciones de proteínas están en el corazón de la función de la célula. técnicas calorimétricas y espectroscópicas son comúnmente utilizados para caracterizarlos. Aquí describimos anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar la interacción entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación 1 similar GTPasa (EFL1).

El objetivo general de este experimento es evaluar y cuantificar la interacción entre dos proteínas de interés utilizando la anisotropía de fluorescencia. Estas medidas pueden ayudar a responder preguntas clave. El campo de la bioquímica de proteínas y la biofísica de proteínas, como las proteínas cuyas interacciones son importantes para la función celular.

La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener información cuantitativa y cualitativa sobre la interacción proteína-proteína. Para preparar la proteína SBDS-FlAsH purificada, primero prepare un litro de medio líquido LB suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Y en él, el cultivo transformó bacterias a 37 grados centígrados hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcanzó de 0,5 a 0,7.

Inducir la expresión de la proteína SBDS-FlAsH añadiendo 0,5 milimolar de IPTG al cultivo y continuar la incubación durante cinco horas más. A continuación, recoja la suspensión bacteriana por centrifugación a 3800 veces G durante diez minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en 35 mililitros de manteca de lisis SBDS suplementada con un milimolar de PMSF. Lisis por sonicación durante un tiempo total de cuatro minutos utilizando ciclos de diez segundos encendidos y 30 segundos apagados a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar la muestra a 9.000 veces G durante 50 minutos a cuatro grados centígrados.

Guarde el sobrenadante y deseche la paleta para eliminar los desechos celulares. Después de equilibrar la columna de afinidad de níquel con tres volúmenes de columna de tampón de lisis SBDS, introduzca todo el sobrenadante clarificado en la columna. Elimine la proteína no unida lavándola con tres volúmenes de columna de tampón de lisis SBDS.

Después del lavado en columna, eluir la proteína unida con tres volúmenes de columna de tampón de elución SBDS. Para purificar aún más la proteína, equilibre la columna del intercambiador de cationes de sulfopropilo con tres volúmenes de columna de tampón de columna S con bajo contenido de sal. Diluir la proteína seis veces con tampón de fosfato 50 milimolares PH 6,5 e introducirla en la columna.

Lave el material no ligado con tres volúmenes de columna de tampón de columna S con bajo contenido de sal. A continuación, eluir la proteína en un solo paso añadiendo 50 milimolares de tampón de fosfato PH 6,5, un molar de cloruro de sodio en la columna. Diluir el eluido tres veces con tampón de fosfato 50 milimolares PH 6,5.

A continuación, concentrar la proteína con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3800 veces G durante quince minutos. La calidad de las proteínas utilizadas en este tipo de experimentos es muy potente. La interpretación de los datos se complica si las muestras de proteínas utilizadas no son de alta pureza.

Verifique la pureza de la proteína SBDS-FlAsH mediante análisis SDS-PAGE y tinción de Coomassie. Congele rápidamente la proteína en nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Para preparar la proteína EFL1 purificada, primero se transformó en cultivo levadura a 30 grados centígrados en un litro de medio sintético sin uracilo, suplementado con 0,5 por ciento de glucosa hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcanzó 1,8.

Inducir la expresión de proteínas añadiendo un 2,8 por ciento de galactosa al cultivo y continuar la incubación durante 18 horas a 30 grados centígrados. Recoja la suspensión de levadura por centrifugación a 3800 veces G durante diez minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante después de la centrifugación.

Vuelva a suspender las células en 50 mililitros de tampón de lisis EFL1 suplementado con un milimolar de PMSF y un milimolar de benzamidina. Interrumpa las celdas por fricción en un batidor de cuentas usando cuentas de vidrio durante un tiempo total de seis minutos usando ciclos de dos minutos encendidos y quince minutos apagados a cuatro grados Celsius. A continuación, centrifugar la muestra a 9.000 veces G durante 50 minutos a cuatro grados centígrados.

Mantenga el sobrenadante y deseche el paladar para eliminar los desechos celulares. A continuación, equilibre la columna de afinidad de níquel con tres volúmenes de columna de tampón de lisis EFL1. Introducir todo el sobrenadante clarificado sobre la columna equilibrada.

Después de eliminar la proteína no unida lavando la columna con tres volúmenes de columna de tampón de lisis EFL1, eluya la proteína unida con tres volúmenes de columna de tampón de elución EFL1. Para purificar aún más la proteína EFL1, equilibre la columna de exclusión de tamaño con volúmenes de 1,5 columnas de tampón de anisotropía. Concentrar la proteína EFL1 eludida de la columna de afinidad de níquel a un mililitro con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3800 veces G. Luego, introducir la muestra concentrada en la columna de exclusión de tamaño.

Recoja la proteína eludida y concéndala por ultrafiltración hasta una concentración final de aproximadamente 30 micromolares. Verifique la pureza de la proteína EFL1 mediante el análisis SDS-PAGE y la tinción de Coomassie. Congele rápidamente la proteína en nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior.

Mezcle tres nanomoles de la proteína SBDS-FlAsH con tres nanomoles del colorante verde lumio en un volumen de cinco micrómetros de tampón de anisotropía. Deje que la reacción continúe durante ocho horas a cuatro grados centígrados. Después de ocho horas, dialice la muestra contra el tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre.

Mida los absorbentes a 280 nanómetros y 508 nanómetros en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo. A continuación, utilice la ley de Lambert-Beer para cuantificar el porcentaje de proteína etiquetada como se describe en el protocolo de texto. Antes de medir el valor de anisotropía, cada paso de filtración de la legión de proteínas debe realizarse con cuidado, asegurándose de que toda la muestra se dispense en la solución y se vuelva homogénea.

En una cubeta de fluorescencia, coloque 200 microlitros de SBDS-FlAsH de 30 nanomolares en tampón de anisotropía y valore dos microlitros de EFL1 de 30 micromolares. Mezcle bien y deje reposar la reacción durante tres minutos antes de medir el valor de anisotropía y fluorescencia. Repita este proceso hasta que se haya agregado un volumen total de 40 microlitros de EFL1.

Como paso final, ajuste los datos a un modelo de presunto enlace como se describe en el protocolo de texto. Para realizar cualquier experimento de anisotropía es importante descartar grandes cambios en la intensidad de la fluorescencia. Como se muestra aquí, la fluorescencia de SBDS-FlAsH no cambia notablemente al unirse a EFL1.

La valoración de EFL1 en una cubeta de cuarzo que contiene SBDS-FlAsH da como resultado un aumento de la anisotropía inicial observada. Varias adiciones de EFL1 describen la curva de enlace correspondiente que se puede ajustar mediante una regresión de mínimos cuadrados no lineales a un modelo de enlace presunto. En este caso, un modelo de un sitio de unión no describe adecuadamente los datos experimentales.

En cambio, un modelo de dos sitios de unión no idénticos describe adecuadamente los datos experimentales. Una vez dominado, el experimento de unión a la anisotropía de fluorescencia se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener proteínas purificadas en grandes cantidades.

Paralelamente a este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como este con ensayo de complementación basado en fragmentos, o anisotropía de fluorescencia con diferentes dominios de la proteína estudiada para apoyar el modelo de unión adecuado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de unión seguido de anisotropía de fluorescencia.